本申请要求于2015年7月20日提交的美国临时专利申请No.62/194,466的优先权权益，其内容通过引用整体并入本文。
参考引用
为了仅允许通过引用并入的那些管辖权的目的，本公开中引用的所有参考文献通过引用整体并入本文。此外，本文引用或提及的任何产品的任何制造商的说明书或目录，通过引用并入本文。通过引用结合到本文中的文件或其中的任何教导可以用于本发明的实践中。美国专利8,465,732中提供的许多一般教导可以与本发明结合使用，或者可以适用于本发明。因此，美国专利第8,465,732号的全部内容特此通过引用明确地并入本申请中。
背景技术：
转录因子(TF)的E-26(ETS)-家族中的一部分，包括ETV2(Lee等人，Cellstem cell,2:497-507(2008)；Sumanas等人，Blood,111:4500-4510(2008))，FLI1(Liu等，CurrentBio.18:1234-1240(2008))和ERG(McLaughlin等人，Blood,98:3332-3339(2001))涉及调节血管发育和血管生成(De Val等人，Dev Cell,16:180-195(2009)；Sato等人，CellStructFunct,26:19-24(2001))。这些TF直接调节与内皮细胞(EC)发育和功能相关的基因的表达。成体EC表达几种ETS因子，例如FLI1，ERG(同种型1和2)、ETSJ、ETS2、Elfl、Elk1、VEZF和ETV6，而ETV2在胚胎发育期间瞬时表达，并且在成体EC中不存在(Kataoka等人，Blood,118:6975-6986(2011)；Lelievre等人，TheInternationalJournal OfBiochemistry&CellBiology,33:391-407(2001))。除了在发育过程中在血管规格中起关键作用(Liu等人，CircRes,103:1147-1154(2008)；Pham等人，DevBiol,303:772-783(2007))，也已表明这些TF中的一些的瞬时表达可将多能干细胞重编程为内皮细胞或可将其他(非多能)细胞类型重编程/转分化成内皮细胞(参见例如Choi等人，Stem Cells 27,559-567(2009)，James等人，Nat.Biotech.28,161-166(2010)，Prasain等人，Nat.Biotech.32,1151-1157(2014)，Morita等人，PNAS,112,160-165(2015)，Kurian等人，Nat.Methods 10,77-83(2013)，和Ginsberg等人，Cell,151:559-575)。然而，就本发明人所知，在本发明之前，ETS家族转录因子，特别是ETV2转录因子不被认为对分化的内皮细胞或已经定位于内皮细胞谱系的内皮细胞具有作用。类似地，在本发明之前以及就本发明人的最佳知识而言，也不预期表达此类因子的内皮细胞在其支持其他细胞类型，例如干细胞和祖细胞的扩增的能力方面可能具有增强的性质。
腺病毒早期4(E4)区域含有至少6个开放阅读框(E4ORF)。之前已经显示了整个E4区域调节血管生成并促进内皮细胞的存活(参见Zhang等人(2004),J.Biol.Chem.279(12):11760-66)。先前也已经显示，在整个E4区域内负责内皮细胞中的这些生物效应的是E4ORF1序列。参见美国专利号8,465,732。另见Seandel等人(2008),“Generation of a functional and durable vascular niche by the adenoviral E4ORF1gene,”PNAS,105(49):19288-93。
技术实现要素：
