相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年4月2日提交的美国临时申请序列号62/142,256的权益，其通过引用以其全部内容并入本文。
关于联邦政府赞助的研究或开发的声明
本发明是在由国立卫生研究所(nationalinstitutesofhealth,nih)和国立口腔与颅面研究所(nationalinstituteofdentalandcraniofacialresearch,nidcr)授予的批准号de015384和de017689和de022327，以及由国家科学基金会(nationalsciencefoundation,nsf)授予的批准号dmr-1206575，以及由国防部(departmentofdefense,dod)授予的批准号w81xwh-12-2-0008下的政府支持下作出的。政府在本发明中享有一定的权利。
背景
再生医学技术通常利用可起到三维(3d)模板作用的支架材料和/或可起到药物递送机制作用的药物载体。组织再生对于具有缺损或患病组织的患者可能是一种潜在的治疗方法。然而，由多于一种类型的组织组成的组织复合体(tissuecomplex)的再生给组织工程师带来了挑战。
附图简述
通过参考下面的详述和附图(其中相似的附图标记对应于相似(尽管可能不完全相同)的组件)，本公开的实例的特征将变得显而易见。为了简洁起见，具有先前描述的功能的附图标记或特征可以或可以不结合它们在其中出现的其它附图来描述。
图1a是脲基-嘧啶酮的四重氢键合以及脲基-嘧啶酮的解离和缔合的示意图；
图1b是改性水溶性聚合物及其剪切稀化和自恢复性质的实例的示意图；
图2例示用于形成葡聚糖-脲基-嘧啶酮(dex-upy)水凝胶的方法的实例中的合成步骤；
图3是描绘在二甲亚砜(dmso)-d6中，具有5.5的取代密度(ds)和10％(w/w)浓度的示例dex-upy水凝胶的1hnmr表征的图；
图4包括dex-upy水凝胶(ds5.5,10％w/w)的几个实例的黑白照片，包括单独的未染色和罗丹明染色的水凝胶(左上)和不同形式的自整合水凝胶，例如具有两半的圆柱体(右上和左下)、具有交替水凝胶的棒(底部中心)和核-壳结构(右下)(比例尺=5mm)；
图5a至5d是例示不同水凝胶的流变性质的图，其中图5a是浓度为12.5％和10％w/w的dex-upy水凝胶(ds5.5)的动态模量的频谱，图5b例示在渐增的应力下水凝胶(ds5.5,10％w/w)的动态模量，图5c例示在循环高应力(100pa)和低应力(0.1pa)下水凝胶(ds5.5,10％w/w)的动态模量作为时间(以秒计)的函数，图5d例示水凝胶(ds5.5,10％w/w)的动态模量随温度的变化；
图6是例示在37℃下在磷酸盐缓冲盐水(pbs)中，具有12.5％和10％w/w的浓度的dex-upy水凝胶(ds5.5)的体外降解的图；
图7是例示在37℃下在pbs中，具有10％w/w浓度的dex-upy水凝胶(ds5.5)体外释放多西环素(doxy)和牛血清白蛋白(bsa)的图；
图8a是包封软骨细胞和兔骨髓产生细胞(bmsc)的自整合水凝胶构建体的制备的示意图；
图8b是包封在水凝胶构建体中的细胞的黑白共焦图像，其中软骨细胞被染成绿色并且bmsc被染成红色；
图9a-9e例示细胞-凝胶构建体的皮下植入的结果，其中图9a是用茜素红染色的仅bmsc/bmp-2(骨形态生成蛋白)组的切片的黑白照片(正染色代表矿化的骨组织)，图9b是用爱茜蓝染色的仅软骨细胞组的切片的黑白照片(正染色代表软骨组织)，图9c是具有用茜素红和爱茜蓝两者染色的软骨细胞和bmsc/bmp-2两者的自整合组的切片的黑白(照片)，图9d是图9c的界面区域的放大的黑白图像，以及图9e是例示使用图像分析软件(adobephotoshop)定量骨和软骨体积的图；
图10是用聚乙烯醇和脲基-嘧啶酮形成的水凝胶的黑白照片；
图11是用壳聚糖和脲基-嘧啶酮形成的水凝胶的黑白照片；和
