抑制多药耐受微生物生长的组合物和方法与流程

背景

本申请要求2015年7月22日提交的美国临时专利申请系列第62/195,335号的优先权。以上提及的申请如同整体重新叙述地通过引用并入本文。

对于患有囊性纤维化(cf)的患者中的新洋葱伯克霍尔德菌(burkholderiacenocepacia)(b.cenocepacia或bc)感染不存在已知的有效治疗，原因在于该细菌的广泛的多药耐受性(抗生素耐受性)和患有cf的患者的免疫细胞杀伤该细菌的能力减少。我们已经证明患有cf的患者中有缺陷的细菌杀伤部分地是由免疫效应细胞(诸如巨噬细胞)中的自噬不足引起的。新洋葱伯克霍尔德菌是患有cf的患者中最有问题且可怕的致病性生物体，引起cepacia综合征、脓毒症和细菌在感染的患者中的迅速传播。

当前，部分地由于新洋葱伯克霍尔德菌对多种抗生素的耐受性，对于患有cf的患者中的该细菌感染的治疗无可用的有效治疗。由于感染的患者的差的存活，cf中的新洋葱伯克霍尔德菌感染是维持生命的肺移植的禁忌症。免疫受损的患者(例如，慢性肉芽肿疾病、icu患者)也易受新洋葱伯克霍尔德菌感染。最近在非cf人群中爆发的伯克霍尔德菌属(burkholderia)是非常致病性强的。总体而言，四分之一患有伯克霍尔德菌属感染的患者死亡，并且在icu环境中三分之一感染伯克霍尔德菌属的患者死亡。hanulik等,anoutbreakofburkholderiamultivoransbeyondcysticfibrosispatients.jhospinfect.2013jul；84(3):248-51.pmid:23706672。

由于获得性抗生素耐受性(例如，医院获得性感染)，对于铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)的可用治疗是有限的。铜绿假单胞菌感染在患有cf的患者中是常见的，并且可以引起伴随长期的发病率和死亡率的慢性、持续感染。另外，随着时间的推移，铜绿假单胞菌多药耐受性随着持续的抗生素暴露而发展，因为意图清除慢性铜绿假单胞菌感染的抗生素治疗有助于抗生素耐受性的发展。

铜绿假单胞菌感染可以通过多种抗生素治疗，包括氨基糖苷类、氟喹诺酮类和新世代(advancedgeneration)头孢菌素类，但用这些抗生素药物的治疗已经导致细菌进一步且广泛的药物耐受性。

先前，塞来考昔(celecoxib)来源的化学剂ar-12(a.k.a.osu-03012)，其是ar-13的类似物，针对巨噬细胞中的细胞内细菌鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium)和土拉弗朗西斯菌(francisellatularensis)表现出抗细菌活性。ar-12是一种口服生物可利用的小分子，在多种细菌病原体(包括，例如，沙门氏菌属(salmonella)和弗朗西斯氏菌属(francisella))中具有实质上的抗细菌活性。

ar-12是在俄亥俄州立大学(theohiostateuniversity)发现的塞来考昔衍生物。该化合物最初是在肿瘤学环境中开发的，并且阶段i研究显示具有长达33周的长期口服暴露的可接受的安全性谱(safetyprofile)。ar-12肿瘤学剂量最可能实质上超过传染病环境中所需要的暴露量。ar-12先前已经被证明表现出抗肿瘤和抗细菌活性。认为ar-12诱导携带细胞内细菌的细胞的自噬。支持性临床前研究表明，ar-12具有快速的血脑屏障渗透和在组织中的明显积累，超过血液水平浓度数倍。boothl,robertsjl,tavallaim,nourbakhsha,chuckalovcakj,carterj,poklepovica,dentp.osu-03012andviagratreatmentinhibitstheactivityofmultiplechaperoneproteinsanddisruptstheblood-brainbarrier:implicationsforanti-cancertherapies.jcellphysiol.2015aug；230(8):1982-98.doi:10.1002/jcp.24977.pubmedpmid:25736380。

ar-13，一种ar-12类似物，也被证明具有抗细菌活性。参见例如，美国专利申请公布2013/0289004。

概述

本文描述的方面提供了用于降低宿主中细菌载量的组合物和方法。在另一个方面，微生物是多药耐受细菌。在一个方面，多药耐受细菌选自由以下组成的组：新洋葱伯克霍尔德菌和铜绿假单胞菌。在另一个方面，组合物包含ar-13和广谱抗生素。例如，ar-13和广谱抗生素的组合以协同方式降低微生物的载量。

如本文描述的，与单独的ar-13或抗生素的相比，ar-13和抗生素的组合以协同方式减少感染的巨噬细胞和嗜中性粒细胞中的细菌的载量。施用ar-13和广谱抗生素的组合是用于控制患有cf的患者中对标准抗生素耐受的细菌感染的治疗策略。