本发明部分基于以下发现：ETS转录因子ETV2在内皮细胞中表达时具有某些意想不到的作用，特别是当ETV2与腺病毒E4ORF1多肽共表达时。虽然之前已知表达E4ORF1的内皮细胞即使在无血清的情况下也可长时间维持培养，并可用于支持其他细胞类型如造血干细胞和祖细胞(hematopoietic stem and progenitor cells,HSPCs)的培养，(参见Kobayashi等人，Nature Cell Biology 12,1046-1056(2010)；Butler等人，Blood 120,1344-1347(2012))，而现在发现表达E4ORF1和ETV2的工程化的内皮细胞(即E4ORF1+ETV2+工程化的内皮细胞)也可以支持HSPC的扩增；此外，HSPC与E4ORF1+ETV2+内皮细胞的共培养物与单独使用E4ORF1+内皮细胞或单独使用ETV2+内皮细胞时观察到的相比能够获得更原始的HSPC群体选择性扩增。基于这些发现，本发明提供了E4ORF1+ETV2+工程化的内皮细胞、包含这些细胞的组合物，以及产生和使用这些细胞的各种方法。
在一个实施方式中，本发明提供了E4ORF1+ETS+工程化的内皮细胞的细胞群体，即表达腺病毒E4ORF1多肽和ETS转录因子多肽的工程化的内皮细胞的细胞群体。合适的ETS转录因子多肽包括FLI1、ERG(同种型1和2)、ETSJ、ETS2、Elf1、Elk1、VEZF、ETV6和ETV2。在优选的实施方式中，ETS转录因子是ETV2。因此，在一个优选实施方式中，本发明提供了E4ORF1+ETV2+工程化的内皮细胞的细胞群体。在一些这样的实施方式中，工程化的内皮细胞包含编码所述分子的重组核酸分子，例如编码ETS转录因子多肽、或ETV2多肽或E4ORF1多肽的重组核酸分子。在一些这样的实施方式中，重组核酸分子是以质粒载体的形式。在一些这样的实施方式中，重组核酸分子被整合到工程化的内皮细胞的基因组DNA中。在一些实施方式中，工程化的内皮细胞的细胞群体是分离的细胞群体。在一些实施方式中，工程化的内皮细胞的细胞群体是基本上纯的细胞群体。在一些实施方式中，工程化的内皮细胞的细胞群体在体外存在，例如在细胞培养物中。在一些实施方式中，工程化的内皮细胞的细胞群体存在于体内，例如存在于活体内。
在本发明的一些实施方式中，工程化的内皮细胞源自分化的内皮细胞。在一些实施方式中，工程化的内皮细胞源自成体内皮细胞。在一些实施方式中，工程化的内皮细胞不是胚胎内皮细胞，或者不是源自胚胎内皮细胞。在一些实施方式中，工程化的内皮细胞源自人内皮细胞。在一些实施方式中，工程化的内皮细胞源自原代内皮细胞。在一些实施方式中，工程化的内皮细胞源自人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。
在一些实施方式中，本发明提供了包含本文所述的各种内皮细胞群的组合物。例如，在一个实施方式中，本发明提供了包含如本发明所述的工程化的内皮细胞的细胞群体的组合物。在一些实施方式中，这样的组合物可以包含载体溶液，诸如生理盐水溶液。在一些实施方式中，这样的组合物可以包含其他细胞类型，例如干细胞或祖细胞，包括但不限于造血干细胞或祖细胞(hematopoietic stem or progenitor cells,HSPC)。在一些实施方式中，HSPC是遗传修饰的。在一些实施方式中，本发明提供的组合物是治疗性组合物，并且包含适合施用于活体例如人受试者的细胞、载体溶液和/或其它组分。在一些实施方式中，这样的组合物可以用于细胞移植过程，例如HSPC移植过程。
在组合物(例如治疗性组合物)包含HSPC的那些实施方式中，HSPC可以从任何合适的来源获得或衍生获得。例如，在一个实施方式中，HSPC从骨髓获得或来源于骨髓。在另一个实施方式中，HSPC获得自或衍生自外周血。在另一个实施方式中，HSPC获得自或衍生自羊水。在另一个实施方式中，HSPC获自脐带血。