图12是用羟乙基纤维素和脲基-嘧啶酮形成的水凝胶的黑白照片。
详述
本文公开的是可用于多种应用的自整合水凝胶，所述应用包括组织工程化、药物递送、组织膨胀、粘合剂、化妆品、伤口敷料和外科敷料。单一组织或多组织复合体可以通过使用本文公开的水凝胶再生。在将适当的细胞和/或生物分子并入/包封在其中之后，该水凝胶可以在温和的条件下自整合。这使得在空间限定的区域中再生组织(在一些情况下，多种类型的组织)及还有组织的无缝整合成为可能。本文提供的一些实例例示类似天然组织整合的骨-软骨组织复合体的再生。然而，自整合水凝胶的应用不限于这些实例，并且自整合水凝胶具有工程化各种组织复合体的潜力。
本文公开的自整合水凝胶是能够经由协同和高度特异的物理相互作用自组装的超分子水凝胶。然而，本文公开的水凝胶不等同于小肽至更大的纳米结构的协同组装。相反，本文公开的超分子水凝胶由水溶性聚合物形成，所述水溶性聚合物包括重复单元和与重复单元共价连接的侧链。重复单元是生物相容性单体或共聚单体，并且侧链包括具有多个氢键的单元。沿着主链的多氢键单元为水溶性聚合物提供形成强而可逆的相互作用的能力。强而可逆的相互作用的短暂性为水溶性聚合物提供自愈能力、自整合能力或自恢复能力而无需任何外部刺激或干预。利用这种性质，可能携带相应类型的细胞和/或信号生物分子的单独的水凝胶块可以整合形成特定组织复合体的结构。
此外，生物相容性单体和多氢键单元侧链的组合为超分子水凝胶提供剪切稀化性质(即，粘度随着剪切应力的速率增加而降低)，如由在本文公开的流变学测量中的屈服行为所证实的。剪切稀化性质有助于超分子水凝胶为可注射的(例如，经由注射器)。由于水凝胶是可注射的，所以它们不需要预成形或手术植入。此外，可被注射的能力使得水凝胶适合于填充不规则的组织缺损，如牙体缺损、骨折伤口、磨损/患病的软骨以及各种软组织，如椎间盘、脊髓、脑等。
在同时具有剪切稀化性质和自整合性质的情况下，在注射前处于凝胶态的超分子水凝胶可被注射，并然后在注射后立即恢复至凝胶态。
如上所述，该水凝胶由水溶性聚合物形成，所述水溶性聚合物包括重复单元和与重复单元共价连接的侧链。通常，水溶性聚合物可以是改性葡聚糖、改性聚乙烯醇、改性壳聚糖、改性纤维素或用本文公开的侧基改性的一些其它水溶性聚合物。水溶性聚合物是多官能化聚合物，因为每个重复单元都连接有侧基。
重复单元具有至少一个官能团。该官能团可以是任何官能团，其能够与异氰酸酯或与另一与异氰酸酯连接的官能团反应，以便将侧基(其包括异氰酸酯)共价结合到其上。作为实例，重复单元的官能团包括氧原子、硫原子或氮原子。在改性的水溶性聚合物中，氧原子、硫原子或氮原子将侧链共价连接至重复单元。重复单元的实例包括葡萄糖单元、乙烯醇、d-葡糖胺、两个β(1→4)连接的d-葡萄糖单元或另一形成水溶性主链并包括用于共价连接侧链的合适的官能团的重复单元。
在本文公开的实例中，侧链包括脲基-嘧啶酮。在一些实例中，脲基-嘧啶酮通过异氰酸酯与重复单元的氧、硫或氮原子共价连接。在其它实例中，脲基-嘧啶酮通过另一官能团与重复单元的氧、硫或氮原子共价连接。在这些其它实例中，脲基-嘧啶酮与已经与另一官能团如羟基、胺基、巯基等反应的异氰酸酯连接。该反应产生侧链的端基，其能够与重复单元的氧、硫或氮原子共价连接。除了异氰酸酯之外，官能团如活化酯、环氧基团和酰氯基团也可用于连接脲基-嘧啶酮。
脲基-嘧啶酮是多氢键单元。更特别地，脲基-嘧啶酮是四重氢键阵列，其具有比单个氢键高得多的键合强度。图1a是脲基-嘧啶酮的多个氢键(图1a的最左边)及其动态相互作用(包括解离和缔合)的示意图。
相互作用的强度还可以影响水凝胶的侵蚀性质，因为此类水凝胶通过可逆相互作用的解离而侵蚀或降解。强的超分子相互作用与共价键表现类似，其不易受物理侵蚀影响。脲基-嘧啶酮多氢键相互作用为水凝胶提供适当的侵蚀性质，并从而提供生物分子释放特性。