一个方面提供了组合物，所述组合物用于抑制细菌生长，所述组合物包含ar-13和抗生素。在另一个方面，抗生素选自由以下组成的组：头孢菌素类、喹诺酮类、氨基糖苷类、和碳青霉烯类。又在另一个方面，抗生素选自由以下组成的组：头孢他啶(ceftazidime)、环丙沙星(ciprofloxacin)、庆大霉素、和美罗培南(meropenem)。

在另一个方面，组合物还包含药物载体。

又在另外的方面，ar-13以达到至少约2.5μm的血液或组织浓度的量提供。

在另一个方面，抗生素以达到至少约5μg/ml的峰值血液或组织浓度的量提供。

在另一个方面，组合物还包含至少第二抗生素(例如，头孢菌素类、喹诺酮类、氨基糖苷类、碳青霉烯类)。

另外的方面提供了降低宿主中微生物的载量的方法，所述方法通过将ar-13和抗生素施用至所述宿主中，其中所述微生物的载量被降低约1000倍。

在另一个方面，微生物选自由以下组成的组：铜绿假单胞菌和新洋葱伯克霍尔德菌。

又在另一个方面，ar-13以足以达到至少约2.5μm的血液或组织浓度的量施用至宿主。

在另外的方面，广谱抗生素以足以达到至少约5μg/ml的峰值血液或组织浓度的量施用至宿主。

另一个方面提供了降低宿主中感染人类嗜中性粒细胞的铜绿假单胞菌的载量的方法，所述方法包括将ar-13和抗生素施用至所述宿主中，其中细菌在人类嗜中性粒细胞中的载量被降低约4倍。

又另一个方面提供了降低宿主中感染来自患有cf的患者的人类巨噬细胞的新洋葱伯克霍尔德菌的载量的方法，所述方法通过将ar-13和抗生素施用至所述宿主中，其中细菌在巨噬细胞中的载量被降低约1000倍。

附图简述

当结合附图时，本公开内容的特征和性质将依据下文陈述的详细描述变得更明显。

图1a示出了对于单独的及如指示处理的新洋葱伯克霍尔德菌在24小时时间段内的细菌的示例性光吸收密度(opticalabsorbancedensity)；

图1b是图1a中示出的实验结果的终点分析；

图1c是单独的及如指示用如ar-13和ar-13加抗生素处理的新洋葱伯克霍尔德菌的在24小时的细菌密度的终点分析；

图1d示出了用单独的抗生素或如指示用抗生素加ar-13处理的cf临床mrsa分离株的示例性24小时细菌杀伤测定；

图1e是图1d中示出的实验结果的24小时终点分析；

图1f示出了响应于ar-13的剂量滴定的mrsa的细菌密度的示例性终点分析；

图1g示出了用单独的抗生素或如指示抗生素加ar-13处理的cf临床铜绿假单胞菌分离株的示例性细菌杀伤测定的结果；

图1h是图1g中示出的实验结果的24小时终点分析；

图2a示出了感染新洋葱伯克霍尔德菌并且用或不用ar-13处理的人类cf和非cf单核细胞来源的巨噬细胞(mdm)的示例性24小时cfu测定；

图2b示出了感染新洋葱伯克霍尔德菌并且用单独的抗生素或用ar-13处理的人类cfmdm的示例性24小时cfu测定；

图2c示出了感染mrsa并且用及不用ar-13的人类cf和非cf嗜中性粒细胞的示例性24小时cfu测定；

图2d示出了感染mrsa并且用单独的抗生素或用ar-13处理的人类cf嗜中性粒细胞的示例性24小时cfu测定；

图2e示出了感染铜绿假单胞菌并且用及不用ar-13处理的人类cf和非cf嗜中性粒细胞的示例性24小时cfu；

图2f示出了感染铜绿假单胞菌并且用单独的抗生素或抗生素加ar-13处理的人类cf嗜中性粒细胞的示例性24小时cfu测定；以及

图3示出了没有感染(nt)、感染新洋葱伯克霍尔德菌(bc)、用ar-13(ar-13)处理、或感染加用ar-13处理(bc+ar-13)的人类cf和非-cfmdm在24h的示例性巨噬细胞存活力测定。

详细描述

公开的方法、组合物和装置可以在下文既被一般地又被具体地描述。应该注意，当描述特定于一个方面时，该方面不应该以任何方式限制方法的范围。

在一个方面，适用于单独或与如本文描述的抗生素组合使用的化合物包括，例如，ar-13(n-{4-[5-(菲-2-基)-3-(三氟甲基)-1h-吡唑-1-基]苯基}硫酸二酰胺)，具有以下结构：

