本发明属于生物工程技术领域，涉及一种微藻异养培养方法，其中通过以铵盐作为基础氮源，以氨水作为pH调节剂和/或补充氮源而有效提高微藻生物量。
背景技术：
微藻因其富含蛋白质、脂类、多糖、维生素、抗氧化剂和其它功能性营养成分，在医药原料、保健食品及生物能源领域具有广泛的应用。目前，微藻培养技术多集中于光自养体系，该培养体系存在生产效率低、占地面积大、收获成本高等不足，严重制约了微藻产业的发展。通过人工大规模培养技术提高微藻生物量是微藻资源开发利用的关键。近年来，逐渐兴起了微藻异养高细胞密度培养技术，该技术可以克服光培养体系对光的依赖，具有生长速度更快、能实现纯种培养、细胞产率高、可大大降低下游后处理成本，更便于自动化控制等优势，已成为近年来微藻培养研究的热点。本领域需要一种高效的微藻异养高密度培养方法。
技术实现要素：
本发明提供了一种微藻例如栅藻的异养培养方法，所述方法特征在于使用铵盐作为基础氮源，以氨水作为pH调节剂和/或补充氮源。通过本发明的方法，可以有效地提高微藻例如栅藻的生物量。
附图说明
图1示出了六种不同实验条件下栅藻细胞生物量浓度随时间的变化情况。
发明详述
在微藻异养培养过程中，维持pH恒定对微藻的快速生长至关重要。尿素、硝态氮(如硝酸钠或硝酸钾)[5]和铵态氮(氯化铵或硫酸铵)[6-7]是微藻培养过程中最常用的几类氮源。微藻在利用铵态氮过程中随着氮被消耗而pH会下降，现有培养模式下常用氢氧化钠或氢氧化钾[8]来维持pH恒定。但是，这些碱在实现调控pH调节的同时会伴随盐的生成，因此，发酵过程中随着碱的添加，盐浓度也就不断增加，细胞生长将会受到抑制(高盐浓度具有细胞渗透性使生物细胞脱水凋亡)。另外，微藻在利用尿素或硝态氮过程中会造成培养体系pH过高，于是现有培养模式常采用稀盐酸[8]或硫酸[9]来调控pH。然而，酸的使用会严重腐蚀不锈钢罐体及管道，进而影响设备的使用寿命。现有微藻异养培养模式均存在一定缺陷，包括细胞的增殖速度低和对设备的腐蚀问题，因而本领域仍然需要一种更实用、更高效的微藻异养高密度培养方法。
本发明人在研究中令人惊奇地发现，在微藻异养培养中，通过使用以铵盐作为氮源的基础培养基，在培养过程中使用氨水调节下降的pH值使之达到理想范围，可以避免不利于微藻生长的盐的生成，同时还能够避免用尿素或硝态氮作为氮源时酸性pH调节剂对培养设备的腐蚀。
因此，在第一方面，本发明提供一种微藻异养培养方法，所述方法包括在初始培养中使用以铵盐作为氮源的基础培养基，且在培养过程中采用氨水调节pH值。在一些实施方案中，其中培养过程中使用以铵盐为氮源或不含氮源的补料培养基进行补料。
如本发明所用，“氨水”是指氨气的水溶液，由于氨气在水中的溶解度在不同温度下存在一定差别，因此氨水一般是指含氨10％-35％的水溶液。“基础培养基”指的是用于接种微藻并起始培养的培养基。在使用基础培养基进行初始培养一段时间后，通常需要加入补料培养基补偿消耗掉的培养基成分。补料培养基通常是基础培养基的浓缩物，不过各成分的比例可以变化。
适合微藻生长的pH值可以由本领域技术人员常规确定，这通常取决于所要培养的微藻物种。例如，对于栅藻如尖状栅藻，培养过程中将pH控制在大约6.0±0.2。
此外，氨水本身也作为一种氮源，其在调控pH的同时可以向异养培养体系中补充适当的氮，从而可降低补料培养基中铵盐的比例(即提高补料培养基中的碳氮比)。本发明令人惊奇地发现，在本发明的方法中，使补料培养基中的碳氮比高于基础培养基中的碳氮比，可以获得明显更优的细胞生长指数。不受任何理论限制，降低补料培养基中的铵盐比例(提高碳氮比)可以避免氨水在调控pH的同时使异养培养体系中的氮过剩，从而将整个培养过程中碳氮比维持在合适的范围内。
如本发明所用，“碳氮比”是指培养基中碳的总含量与氮的总含量的质量比。
在一些实施方案中，其中所述以铵盐为氮源的补料培养基的碳氮比大于所述基础培养基的碳氮比。
在本发明的方法的一些实施方案中，其中所述基础培养基的碳氮比为10:1至30:1。