本文公开的水凝胶可以经由温和的制造方法形成，该方法不利用毒性组分或非生理ph条件。温和的制造方法使用温和的溶剂如水、pbs等和在6至8范围内的生理ph条件。将含脲基-嘧啶酮的侧基通过与包括氧原子、硫原子或氮原子的官能团反应来接枝到水溶性聚合物的重复单元上。在该方法的一些实例中，首先将脲基-嘧啶酮与异氰酸酯连接，继而将该异氰酸酯接枝到包括氧、硫或氮原子的重复单元官能团上。
作为用于形成水凝胶的方法的一个实例，可首先通过将脲基-嘧啶酮与异氰酸酯连接来形成含脲基-嘧啶酮的侧基。可以将所选的水溶性聚合物溶解在溶剂中以形成溶液。可以将含脲基-嘧啶酮的侧基加入含催化剂的溶液中以形成混合物。然后可使混合物在预定温度(例如，约60℃至约150℃范围内)下反应预定时间(例如，约0.5小时至约20小时范围内)。可以将反应产物溶解在另一合适的溶剂中并在约60-90℃下搅拌约0.5-1小时以形成水凝胶。
在另一实例中，可以将所选的水溶性聚合物溶解在第一溶剂中以形成第一溶液。可以将含脲基-嘧啶酮的侧基溶解在第二溶剂(其与第一溶剂相同或不同)中以形成第二溶液。将至少一些第一溶液与至少一些第二溶液混合以形成混合物。第一溶液与第二溶液的比率可为10:1至1:1。然后可搅拌混合物并将其在预定温度(例如，约60℃至约150℃范围内)下固化预定时间(例如，约0.5小时至约20小时范围内)。在一些实例中，可以包括额外的处理，其中将溶剂换成水。
该方法的几个特定实例将在实施例部分中更详细地描述。
脲基-嘧啶酮的接枝密度可通过改变含脲基-嘧啶酮的侧基与水溶性聚合物的进料比来控制。控制接枝密度使得多官能化聚合物能够形成坚固的水凝胶。可以进行多官能化聚合物的1hnmr以确认结构，并且可以通过计算特征峰下的面积的比率来估计取代密度(ds，每100个重复单元的脲基-嘧啶酮单元数)。在一些实例中，当脲基-嘧啶酮的密度为8.1或更小时形成水凝胶。具有过高的脲基-嘧啶酮接枝密度的聚合物具有差的水溶性，并因此不适用于水凝胶制备。
具有合适的脲基-嘧啶酮接枝密度时，本文公开的水溶性聚合物可以形成水凝胶。水凝胶网络的形成是通过脲基-嘧啶酮(upy)氢键(见图1b中的凝胶)。可以将水凝胶装载到注射器中，并随后通过针进行注射。在注射期间，水凝胶在剪切应力下表现地像液体，并在注射后立即凝固(剪切稀化特性)。图1b中显示了这些特性的一个实例，其例示了当暴露于10pa到1kpa范围内的剪切应力时，脲基-嘧啶酮的解离和水凝胶的剪切稀化，并且例示了在除去剪切应力后脲基-嘧啶酮的缔合和水凝胶的自恢复。
水凝胶的不同形状可以通过将它们注射到不同形状的模具中来制造。
水凝胶可以被染色或可以是透明的。可以使用任何合适的染料，并且可以将其直接加入水凝胶中。
当将水凝胶用于药物/蛋白递送时，可将药物或蛋白包封在水凝胶中。这可以通过将药物或蛋白溶解在合适的溶剂中并且在凝固之前将溶解的药物或蛋白加入水凝胶溶液中来实现。含药物的溶液的量通常在总水凝胶体积的1/3以下。
也可以将细胞并入水凝胶中。在水凝胶完全固化之前，可将细胞(通常在合适的培养基中)加入水凝胶中并在其中混合。
为了进一步例示本公开，本文给出了实施例。应该理解，这些实施例是为了例示性目的而提供的，并且不应被解释为限制本公开的范围。在整个实施例部分中，脲基-嘧啶酮将被称为“upy”。
实施例
实施例1
葡聚糖-脲基-嘧啶酮(dex-upy)水凝胶的合成和制备
为了合成dex-upy聚合物水凝胶，通过异氰酸酯基团与葡萄糖单元的羟基的反应将脲基-嘧啶酮接枝到葡聚糖主链上。该反应如图2中所示。
首先，将2-氨基-4-羟基-6-甲基嘧啶(11.2g，sigma)加入100ml1,6-己二异氰酸酯(sigma)中并加热至100℃(在i处显示)，持续18小时(图2中的反应1)。然后，将1000ml戊烷(sigma)倒入反应溶液中并用磁棒搅拌以洗涤未反应的己二异氰酸酯。将产物过滤并用戊烷再洗涤5次。将收集的白色粉末(upy-异氰酸酯)在真空下干燥过夜。为了合成upy接枝的葡聚糖，在氮气气氛下，伴随磁力搅拌将葡聚糖(2g，mw70,000)溶解在70ml无水二甲亚砜(dmso，sigma)中，接着加入upy-异氰酸酯(0.4g)和二月桂酸二丁基锡(dbtdl，0.586ml，sigma)(图2中的ii)。反应在120℃下进行16至18小时(图2中的ⅱ)。将所得溶液倒入异丙醇(700ml，fisherscientific)中沉淀3次。将粉末在真空下干燥过夜，并重新溶解在水中。将水溶液在制冷器中冷冻并冻干3天。