抗生素耐受性是一个日益增长的医学和公共卫生问题，特别是在医院环境中。暴露于抗生素耐受菌株的免疫受损患者或患有潜在糖尿病、心血管或肺部紊乱的个体特别处于风险中。患有囊性纤维化的患者特别易受继发于多种因素的肺部感染的影响，所述多种因素包括：改变的肺功能、不能清除粘稠的脓性痰，以及巨噬细胞和其他免疫效应细胞固有地不能有效杀伤细胞内细菌。患有cf的患者上气道和下气道的感染通常是多种微生物，导致一旦建立后用当前的治疗和可用的抗生素难以根除的生物膜。患有cf的患者特别地处于感染新洋葱伯克霍尔德菌和铜绿假单胞菌的风险。新洋葱伯克霍尔德菌具有潜在的固有抗生素耐受性，而铜绿假单胞菌通过暴露于抗生素而产生耐受性。通常用于治疗患有cf的患者中的这些感染的抗生素的临床有效性和成功取决于存在的细菌和感染性细菌的个体抗生素易感性谱。

一个方面提供了组合物，所述组合物用于抑制微生物生长，所述组合物包含ar-13和抗生素。组合物可以被提供至感染微生物的患者或作为预防措施以降低处于高风险的患者(例如，患有cf的患者或免疫受损的患者)严重感染的风险。

用本文提供的组合物的治疗的有效性可以通过评价感兴趣的微生物(例如，细菌)，例如，在巨噬细胞或嗜中性粒细胞中的载量来测量。例如，细菌载量可以在有以及没有用本文提供的组合物的处理的细胞中测量，并且在期望的时间间隔(每小时、每日、每周等)内进行测量，并且可以比较在期望的时间间隔内处理的与未处理的细胞之间的细菌载量以确定细菌载量的减少倍数。在一个方面，巨噬细胞中的细菌载量被降低至少约1000倍。

在另一个方面，抗生素选自由以下组成的组：头孢菌素类、氟喹诺酮、氨基糖苷类、和碳青霉烯类。在另一个方面，抗生素选自由以下组成的组：头孢他啶、环丙沙星、庆大霉素、和美罗培南。

组合物还包含药物载体，其可以以合适的方式与ar-13和抗生素组合，以例如便于将组合物施用至患者并将药物递送至感染部位。药物载体包括，但不限于，乳膏、凝胶、溶液、悬浮液(包括，但不限于，脂质体悬浮液)、固体剂型、乳液等。

可以调整ar-13和抗生素的相对剂量以进一步限制发展抗生素耐受性的风险。在一个方面，ar-13以达到至少约2.5μm的血液或组织浓度的量提供，并且抗生素以达到至少约5μg/ml的血液或组织浓度的量提供。

本文提供的组合物还可以包含第二抗生素以治疗罹患继发感染的患者。

易受用本文描述的组合物的治疗影响的微生物包括，但不限于，铜绿假单胞菌和新洋葱伯克霍尔德菌。在另一个方面，细菌是多药耐受的。

施用ar-13和抗生素的另外的方法可以将感染人类cf巨噬细胞的新洋葱伯克霍尔德菌的滴度降低约1000倍。如图1a和1b中示出的，单独的ar-13对单独的培养基中的新洋葱伯克霍尔德菌具有直接的杀伤作用。图1说明了在提供5μm浓度的ar-13之后，单独的培养基中的新洋葱伯克霍尔德菌的光密度显著改变。

使细菌在37℃在luria-bertani(lb)肉汤中生长24小时，并且然后添加至96孔微量滴定板中的rpmi培养基中。然后将5-20μg/ml的不同浓度的ar-13以一式三份添加至孔中，并且在24小时时间段内对细菌生长的光吸收读数(opticalabsorbancereading)进行采集，并且在单独的rpmi(培养基)、单独的细菌与细菌加ar-13之间进行比较。

ar-13和头孢他啶或环丙沙星或庆大霉素或美罗培南的组合将cf巨噬细胞中的菌落形成单位(cfu)/ml降低至少1000倍，如图2中示出的。在这方面，人类cf单核细胞使用ficol梯度经由淋巴细胞分离培养基(corning,25-072-cv)从外周血样品中分离。将分离的单核细胞重悬于rpmi(gibco,22400-089)和10％人类ab血清(lonza,14-490e)中至2×10⁶个细胞/ml的浓度，并且在37℃孵育5天直至获得巨噬细胞。然后使巨噬细胞粘附至微量滴定板上，并且在规定的时间内以10的感染复数(multiplicityofinfection)(moi)感染新洋葱伯克霍尔德菌菌株k56-2。然后将抗生素或抗生素加ar-13添加至孔中持续24小时对于菌落形成单位分析，为了计数细胞内细菌，将感染的巨噬细胞在24小时之后用冰冷的pbs(invitrogen,14190)裂解。回收的细菌通过将系列稀释液铺板在lb琼脂板上并且使用acolytecolonycounter,5710/syn计数菌落来定量。