在本发明的方法的一些实施方案中，其中所述以铵盐为氮源的补料培养基的碳氮比是所述基础培养基的碳氮比的5-40倍。在一些实施方案中，补料培养基中不含氮源。
在本发明的方法的一些实施方案中，其中所述铵盐选自氯化铵和硫酸铵。
在本发明的方法的一些实施方案中，其中所述基础培养基中的碳源浓度为大约5-40g/L，例如大约5g/L、大约10g/L、大约15g/L、大约20g/L、大约25g/L、大约30g/L、大约35g/L或大约40g/L。
此外，本发明人还令人惊奇地发现，与碳源浓度变化剧烈的脉冲式补料方式相比，在本发明的方法中，通过适时检测培养体系的碳源浓度并结合调节流加速度大小，将培养过程中培养体系的碳源浓度的变化幅度控制在较小的范围，可以避免脉冲式补料方式下碳源浓度短时间大幅波动对细胞生长的抑制作用，获得更理想的平均生物质生产率。
因此在本发明的方法的一些实施方案中，包括在培养过程中使培养体系中碳源浓度的变化幅度小于或等于大约5g/L。
在本发明中“碳源浓度的变化幅度小于或等于大约5g/L”指的是任意两次测量所得的碳源浓度之间的差值小于或等于大约5g/L。
在本发明的方法的一些实施方案中，所述培养过程的碳源浓度被控制在以下范围：大约0-5g/L、大约5-10g/L、大约10-15g/L、大约15-20g/L、大约20-25g/L、大约25-30g/L或大约35-40g/L。在一些具体实施方案中，所述培养过程的碳源浓度被控制在大约2-5g/L。
在本发明的方法的一些实施方案中，其中在培养过程中通过阶段式恒速流加方式向所述培养体系添加所述补料培养基。
在一些实施方案中，其中在培养过程中大约每0.5-3小时测量培养体系中的碳源浓度，并根据测得的碳源浓度调整补料速度，从而使培养体系碳源浓度的变化幅度小于或等于大约5g/L。
在一些实施方案中，所述补料速度为大约5g/小时-大约1000g/小时。本领域技术人员可以根据测得的碳源浓度以及培养体系的体积调节所述补料速度。例如，与培养体积相关的所述补料速度可选自大约0.5g/L/h-大约25g/L/h的范围。
在一些实施方案中，其中所述基础培养基和补料培养基中的碳源是葡萄糖。
在一些实施方案中，所述微藻选自小球藻(Chlorella)、眼虫藻(Euglena gracilis)、栅藻(Scenedesmus)、扁藻(Tetraselmisgracilis)、菱形藻(Nitzschia)、富油新绿藻(Neochloris oleoabundans)、微拟球藻(Nannochloropsis)、杜氏藻(Dunaliella)。
在一些实施方案中，所述微藻是尖状栅藻(Scenedesmus acuminatus)。
在一些实施方案中，所述微藻的初始接种量为大约5-20％(v/v)，例如大约5％(v/v)、大约10％(v/v)、大约15％(v/v)或大约20％(v/v)。
在一些实施方案中，所述微藻接种后的初始细胞干重为大约0.5g/L-大约5g/L。
在一些实施方案中，所述培养在大约25-40℃下进行。对于栅藻，例如尖状栅藻，优选所述培养在30℃±2℃下进行。
在一些实施方案中，所述培养在大约10-60％，例如10％、20％、30％、40％、50％或60％的溶氧浓度下进行。
在本发明中，“溶氧浓度”是指培养基中所溶解的氧的量相对于培养条件下培养基中氧的饱和溶解度的百分比。溶氧浓度控制方法是溶氧转速、氧气偶联。具体而言，溶氧转速、氧气偶联的控制方法是：当培养体系中的溶氧值低于设定值时通过自动增加搅拌转速，来提高通入气体中氧气在培养体系中的溶解，当转速增加至设定最大值而溶氧浓度仍低于设定值时，再通过增加通气(空气和氧气的混合气体)中氧气的比例，来增加溶氧；当培养体系中的溶氧浓度高于设定值时通过自动降低通气中氧气的比例，来降低溶氧；当氧气比例降至0，通100％空气时，溶氧浓度仍高于设定值时，再通过自动降低搅拌转速方式进一步降低溶氧浓度，直至降至设定值。
在一些实施方案中，所述培养在大约5-100000L的生物反应器中进行，所述培养体系的初始体积为大约2-40000L。