为了制造水凝胶，在磁力搅拌下将约100mg的dex-upy聚合物在约70℃下在900μl无菌pbs(ph7.4)中溶解1小时。之后，将溶液装载入注射器中并注射到聚二甲基硅氧烷(pdms)模具中。为了测量流变性质，将水凝胶放置在4℃的冰箱中过夜以允许完全凝胶化。
upy的接枝密度可以通过改变upy与葡聚糖的进料比来控制。进行1hnmr以确认dex-upy的结构(图3)。通过计算特征峰下的面积的比率来估计取代密度(ds，每100个葡萄糖单元的upy单元数)。在该实施例中，使用varianmr400(钴)光谱仪进行1hnmr表征。使用cdcl3作为upy-异氰酸酯的溶剂以及dmso-d6作为dex-upy的溶剂。当upy的密度足够高时，多官能化聚合物(dex-upy)可以形成坚固的水凝胶。例如，dex-upy-2(ds5.5，10％w/w)可在升高的温度(约70℃)下溶解在水中并在冷却至室温后形成稳定的水凝胶，而纯葡聚糖和具有非常低的接枝密度的dex-upy(dex-upy-1，ds2.8)在相同条件下形成澄清溶液。具有太高的upy接枝密度(ds≥8.1)的聚合物具有差的水溶性，并因此不能用于水凝胶制备。具有合适的upy接枝密度时，dex-upy聚合物形成水凝胶、将其装载入注射器中并随后通过26g针注射。在注射过程中，水凝胶在剪切应力下表现地像液体，并在注射后立即凝固，这是其剪切稀化特性的证据。
为了例示自整合能力，用刀片将水凝胶圆盘切割成不同的部分，并随后手动放在一起(例如，图4中的左上图)。其中一块水凝胶用罗丹明染色(10'，参见图4)，并使另一块水凝胶保留其原始颜色(10，参见图4)，以显示这些水凝胶块之间的界面。发现当使新鲜表面彼此接触时，水凝胶10、10'在几分钟内整合。如图4中所例示，可以实现不同的型式，诸如具有两半的圆柱体12(其中每一半是水凝胶10、10'之一)、接合圆盘的棒14(其中每个圆盘是水凝胶10、10'之一)和由核(由水凝胶10'形成)和壳(由水凝胶10形成)构成的整合圆柱体16。图4中的照片是在水凝胶10、10'彼此重新接合后2分钟拍摄的。
dex-upy水凝胶的剪切稀化和恢复的流变学测量
为了量化与剪切稀化和随后的恢复相关的机械性能，使用ar2000流变仪(tainstruments,us)测量水凝胶的流变性质。所有测试均使用直径40mm的平行板。板之间的间隙距离为0.4mm。施加0.1pa的恒定应力用于频谱测量(图5a，下文讨论)。对于频谱以外的测量，使用恒定的1弧度/秒的角速度。在剪切稀化(图5b)和自恢复(图5c)实验中使用的高应力和低应力分别是100pa和0.1pa。在高应力和低应力的3次循环之后验证模量的自恢复。对于温度稳定性测试(图5d，下文讨论)，加热过程期间的模量是以2℃/min的加温速率从室温(约18℃至约22℃)至约70℃测量的。
图5a至5d是例示水凝胶的流变性质的图。在图5a中，示出浓度为12.5％和10％w/w的dex-upy(ds5.5)水凝胶的动态模量(储能模量g’、损耗模量g”)的频谱，其中施加0.1pa的恒定应力。由10％(w/w)dex-upy(ds5.5)聚合物溶液制得的水凝胶具有170pa的储能模量，而由浓度为12.5％(w/w)的相同聚合物制得的水凝胶具有700pa的储能模量。这些结果例示聚合物浓度与聚合物的机械性能之间的非线性关系。
在图5b中，描绘了在渐增的应力下10％(w/w)水凝胶(ds5.5)的动态模量。对于该实施例，将剪切力施加到水凝胶上，模拟从静态储存的凝胶到从注射器机械注射凝胶的变化。水凝胶在临界剪切应力水平下屈服并失去其机械完整性，其对应于通过针注射的水凝胶的状态。在临界剪切应力水平下，储能模量(g’)降至损耗模量(g”)以下。该现象是剪切稀化性质的证明。