本文描述的方面提供了降低宿主中感染人类嗜中性粒细胞的铜绿假单胞菌的滴度的方法。在这方面，将人类嗜中性粒细胞从外周血样品中分离并且立即加工为组织培养物。将嗜中性粒细胞用铜绿假单胞菌感染2小时，然后用ar-13处理4-24小时。先前已经描述了从患有cf的患者中分离嗜中性粒细胞。yoo等，releaseofcysticfibrosisairwayinflammatorymarkersfrompseudomonasaeruginosa-stimulatedhumanneutrophilsinvolvesnadphoxidase-dependentextracellulardnatrapformation,jimmunol.2014may15；192(10):4728-38.pubmedpmid:24740504；

ar-13针对新洋葱伯克霍尔德菌具有直接杀伤作用。图1a是ar-12、ar-13、其衍生物及其他测试化合物直接杀伤新洋葱伯克霍尔德菌的筛选细菌杀伤测定。

如图1a中示出的，与未处理(单独的新洋葱伯克霍尔德菌)相比，单独的ar-13将新洋葱伯克霍尔德菌的光吸收密度降低约1.3倍，表明对新洋葱伯克霍尔德菌的直接杀伤作用。在24小时时间段内测量光密度(n＝3)。

图1b是图1a的实验在24小时的细菌密度的终点分析。图1b还示出了与未处理(单独的新洋葱伯克霍尔德菌)相比光吸收(opticalabsorbance)降低约1.3倍。

图1c是在24小时时间段内用抗生素(头孢他啶、环丙沙星、庆大霉素和美罗培南)或抗生素和ar-13的新洋葱伯克霍尔德菌在24小时的细菌密度的终点分析(n＝3)。

图1d示出了从用单独的抗生素或抗生素(青霉素、链霉素、利奈唑胺(linezolid))和ar-13处理的患有cf的患者分离的mrsa在24小时时间段内的细菌杀伤测定的结果(n＝3)。如图1d中示出的，与未处理相比，抗生素和ar-13的组合将mrsa的光吸收密度降低约2.5倍，并且与单独的抗生素相比降低约2倍。与未处理相比，单独的ar-13将mrsa的光吸收密度降低约1.3倍。

图1e是图1d的实验在24小时的细菌密度的终点分析。

图1f示出了响应于ar-13的剂量滴定，mrsa在24小时的细菌密度的终点分析(n＝3)。如图1f中示出的，随着ar-13的剂量从5μm降低至2.5μm至1.25μm，细菌光密度增加。

图1g示出了对于铜绿假单胞菌(从患有cf的患者中分离)与单独的及与ar-13一起的抗生素(庆大霉素、环丙沙星和头孢他啶)在单独的培养基中的24小时(n＝3)直接细菌杀伤测定的结果。如图1g中示出的，单独的或与抗生素组合添加ar-13未增强培养基中的细菌杀伤。

图1h示出了图1g的实验的细菌密度的终点分析。

对于图1a-1h，“*”＝p值<0.05，“**”＝p值<0.01，“***”＝p值<0.001。

图2示出了感染新洋葱伯克霍尔德菌(bc)±用ar-13处理的人类cf和非cf单核细胞来源的巨噬细胞的24小时菌落形成单位(cfu)测定的结果(n＝3)。

如图2a中示出的，ar-13对于感染新洋葱伯克霍尔德菌的非cf或cf人类单核细胞来源的巨噬细胞(mdm)的cfu/ml不具有作用。然而，如图2b中示出的，在感染bc并且用ar-13加头孢他啶、ar-13加环丙沙星、ar-13加庆大霉素和ar-13加美罗培南处理的人类cfmdm中，cfu/ml被降低约10000倍。

如图2c中示出的，ar-13在感染mrsa并且用及不用ar-13处理的人类cf和非cfmdm的24小时cfu测定中不具有作用。

类似地，如图2d中示出的，单独的或与抗生素组合的ar-13在感染mrsa的非cf或cf人类mdm的24小时cfu测定中不具有作用(n＝2)。

相比之下，如图2e中示出的，在感染铜绿假单胞菌(pa)的人类cf和非cf嗜中性粒细胞的24小时cfu测定中，ar-13将cfu/ml降低约10倍(n＝3)。如图2f中示出的，感染铜绿假单胞菌并且用单独的抗生素处理的人类cf嗜中性粒细胞与用抗生素加ar-13的处理相比未显示出cfu/ml的差异(24小时，n＝3)。

对于图2a-2f，“*”＝p值<0.05，“**”＝p值<0.01，“***”＝p值<0.001。

图3示出了，在感染新洋葱伯克霍尔德菌(bc)的人类mdm或未感染的mdm中，ar-13不影响巨噬细胞的存活力。

如本文讨论的，在一个方面，ar-13对缺乏人类巨噬细胞或嗜中性粒细胞的培养基中铜绿假单胞菌的生长不具有直接作用。在这方面，使用5μm单独的ar-13，在感染的cf和非cf巨噬细胞中，新洋葱伯克霍尔德菌负荷存在23％降低；相比之下，使用单独的ar-13，在cf嗜中性粒细胞中铜绿假单胞菌负荷存在70％降低，且在非cf嗜中性粒细胞中存在66％降低。

ar-13与庆大霉素、环丙沙星或头孢他啶组合引起cf巨噬细胞中新洋葱伯克霍尔德菌负荷的显著协同降低，和与美罗培南组合的中等降低(图2)。与非cf巨噬细胞相比，单独的抗生素在cf巨噬细胞中不具有新洋葱伯克霍尔德菌负荷的降低，但确实降低了cf和非cf嗜中性粒细胞两者中的铜绿假单胞菌负荷。cf和非cf巨噬细胞和嗜中性粒细胞耐受多达10μm浓度的ar-13，其中与单独的抗生素相比，在cf巨噬细胞中观察到巨噬细胞存活力增加。在另一个方面，高于约10μm的ar-13浓度导致未感染的mdm中增加的毒性。