术语“培养体系”是指微藻异养培养过程中的任意时刻，容纳于异养培养容器中的物质总和。培养体系主要包含培养基和微藻细胞。
在一些实施方案中，所述方法中使用如表2和表3中所示的培养基。
在一个具体的方面，本发明提供一种异养培养栅藻，例如尖状栅藻的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将栅藻接种于固体活化培养基上，在光强30～50μmol m-2s-1，25℃±2℃下培养15-20天；
b)挑取步骤a)中获得的栅藻至液体一级种子培养基中，在30℃±2℃下以大约150-220rpm的转速培养120-144小时或培养至OD750＝8-12；
c)将步骤b)中获得的栅藻以大约5-20％(v/v)的接种量接种于液体二级种子培养基中，在30℃±2℃下以大约150-220rpm的转速培养72-84小时或培养至OD750＝16-20；
d)将步骤c)中获得的栅藻以大约5-20％(v/v)的接种量接种于液体三级种子培养基中，在30℃±2℃下以大约150-220rpm的转速培养72-84小时或培养至OD750＝20-22；
e)将步骤c)中获得的栅藻以大约5-20％(v/v)的接种量接种于发酵罐中的以铵盐例如氯化铵为氮源的异养基础培养基中，在30℃±2℃下以大约10-60％的溶氧浓度进行培养，其中所述异养基础培养基包含5-20g/L的初始葡萄糖浓度和10:1至30:1的碳氮比，所述发酵罐的搅拌速度设置为与溶氧浓度偶联控制；
f)在步骤e)培养期间通过加入氨水控制培养体系的pH为大约6.0±0.2，且通过阶段式恒速流加方式添加补料培养基，其中所述补料培养基的碳氮比是异养基础培养基的5-40倍，其中大约每0.5-3小时测量培养体系中的葡萄糖浓度并根据测得的葡萄糖浓度调整补料速度，从而使葡萄糖浓度的变化幅度小于或等于大约5g/L；和
g)任选地，收获所培养的栅藻。
在一些实施方案中，所述方法中使用的培养基如表1-3所示。
实施例
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
实验材料的准备
藻株：尖状栅藻(Scenedesmus acuminatus)(公开于[10-11])
栅藻培养过程中所用的各培养基组成和用量见下表1-3。
表1藻种制备培养基：
表2发酵罐基础和补料培养基组成
表3各培养基母液组成
整个栅藻培养过程包括如下5个步骤：
1)藻种活化
在无菌环境下，用接种环从已培养好的平板上挑取栅藻单菌落，于灭菌平板上(培养基组成见表1)进行划线，将划线后的平板置于恒温光照培养箱中进行培养，光强30～50μmol m-2s-1，培养温度25℃，培养15-20天直至形成明显的栅藻单菌落。
2)一级种子培养
从活化好的新鲜平板上，挑取一环栅藻(Φ2～3mm)于50mL三角瓶中(装液量为15mL)进行振荡培养，培养温度30℃，转速180rpm，培养120-144h(OD750＝8-12)。
3)二级种子培养
将培养好的一级种子液以10％(v/v)接种量接种于250mL二级摇瓶(装液量100mL)中进行振荡培养，培养温度30℃，转速180rpm，培养72～84h(OD750＝16-20)。
4)三级种子培养
将培养好的二级种子液以10％(v/v)接种量接种于1000mL三级摇瓶(装液量300mL)中进行振荡培养，培养温度30℃，转速180rpm，培养72-84h(OD750＝20-22)。
5)发酵罐培养
将培养好的三级摇瓶种子液以10％(v/v)接种量接种于7.5L发酵罐中，培养温度30℃，通风比为1：1(vvm)，搅拌速度和溶解氧偶联控制，溶解氧设定为40％，培养过程中用氨水控制pH于6.0。基础培养基采用铵盐作为氮源，碳源(葡萄糖)与氮源中的碳氮比为10:1-30:1，初始葡萄糖浓度为5g/L，分批培养过程中当培养过程中的葡萄糖浓度较初始浓度降低3-4g/L时，使用速度可调的蠕动泵流加补料液，补料培养基为基础培养基的浓缩液，但其中碳氮比为基础培养基碳氮比的5-40倍，适时监控测定葡萄糖浓度，根据葡萄糖浓度的变化适时调节补料速度，控制整个培养过程中的葡萄糖浓度在2-5g/L以内。当以获得最大细胞干重为目的时，连续两次取样点样品发酵干重不变或者开始下降时，发酵结束。