此外，对水凝胶施加循环高应力和低应力(分别为σh和σl)。图5c描绘了在循环高应力(100pa)和低应力(0.1pa)下的10％(w/w)水凝胶(ds5.5)的动态模量。在低应力下，dex-upy表现地像凝胶。更特别地，在低应力水平下，凝胶保持稳定，且g’高于g”。在高应力水平下，凝胶变成类液体状态(溶胶)，其中g’低于g”。在除去高应力后，凝胶态立即(数秒内)恢复。水凝胶可以持续多个循环被剪切稀化和恢复，而没有显著损失机械性能。
通过测量流变性质相对于温度的变化来验证10％(w/w)水凝胶(ds5.5)在加热时的稳定性。图5d描绘了10％(w/w)水凝胶(ds5.5)的动态模量随温度的变化。在从室温以2℃/min的速率加热时，水凝胶软化(即，加热时模量减小)，但其即使在70℃下也保持凝胶态。
dex-upy水凝胶的体外降解/侵蚀
dex-upy水凝胶主要通过物理侵蚀过程降解，在此过程中亲水性聚合物凝胶解离并扩散至水性环境。为了测试降解/侵蚀，将由10％(w/w)dex-upy(ds5.5)聚合物溶液和12.5％(w/w)dex-upy(ds5.5)聚合物溶液制得的水凝胶装载入注射器中并在4℃的冰箱中储存过夜。然后将水凝胶注射到1.5mleppendorf管中。对于管中的每100mg水凝胶，加入1mlpbs(ph7.4)。将管在37℃的培养箱中在振荡速度为100rpm的振荡器上培养。在每个预定的时间点，收集3个样品并冷冻干燥。在天平上测量干重，精确至0.1mg。计算干重减轻以量化侵蚀。结果如图6中所示。
图6中的数据显示浓度为10％且upy含量为5.5％(即10％(w/w)dex-upy(ds5.5))的水凝胶在4周内损失了57％的质量，而浓度为12.5％且upy含量相同(即，12％(w/w)dex-upy(ds5.5))的水凝胶在相同时间段内降解更慢，并且损失了47％的质量。这些水凝胶的降解特性可能适合于工程化许多组织类型，其中对于临时模板的需求通常是数周至数月。
dex-upy水凝胶的体外药物释放
可以将药物或蛋白包封在水凝胶中并使其经时(例如，在数天到数月的持续时间内)释放，这取决于药物或蛋白的尺寸和特性。为了测试药物释放，将dex-upy粉末溶解在pbs中以制备浓度为11％(w/w)的水凝胶。将多西环素(doxy，为小分子模型药物)和牛血清白蛋白(bsa，为模型蛋白)预先溶解在pbs中，并分别加入dex-upy溶液样品中，之后它们凝固。水凝胶的最终浓度为10％，其中药物浓度或蛋白浓度为总重量的0.5％。将水凝胶装载入相应的注射器中。将60μg水凝胶注射到1.5mleppendorf管的底部。在那之后，将1mlpbs加入管中。在每个时间点取样500μl的溶液，并加入500μl新鲜pbs。
释放结果显示在图7中。释放的doxy的浓度通过使用紫外分光光度计(hitachi，u-2910)定量273nm处的uv吸光度来测量。使用预先建立的标准浓度强度曲线测定浓度。如所例示，在第一周期间，doxy在体外几乎完全释放。使用microbcatm蛋白测定试剂盒(thermoscientific)按照标准程序测定释放的bsa的浓度。bsa释放了一个多月，且没有明显的突释。大约10％的bsa在第一天内被释放。在4周的整个实验持续时间内，bsa实现近乎线性的释放。对于组织工程化应用来说，蛋白/生长因子的这种缓释特性是高度期望的。
细胞包封以及与dex-upy水凝胶的生物相容性
将不同类型的细胞(包括软骨细胞和骨髓干细胞)包封在dex-upy水凝胶中并在其中培养。
在无菌条件下从四周龄新西兰白兔(harlanspraguedawley，michigan，usa)的股骨头和膝盖(髁和髌骨沟)获得关节软骨，剥离任何附着结缔组织，并切碎成小块。用0.2％ii型胶原酶消化16小时后，收集原代软骨细胞并传代2次。将软骨细胞在含有20％(v/v)胎牛血清(fbs)的高葡萄糖dmem(gibco)培养基中培养。经由使用18号(18-gauge)注射针从股骨髓抽吸收集兔骨髓产生细胞(bmsc)，将10ml骨髓收集到1000u的肝素中。通过细胞筛网过滤骨髓以排除脂肪组织和血块，并以600rpm离心30分钟。收集兔bmsc并在75-cm2烧瓶中在含有10％胎牛血清(gibco)的低葡萄糖α-mem(gibco)中培养。