又在另一个方面，ar-13与具有广谱抗微生物活性的抗生素组合，对降低人类cf巨噬细胞中抗生素耐受的新洋葱伯克霍尔德菌负荷具有协同作用。在另外的方面，单独的ar-13显著降低cf嗜中性粒细胞中的铜绿假单胞菌负荷。ar-13可以用作急性和慢性感染新洋葱伯克霍尔德菌及其他抗生素耐受微生物的患者的新的治疗选择，对于这些微生物当前还没有可用的疗法，或者对这些微生物可用疗法具有有限的治疗功效。

在另一个方面，本文描述的ar-13或组合物可以用于治疗或预防由感染性微生物引起的疾患和/或疾病，所述感染性微生物包括，但不限于，以上列出的那些。ar-13可以与抗生素同时或以任何合适的顺序连续提供至感染的患者。在另一个方面，ar-13和抗生素可以被同时施用至患者，或者ar-13和抗生素可以被配制在一起。

术语“施用(administer)”或“施用(administer)”指将本文描述的组合物提供至患者(包括通过患者、医疗保健专业人员、看护者提供至患者)，并且还包括向患者开处本文描述的组合物。

可以将本文描述的组合物口服、肠胃外(静脉内[iv]、肌内[im]、贮库-im、皮下[sq]和贮库-sq)、舌下、鼻内、通过吸入、鞘内、局部(topically)、或直肠施用。本领域技术人员已知的剂型适用于递送本文描述的组合物。

可以将ar-13配制为合适的药物制剂诸如乳膏和凝胶，用于局部应用；悬浮液、片剂、胶囊或酏剂用于口服施用，或者被配制在用于肠胃外施用的无菌溶液或悬浮液中，适用于吸入的悬浮液或溶液中(例如，定量吸入器、干粉吸入器、纳米颗粒)。可以使用本领域熟知的技术和程序将ar-13配制为药物组合物。

在一个方面，可以以如接受的药学实践所要求的单位剂型将约0.1mg至1000mg、约5mg至约200mg、或约10mg至约50mg的ar-13或生理学上可接受的盐或酯与生理上可接受的媒介物、载体、赋形剂、粘合剂、防腐剂、稳定剂、调味剂等一起复合(compounded)。包含ar-13的组合物或制剂中活性物质的量为获得达到指定治疗范围的合适剂量的量。

在另一个方面，组合物可以被配制为单位剂型，每一种剂量包含从约1mg至约1000mg、约1mg至约500mg、或约10mg至约200mg的活性成分。术语“单位剂型”指适于作为用于人类受试者和其他哺乳动物的单位剂量的物理上分散的单位，每一个单位包含与合适的药物赋形剂结合的、计算以产生期望的治疗效果的预先确定的量的活性物质。

在一个方面，ar-13中的一种或更多种与合适的药学上可接受的载体混合以形成组合物。在混合或添加化合物后，所得混合物可以是乳霜、凝胶、溶液、悬浮液、乳液等。脂质体悬浮液也可以用作药学上可接受的载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法进行制备。所得混合物的形式取决于许多因素，包括预期的施用方式和化合物在所选择的载体或媒介物中的溶解度。在一个方面，有效浓度足以减轻或改善所治疗的疾病、紊乱或状况的至少一种症状，并且可以经验地确定。

适用于施用本文描述的ar-13的药物载体或媒介物包括适用于特定施用方式的任何此类载体。另外，活性物质还可以与不损害所期望作用的其他活性物质、或与补充所期望作用或具有其他作用的物质混合。化合物可以被配制为组合物中唯一的药学活性成分，或者可以与其他活性成分组合。

在另一个方面，如果ar-13表现出不足的溶解度，则可以使用增溶方法。此类方法是已知的，并且包括但不限于，使用共溶剂诸如乙醇(etoh)或二甲基亚砜(dmso)、使用表面活性剂(例如，阴离子、阳离子、两性离子和非离子)。特定合适的表面活性剂包括，但不限于，吐温、泊洛沙姆、月桂醇硫酸钠(sodiumlaurylsulfate)、单硬脂酸铝并溶解于碳酸氢钠水溶液中。化合物的衍生物，诸如盐或前药也可以用于配制有效的药物组合物。