实验中的测量方法：
取样测量细胞浓度的方法：采用称重法，即将发酵样品稀释至合适浓度(OD750＝2-10)后，取一定体积(1-5mL)加入经80℃烘干过夜称重后的英国Whatman GF/C玻璃纤维滤膜上，经0.5M NaHCO3溶液冲洗抽滤后，80℃烘干过夜，计算细胞干重。
葡萄糖浓度的测量方法：将发酵样品经离心后，取上清液，将上清液经适当稀释后，采用安稳型血糖试纸条进行测定。
实施例1对照1(Control-1)
基础培养基和补料培养基均以铵盐(氯化铵)作为氮源，基础培养基和补料培养基中碳氮比保持不变。初始葡萄糖浓度为5g/L。采用阶段式恒速方式进行补料，整个培养过程中葡萄糖浓度控制在2-5g/L，培养过程中用3M NaOH调控pH恒定(6.0)。
实施例2对照2(Control-2)
基础培养基和补料培养基均以尿素作为氮源，基础培养基和补料培养基中碳氮比保持不变。初始葡萄糖浓度为5g/L。采用阶段式恒速方式进行补料，整个培养过程中葡萄糖浓度控制在2-5g/L，培养过程中用1M HCl调控pH恒定在6.0。
实施例3实验组1(Experiment-1)
基础培养基以氯化铵作为氮源，补料培养基中无氮源，培养过程中用氨水调控pH在6.0并作为补充氮源。初始葡萄糖浓度为5g/L。采用阶段式恒速方式进行补料，整个培养过程中葡萄糖浓度控制在2-5g/L。
实施例4实验组2(Experiment-2)
基础培养基和补料培养基以氯化铵作为氮源，补料培养基中碳氮比为基础培养基碳氮比的20倍。初始葡萄糖浓度为5g/L。采用阶段式恒速方式进行补料，整个培养过程中葡萄糖浓度控制在2-5g/L，采用氨水调控pH在6.0并作为补充氮源。
实施例5实验组3(Experiment-3)
基础培养基和补料培养基以氯化铵作为氮源，补料培养基中碳氮比为基础培养基碳氮比的的20倍。初始葡萄糖浓度为5g/L。采用脉冲式方式进行补料，整个培养过程中葡萄糖浓度控制在0-20g/L(即在葡萄糖浓度下降至0g/L后补料至20g/L)，采用氨水调控pH在6.0并作为补充氮源。
实施例6实验组4(Experiment-4)
基础培养基和补料培养基以氯化铵作为氮源，补料培养基和基础培养基中碳氮比均为12:1。初始葡萄糖浓度为5g/L。采用阶段式恒速方式进行补料，整个培养过程中葡萄糖浓度控制在2-5g/L，采用氨水调控pH在6.0并作为补充氮源。
以上所有实验的结果示于图1并总结于表4。从表4可以看出，实验组1-4的平均生物质生产率、最大生物量浓度(g/L)显著好于对照1，证明用氨水调节pH优于NaOH。
实验组3加料是脉冲式加料，所谓脉冲式加料，是指每次待培养罐中葡萄糖消耗殆尽时，一次性补充葡萄糖，使培养体系中葡萄糖瞬时达到20g/L，葡萄糖浓度变化波动极大；最后的平均生物质生产率、最大生物量浓度(g/L)，其结果低于实验组2的连续低波动补料方式(即连续流加且葡萄糖浓度是一个温和的变化过程)。可见连续流加补料并将葡萄糖浓度变化控制在小范围优于葡萄糖浓度剧烈变化的脉冲式补料。
实验组4中，补料培养基中的C:N＝12:1，表明不料培养基中含有较高的氮源，与实验组1和实验组2比较，由于补料培养液含氮量与基础培养基一样，未做减量，而氨水本身也带来氮源，过量的氮抑制微藻的异养生长，因而实验结果比实验组1和实验组2差。可见，优选补料培养基中的碳氮比高于基础培养基中的碳氮比。
对照2以尿素作为氮源，基础培养基和补料培养基中碳氮比都是12:1，对尿素的需求量很大，虽然营养成本高于实验组2，但是平均生物质生产率反而低于实验组2。此外，使用盐酸调节pH会对发酵设备造成腐蚀。
表4
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