在溶解于水中之前，将dex-upy粉末通过在121℃下高压灭菌来灭菌25分钟。如前所述，在pbs中制备水凝胶(11％(w/w))。将水凝胶溶液冷却至室温后，加入在培养基中的软骨细胞或bmsc并混合，同时搅拌，将水凝胶的最终浓度稀释至10％(v/v)。细胞密度为1百万个/ml。为了使细胞更好地可视化，按照标准程序分别用er-trackertmgreen(bodipy®flglibenclamide，invitrogen)和mitotracker®redcmxros(invitrogen)标记软骨细胞和bmsc。
将细胞-水凝胶混合物装载入注射器中并注射到12孔培养板中，接着添加dmem培养基(gibco)。每周更换两次培养基。
拍摄共焦图像(未示出)，并且图像显示两种类型的细胞均匀分布。活-死测定(结果也未显示)确认软骨细胞和bmsc两者在培养两周后检查的水凝胶中保持高生存力，表明dex-upy水凝胶与哺乳动物细胞高度生物可相容。
自整合的细胞-dex-upy水凝胶构建体的制备
制备用于骨-软骨-复合组织工程的自整合支架。如前一部分中所述，除了最终细胞密度为1千万个/ml之外，将软骨细胞(用于软骨形成)和bmsc加上骨形态生成蛋白2(bmp-2，用于骨再生)分别包封在水凝胶的两个部分中。含软骨细胞的水凝胶在图8a中标记为22，而将含bmsc加上bmp-2的水凝胶在图8a中标记为24。为了使细胞更好地可视化，将软骨细胞和bmsc分别用er-trackertmgreen(bodipy®flglibenclamide，invitrogen)和mitotracker®redcmxros(invitrogen)标记。然后，将含细胞的水凝胶注射到由在中间的阻隔膜(在图8a中标记为18，由聚四氟乙烯，即teflon®形成)分隔的圆盘形pdms模具(在图8a中标记为20，内径为4mm，外径为7mm，且厚度为2mm)的两侧中。随后去除膜18以使含软骨细胞的水凝胶和含bmsc的水凝胶整合。为了确保足够的完全凝胶化时间，将培养板放入培养箱中60分钟，然后添加培养基。在dmem培养基(gibco)中培养2天后，在共焦显微镜(olympusfluoview500)下观察整合的水凝胶。在移除阻隔膜之后两组分立即自整合。
图8a示意性地例示了pdms模具20，将含细胞的水凝胶22、24注射到pdms模具20的阻隔膜18分隔的各侧中、将阻隔膜18去除以及使两块水凝胶22、24整合成整合细胞-凝胶构建体26。图8b的黑白共焦图像显示了整合细胞-凝胶构建体26中含软骨细胞的水凝胶24和含bmsc加上bmp-2的水凝胶22之间的清晰界面，模拟了关节中紧密的骨-软骨界面。整合装载两种细胞的凝胶来构建骨-软骨复合体不需要外部干预。
自整合水凝胶构建体在小鼠中的皮下植入
所有动物程序都是在密歇根大学的机构动物护理和使用委员会的指导准则下进行的。在平衡氧中用2.5％异氟烷麻醉裸小鼠(6-8周龄，nu/nu，charlesriverlaboratoriesusa)。使用与如上所述相同的方法制造三组细胞-凝胶构建体(仅软骨细胞、仅bmsc/bmp-2以及在两侧具有两种细胞类型的自整合水凝胶)。在所有构建体中，软骨细胞和bmsc的细胞密度均为1千万个/ml。bmp-2的浓度为50μg/ml。
将细胞-凝胶构建体皮下植入小鼠中，以使用本文公开的自整合水凝胶评估工程化骨软骨复合体的潜力。将各自的细胞-凝胶构建体植入皮下袋中，并且每只小鼠接受四个植入物。将植入物随机排列在裸小鼠中，每组四个样本。八周后收集构建体并除去纤维囊。