化合物的浓度有效递送在施用后减轻或改善对于其化合物被施用的紊乱的至少一种症状的量。通常，组合物被配制用于单剂量施用。

在另一个方面，如本文描述的ar-13可以用保护它们免于从身体快速清除的载体(诸如时间释放制剂(time-releaseformulation)或包衣)制备。此类载体包括控制释放制剂，诸如但不限于微囊递送系统。活性化合物可以以足以发挥治疗有用作用而不存在对所治疗的患者的不希望的副作用的量被包含在药学上可接受的载体中。治疗有效剂量可以通过在被治疗的紊乱的已知体外和体内模型系统中测试化合物经验地确定。

在另一个方面，本文描述的ar-13和组合物可以被封装在多剂量容器或单剂量容器中。封装的化合物和组合物可以在例如包括可以被组装使用的组分部分(componentparts)的试剂盒中提供。例如，冻干形式的ar-13和合适的稀释剂可以作为在使用之前组合的单独的组分提供。试剂盒可以包括ar-13和用于共施用的第二治疗剂。ar-13和第二治疗剂可以作为单独的组分部分提供。试剂盒可以包括多个容器，每一个容器容纳本文描述的一个或更多个单位剂量的ar-13。在一个方面，容器可以适于所期望的施用方式，包括，但不限于，用于口服施用的悬浮液、片剂、凝胶胶囊、持续释放胶囊等；用于肠胃外施用的贮库产品、预填充注射器、安瓿、小瓶等；以及用于局部施用的贴片、药垫(medipads)、凝胶、悬浮液、乳膏等。

药物组合物中ar-13的浓度将取决于活性化合物的吸收、失活和排泄速率、给药时间表和施用量以及本领域技术人员已知的其他因素。

在另一个方面，活性成分可以被一次施用，或者可以被划分为以时间间隔施用的许多较小的剂量。应当理解，精确剂量和治疗的持续时间受所治疗疾病的影响，并且可以使用已知的测试方案或通过从体内或体外测试数据外推来经验地确定。应注意到，浓度和剂量值还可以随着待缓解的状况的严重程度而变化。还应理解，对于任何特定受试者，应该根据个体需要和施用组合物或监督组合物的施用的人士的专业判断随时间调整具体剂量方案，并且本文列出的浓度范围仅是示例性的并且不意图限制所要求保护的组合物的范围或实践。

口服组合物将通常包含惰性稀释剂或可食用载体，并且可以被压制为片剂或被包封于明胶胶囊中。出于口服治疗施用的目的，一种或更多种活性化合物(theactivecompoundorcompounds)可以与赋形剂混合并以片剂、胶囊或锭剂的形式使用。可以包括药学上相容的粘合剂和辅料物质(adjuvantmaterials)作为组合物的一部分。

片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可以含有任何以下成分或具有相似性质的化合物：粘合剂诸如但不限于，黄蓍胶、阿拉伯树胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂(例如，任何合适的填充剂/增容剂(bulkingagent))诸如微晶纤维素、淀粉或乳糖；崩解剂诸如但不限于，海藻酸和玉米淀粉；润滑剂诸如但不限于，硬脂酸镁；助流剂，诸如但不限于，胶体二氧化硅；甜味剂诸如蔗糖或糖精；和调味剂诸如薄荷、水杨酸甲酯或水果调味剂。

当剂量单位形式为胶囊时，除了以上类型的物质以外，胶囊还可以含有液体载体诸如脂肪油。另外，剂量单位形式可以含有改变剂量单位的物理形式的多种其他物质，例如糖及其他肠溶剂的包衣。化合物也可以作为酏剂、悬浮液、糖浆、糯米纸囊剂(wafer)、口香糖等的组分施用。除了活性化合物以外，糖浆可以含有蔗糖作为甜味剂和某些防腐剂、染料和着色剂以及调味剂。

活性物质还可以与不损害所期望作用的其他活性物质、或者与补充所期望作用的物质混合或共施用。ar-13可以与例如抗生素、抗病毒药、抗真菌剂、止痛药或化妆品组合使用。

在一个方面，用于肠胃外、皮内、皮下、吸入或局部应用的溶液或悬浮液可以包括任何以下组分：无菌稀释剂，诸如注射用水、盐水溶液、不挥发的油，天然存在的植物油诸如芝麻油、椰子油、花生油、棉籽油等，或合成的脂类媒介物(syntheticfattyvehicle)诸如油酸乙酯等，醇类，聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成的溶剂；抗微生物剂诸如苯甲醇和对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂诸如抗坏血酸和亚硫酸氢钠；螯合剂诸如乙二胺四乙酸(edta)；缓冲剂诸如乙酸盐、柠檬酸盐和磷酸盐；以及用于调节张力的剂诸如氯化钠和右旋糖(dextrose)。肠胃外制剂可以被封装在安瓿、一次性注射器或由玻璃、塑料或其他合适材料制成的多剂量小瓶中。可以根据需要掺入缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂等。

当静脉内施用时，合适的载体包括，但不限于，生理盐水、磷酸盐缓冲盐水(pbs)、以及包含增稠剂和增溶剂诸如葡萄糖、聚乙二醇、聚丙二醇、乙醇、n-甲基吡咯烷酮、表面活性剂及其混合物的溶液。包含组织靶向脂质体的脂质体悬浮液也可以适于作为药学上可接受的载体。这些可以根据本领域已知的方法进行制备。

在另一个方面，ar-13可以用保护化合物免于从身体快速清除的载体(诸如时间释放制剂或包衣)制备。此类载体包括控制释放制剂，诸如但不限于植入物和微囊递送系统，以及生物可降解的生物相容性聚合物，诸如胶原、乙烯-乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、聚原酸酯、聚乳酸等。用于制备此类制剂的方法是本领域技术人员已知的。

在又另一个方面，在本公开内容的方法中使用的化合物可以经肠内或肠胃外施用。当口服施用时，在本公开内容的方法中使用的化合物可以以如本领域技术人员熟知的用于口服施用的通常的剂型来施用。这些剂型包括通常的固体单位剂型(片剂和胶囊)以及液体剂型，诸如溶液、悬浮液和酏剂。当使用固体剂型时，它们可以是持续释放类型，使得在本文描述的方法中使用的化合物仅需要每天施用一次或两次。

剂型可以被每天施用至患者1次、2次、3次或4次。如本文描述的ar-13可以被每天三次或更少次，或甚至一次或两次施用。

术语“治疗有效量”和“治疗有效时间段”用于表示有效降低微生物负荷的剂量和持续时间段的治疗。如以上提到的，此类施用可以是肠胃外、口服、舌下、经皮、局部、鼻内或直肠内。在一个方面，当全身施用时，可以将治疗组合物以获得从约0.1μm至约20μm的化合物的血液水平的足够的剂量施用。对于局部化施用(localizedadministration)，比该浓度低得多的浓度可以是有效的，并且高得多的浓度是可以耐受的。本领域技术人员将理解，造成ar-13的较低有效浓度的此类治疗效果可以根据待治疗的组织、器官或特定的动物或患者而显著变化。还应当理解，尽管患者可以以一个剂量开始，但是该剂量可以随着患者的状况改变而随时间变化。

实施例

实施例1—材料和方法

细菌菌株

使巨噬细胞感染表达rfp的新洋葱伯克霍尔德菌菌株k56-2。新洋葱伯克霍尔德菌菌株代表来自et12谱系的流行性临床菌株。使嗜中性粒细胞感染从国家儿童医院(nationalchildren’shospital)(nch)患有cf的患者的痰获得的泛耐受(pan-resistant)铜绿假单胞菌分离株和利奈唑胺敏感的mrsa分离株。使细菌在24小时内在培养基中可重现地生长。对于菌落形成单位分析，如先前描述添加50μg/ml庆大霉素(invitrogen,3564)持续0.5小时。在24小时之后，将感染的巨噬细胞或嗜中性粒细胞用冰冷的pbs(invitrogen,14190)裂解，并且计数细胞内的细菌。然后细菌通过将系列稀释液铺板在lb琼脂板上来定量并且使用acolytecolonycounter,5710/syn计数。

吞噬细胞分离

cf和非cf健康对照捐赠肝素化血液样品。如果受试者使用慢性免疫抑制剂、cftr调节剂或有移植史，则将其排除在外。将外周血单核细胞使用淋巴细胞分离培养基(corning,25-072-cv)从全血中分离。将分离的单核细胞重悬于rpmi(gibco,22400-089)加10％人类ab血清(lonza,14-490e)中，并且在37℃持续5天分化为mdm。然后将mdm置于单层培养物中，并以10的细菌感染复数(moi)感染。将cf嗜中性粒细胞从人类血液中分离。还使用人类thp-1单核细胞系。使thp-1细胞在rpmi中的10％胎牛血清(thermoscientific)中生长。为了使thp-1细胞分化为巨噬细胞，将它们用200nmpma(calbiochem)和30ng/mlgm-csf(r&dsystems,415-ml-050)进行处理。第二天将培养基用30ng/mlgm-csf补满，并且使thp-1来源的巨噬细胞成熟5天，然后实验。然后将thp-1细胞用cftr抑制剂inh-172处理24小时，然后实验以产生cf样巨噬细胞。

实施例2-ar-13对cf病原体具有直接杀伤作用

为了确定ar-12或其相关衍生物是否针对患有cf的患者感染的多种药物耐受病原体具有治疗效果的潜力，在单独的培养基中进行针对新洋葱伯克霍尔德菌的直接杀伤功效的筛选。将ar-12和5个衍生物化合物添加至接种的培养基中持续24小时，并且评价细菌生长。仅ar-13衍生物(n-{4-[5-(菲-2-基)-3-(三氟甲基)-1h-吡唑-1-基]苯基}硫酸二酰胺)与未处理的孔相比表现出细菌生长的显著降低(图1a、1b)。接下来评价了ar-13与抗生素针对新洋葱伯克霍尔德菌的协同杀伤。抗生素与ar-13组合未增强对新洋葱伯克霍尔德菌的直接杀伤(图1c)。接下来，评价ar-13杀伤能够发展抗生素耐受性的常见cf病原体诸如mrsa和铜绿假单胞菌的能力。ar-13表现出与青霉素/链霉素和庆大霉素针对mrsa的协同杀伤(图1d、1e)。由于存在协同杀伤，进行了剂量依赖性测定，并且证明了ar-13在5μm时针对mrsa的最大功效(图1f)。单独或与抗生素组合的ar-13未表现出针对铜绿假单胞菌的直接杀伤(图1g、1h)。