样品用于组织学检查。更具体地说，收集植入的样本并在4℃下的10％缓冲福尔马林中固定8小时。然后将固定的组织浸入tissue-tektmcryo-oct化合物(sakurafinetekusa，inc.)中，并随后在-80℃下储存过夜。将样本以10μm厚度进行冷冻切片，并使用爱茜蓝和/或茜素红染色。在组织切片中矿化组织(茜素红，用于骨)和硫酸化糖胺聚糖(爱茜蓝，用于软骨)的正染色分别验证单细胞组内的软骨和骨的形成(以图9a和图9b中的黑色和白色示出)。结果证明了本文公开的水凝胶支持骨和软骨组织两者生长的能力。
使用爱茜蓝和茜素红两者对自整合骨软骨植入物进行染色(以黑白的图9c示出)。骨和软骨组织两者在其空间限定的区域内被识别。bmsc/bmp-2侧(图9c中的左侧)显示骨的正染色，而软骨细胞侧(图9c中的右侧)仅显示软骨的正染色。如放大图像中所示，再生的骨和软骨组织紧密整合(以黑白的图9d示出)。这种无缝的骨和软骨整合在关节功能中是合意的。
使用来自4个不同样品的10个切片来量化骨和软骨组织的体积。结果如图9e中所示。结果显示，与骨(≈30％)相比，软骨占据更大的体积(≈70％)。以下讨论两种类型组织之间的再生组织体积的差异。
图9c-9e中的结果确认在植入8周后形成类似于天然组织的骨-软骨组织复合体，并且还实现了两种类型的组织之间的无缝整合。因此，本文公开的水凝胶代表了一类新型的支架材料，并且具有用于工程化各种组织复合体的巨大潜力。
实施例2
透明葡聚糖-脲基-嘧啶酮(dex-upy)水凝胶的合成和制备
当期望水凝胶为浅黄色时，可以使用胺化。在实施例中，葡聚糖的胺化将包括首先将葡聚糖(10mmol糖单元，mw70,000)溶解在50ml无水二甲亚砜(dmso)中，然后加入1,1'-羰基二咪唑(7.5mmol)。该反应可以在氮气气氛下在室温下进行约4小时。然后将1,6-己二胺(20mmol)加入溶液中，并且然后将溶液在室温下搅拌过夜。随后通过相对去离子水的透析(mw截留值=6000-8000da)纯化反应产物。冻干2天后获得纯化的胺化葡聚糖。
然而，可以制备透明的dex-upy水凝胶，而不必首先进行葡聚糖的胺化。
为了形成透明的dex-upy水凝胶，首先进行甲基异胞嘧啶的羰基二咪唑(cdi)活化。这包括使2-氨基-4-羟基-6-甲基嘧啶(8mmol)和cdi(10.4mmol)悬浮于40mldmso中，将悬浮液加热至80℃，并将悬浮液在该温度下保持1小时。将反应混合物冷却至室温，并加入200ml丙酮。过滤沉淀物并在真空下干燥过夜。
将葡聚糖(0.5g)溶解在15mldmso中，同时在温和加热下将cdi活化的甲基异胞嘧啶(0.06g)溶解在dmf中。然后在搅拌下将dmf的溶液加入dmso中。反应在室温下进行20小时。随后将反应产物通过相对去离子水透析2天来纯化并冻干3天。
虽然未显示结果，但是两单独的透明水凝胶能够自整合。
实施例3
聚乙烯醇-脲基-嘧啶酮(pva-upy)水凝胶的合成和制备
首先将pva(1g)溶解在10ml的重量浓度为10％的无水二甲亚砜(dmso)中。为了加速溶解，使用适度加热或超声处理。将0.4gupy-异氰酸酯单独溶解在10mldmso中。将这两种溶液按预定比率混合，然后加入一滴dbtdl作为催化剂。进料比(pva:upy)以重量计为2:0.4，且pva浓度为4.8％。搅拌混合溶液，并然后使其在100℃下固化3小时。将凝胶浸入去离子水中24小时，以用水代替dmso并将未反应的分子洗去。图10是制备的pva-upy水凝胶的实例的照片。
实施例4
壳聚糖-脲基-嘧啶酮(chi-upy)水凝胶的合成和制备
通过将100mg壳聚糖溶解在1.9ml水/乳酸(20:1)溶液中来制备5％壳聚糖溶液。将upy-异氰酸酯单独溶解在dmso中。为了制造凝胶，将400μl壳聚糖溶液用1.6mlupy-异氰酸酯溶液稀释，重量比为2:0.8。将一滴dbtdl添加到混合溶液中。在充分搅拌后，将溶液在100℃下固化1小时。将凝胶用去离子水进行溶剂交换24小时。图11是制备的chi-upy水凝胶的实例的照片。
实施例5
羟乙基纤维素-脲基-嘧啶酮(hec-upy)水凝胶的合成和制备