实施例3-ar-13增强来自患有cf的患者的巨噬细胞中吞噬细胞介导的杀伤

新出现的证据表明，患有cf的患者中的吞噬细胞介导的杀伤缺陷有助于感染(包括致病性多药耐受病原体，诸如新洋葱伯克霍尔德菌)的病理学。因此，我们旨在确定ar-13在宿主吞噬细胞存在下对细菌体外杀伤的影响。首先，在人类cf和非cfmdm中进行新洋葱伯克霍尔德菌生长的cfu测定。在cf或非cfmdm(图2a)中添加ar-13或在cf中用单独的抗生素(图2b)的情况下，细菌生长不存在差异。然而，当与多个广谱革兰氏阴性抗生素包括头孢他啶、环丙沙星、庆大霉素、和美罗培南组合时ar-13表现出在cfmdm中的新洋葱伯克霍尔德菌生长中的显著协同减少(图2b)。接下来，评价ar-13针对人类嗜中性粒细胞中mrsa的治疗。单独的或与抗生素组合的ar-13未减少cf嗜中性粒细胞中的mrsa细菌载量(图2c、2d)。尽管未观察到ar-13针对铜绿假单胞菌的直接杀伤，因为对人类mdm中的新洋葱伯克霍尔德菌的协同杀伤，因为已知的嗜中性粒细胞在cf中的假单胞菌属(pseudomonas)杀伤的作用，所以检查了ar-13对铜绿假单胞菌的嗜中性粒细胞介导的杀伤的影响。cf和非cf人类嗜中性粒细胞两者表现出用ar-13处理减少的铜绿假单胞菌生长(图2e)。当cf嗜中性粒细胞用ar-13和环丙沙星、庆大霉素或美罗培南组合处理时，未注意到生长的进一步协同减少(图2f)。

在ar-13的存在或不存在下进行巨噬细胞存活力，以确保观察到的细菌杀伤的增加不是由于细胞存活力减少造成的。用单独的ar-13或与新洋葱伯克霍尔德菌感染组合处理的cf和非cf巨噬细胞在细胞存活力方面未表现出显著差异(图3)。

参考文献

1.boothl,robertsjl,cruickshanksn,grants,poklepovica,dentp.regulationofosu03012toxicitybyerstressproteinsanderstressinducingdrugs.molcancerther.2014oct；13(10):238498.doi:10.1158/15357163.mct140172.epub2014aug7.pubmedpmid:25103559；pubmedcentralpmcid:pmc4185238.

2.chabrier-roselloy,gerikkj,koselnyk,didonel,lodgejk,krysandj.cryptococcusneoformansphosphoinositidedependentkinase1(pdk1)orthologisrequiredforstresstoleranceandsurvivalinmurinephagocytes.eukaryotcell.2013jan；12(1):1222.doi:10.1128/ec.0023512.epub2012oct19.pubmedpmid:23087368；pubmedcentralpmcid:pmc3535849.

3.baxterbk,didonel,ogud,schors,krysandj.identification,invitroactivityandmodeofactionofphosphoinositidedependent1kinaseinhibitorsasantifungalmolecules.acschembiol.2011may20；6(5):50210.doi:10.1021/cb100399x.epub2011feb22.pubmedpmid:21294551；pubmedcentralpmcid:pmc3098953.

4.chiuhc,kulpsk,sonis,wangd,gunnjs,schlesingerls,chencs.eradicationofintracellularsalmonellaentericaserovartyphimuriumwithasmallmolecule,hostcelldirectedagent.antimicrobagentschemother.2009dec；53(12):523644.doi:10.1128/aac.0055509.epub2009oct5.pubmedpmid:19805568；pubmedcentralpmcid:pmc2786354.

5.chiuhc,yangj,sonis,kulpsk,gunnjs,schlesingerls,chencs.pharmacologicalexploitationofanofftargetantibacterialeffectofthecyclooxygenase2inhibitorcelecoxibagainstfrancisellatularensis.antimicrobagentschemother.2009jul；53(7):29983002.doi:10.1128/aac.000489.

本文描述的每个要素并非都是必需的。事实上，本领域技术人员将发现本文描述的方法的许多另外的用途及变化形式，这是发明人意图仅通过权利要求书限制的。本文引用的所有参考文献通过引用以其整体并入。