为了合成upy接枝的hec，将1ghec(典型地mv=90000，aldrich)在氮气气氛下伴随磁力搅拌溶解在100ml无水dmso中，然后添加upy-异氰酸酯(0.2g)和三滴dbtdl。使反应在120℃下进行16小时。将所得溶液用丙酮(1000ml，fisherscientific)沉淀。将粉末在真空下干燥并重新溶解在水中。将水溶液在制冷器中冷冻并冻干3天。
为了制造水凝胶，在约70℃下伴随磁力搅拌将50mghec-upy聚合物溶解在pbs(950μl)中。将溶液放入4℃制冷器中过夜。所形成的水凝胶显示在图12中。
本文公开的水凝胶的实例是可注射和自整合的。当使水凝胶块彼此接触时，在几分钟内发生自整合。这不同于在链末端用脲基-嘧啶酮官能化的聚乙二醇(peg)聚合物中观察到的自整合，因为该整合由于涉及缓慢的动力学而可能花费数小时至数天。相反，本文公开的改性水溶性聚合物含有沿着聚合物主链连接的大量多氢键单元(upy)。如实施例中所证实的，稳定的水凝胶可以由upy相互作用形成，而不依赖于额外的疏水性相互作用或如peg-upy水凝胶中的脲片段。因此，在短得多的时间段(例如，几分钟)内发生凝胶化和再粘着(自整合)。
此外，本文公开的dex-upy水凝胶基本上比疏水改性的peg水凝胶更稳定，如其侵蚀(“降解”)曲线所指示的。已显示peg水凝胶在24小时内完全侵蚀并体外释放负载(cargo)，而实施例1中测试的dex-upy水凝胶持续超过一个月保持完整性。此外，dex-upy水凝胶显示能够近似线性地持续超过一个月释放蛋白类药物，这将极大地提高药物的治疗功效。
本文公开的示例性水凝胶(其组合生物相容性聚合物和多个upy单元)是可注射的，并且可以在不使用任何外部刺激的情况下快速自整合，从而防止对包封的细胞或生物分子的潜在伤害。这些性质对组织工程化应用特别有益。
本文公开的水凝胶的自整合特性还使得水凝胶能够用于工程化多组织复合体。复合组织的再生是非常具有挑战性的，因为它需要在空间限定的区域中整合不同的细胞/生物分子的支架。一个实例是骨软骨缺损，其中紧密结合的骨和软骨需要同时形成并无缝整合。实施例1中例示的体内结果验证了自整合水凝胶在这种情况下的效用。在这些结果中，骨和软骨组织分布在自整合构建体的相对侧，其中初始分别包封bmsc/bmp-2和软骨细胞。组织学结果确认了两种不同组织的良好整合，且它们类似于天然组织的组织结构(histoarchitecture)。此外，基于组织学切片的定量分析，发现软骨比骨占据更大的体积。大量研究已显示，bmsc与软骨细胞共培养，无论是混合状态还是紧密接触，都将诱导bmsc向软骨细胞分化。据信软骨细胞是由bmsc在界面区域处诱导的并因此导致跨原始边界形成软骨，导致比骨形成更多的软骨以及这两种类型组织之间的无缝整合。为了产生等量的骨和软骨，可以使用初始体积较小的含软骨细胞的水凝胶。
总的来说，本文公开的水凝胶是生物可相容的、生物可降解的并且能够持续性释放生物分子。
整个说明书中对“一个实例”、“另一实例”、“实例”等的引用意味着结合实例描述的特定要素(例如特征、结构和/或特性)被包括在本文描述的至少一个实例中，并且可以存在或可以不存在于其它实例中。另外，应理解，除非上下文另外明确指示，否则对于任何实例所描述的要素可以任何合适的方式在各种实例中组合。
应理解，本文提供的范围包括所述范围和所述范围内的任何值或子范围。例如，从室温(约18℃至约22℃)至约70℃的范围应理解为不仅包括约室温(约18℃至约22℃)至约70℃的明确叙述的界限，而且包括个别值如25℃、34.5℃、68℃等，以及子范围如约30℃至约65℃、约19℃至约59℃等。此外，当利用“约”来描述一个数值时，这意味着包含所述数值的微小变化(至多+/-10％)。
在描述和要求保护本文公开的实例时，除非上下文另外明确指示，否则单数形式“一(a,an)”和“所述(the)”包括复数指示物。
尽管已经详细描述了几个实施例，但是应理解，可以对所公开的实施例进行修改。因此，前面的描述被认为是非限制性的。