在一些实施方式中，本发明提供了一种在培养基中维持或扩增内皮细胞的方法。例如，在一个实施方式中，本发明提供了用于在培养物中维持或扩增内皮细胞的方法，包括：将编码ETS转录因子多肽的核酸分子和编码E4ORF1多肽的核酸分子引入内皮细胞以产生E4ORF1+ETS+工程化的内皮细胞，其中工程化的内皮细胞可以在培养中保持或扩增。在一些实施方式中，上述转录因子的引入具有持续作用，并且将仅需要例如通过诱导型质粒、纯化的蛋白质或肽模拟物等暂时的表达。在优选的实施方式中，ETS转录因子是ETV2，并且所产生的工程化内皮细胞是E4ORF1+ETS+工程化的内皮细胞。每一种这样的方法还可以包括随后培养工程化的内皮细胞。在一些实施方式中，这样的培养可以在不存在血清的情况下，或者在不存在外源性生长因子的情况下，或者在同时不存在血清和外源性生长因子的情况下进行。在一些实施方式中，“引入”各种核酸分子的步骤通过转染进行，例如通过脂质体介导的转染、聚凝胺介导的转染、DEAE葡聚糖介导的转染、电穿孔、磷酸钙沉淀、显微注射或微粒轰击。在其他实施方式中，“引入”各种核酸分子的步骤通过病毒介导的转导进行，例如慢病毒介导的转导、腺病毒介导的转导、逆转录病毒介导的转导、腺相关病毒介导的转导或疱疹病毒介导转导。在一些实施方式中，使用一种或多种基因编辑技术，例如使用锌指核酸酶(ZFN)，转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)，CRISPR/Cas系统和/或改造的大范围核酸酶重构的归巢核酸内切酶等，来进行“引入”各种核酸分子的步骤。在一些实施方式中，所使用的内皮细胞是原代内皮细胞。在一些实施方式中，所使用的内皮细胞是人内皮细胞，例如HUVEC。
在一些实施方式中，本发明提供了各种共培养方法。例如，在一个实施方式中，本发明提供了一种在培养基中维持或扩增“感兴趣细胞”群体的方法，所述方法包括获得或产生E4ORF1+ETS+工程化的内皮细胞的细胞群体(例如优选的是E4ORF1+ETV2+工程化的内皮细胞)，并在相同培养容器培养所述工程化的内皮细胞和感兴趣的细胞群体。在一些实施方式中，这种共培养方法可以在不存在血清的情况下，或者在不存在外源性生长因子的情况下，或者在同时不存在血清和外源性生长因子的情况下进行。在一些这样的实施方式中，工程化的内皮细胞在培养容器的表面上形成饲养细胞层。“感兴趣的细胞”可以是希望与内皮细胞共培养的任何细胞。例如，在一个实施方式中，感兴趣的细胞可以是癌细胞、干细胞、祖细胞或杂交瘤细胞。在一个优选的实施方式中，感兴趣的细胞是HSPC。重要的是，已经发现，与一些其他方法相比，本文所述的共培养方法可以实现HSPC的改善的扩增，并且与其他一些方法相比，还可以实现更原始的HSPC更大的扩增。因此，在一些实施方式中，本文描述的共培养方法可以用于扩增更原始的HSPC，例如CD45RA-HSPC，包括CD34+高的、CD45RA-HSPC和CD34+高的、CD38-低的、Lin-HSPC。
在一些实施方式中，本发明提供了使用从本发明的工程化的内皮细胞获得的条件培养基的培养方法。例如，在一个实施方式中，本发明提供了用于维持或扩增感兴趣细胞群体的方法，其包括从E4ORF1+ETS+工程化的内皮细胞的细胞群体(例如优选E4ORF1+ETV2+工程化的内皮细胞)的培养物获得的条件培养基，并使感兴趣的细胞与条件培养基接触。类似地，在一个实施方式中，本发明提供了用于维持或扩增感兴趣细胞群体的方法，包括：获得或产生E4ORF1+ETS+工程化的内皮细胞的细胞群体(例如优选E4ORF1+ETV2+工程化的内皮细胞)，在培养容器中培养工程化的内皮细胞，从培养容器中收集条件培养基，并使感兴趣的细胞与条件培养基接触。每一种这样的方法还可以包括随后培养感兴趣的细胞。
类似地，在一些实施方式中，本发明提供了从本发明的工程化的内皮细胞的培养物获得的条件细胞培养基。例如，在一个实施方式中，本发明提供了从E4ORF1+ETS+工程化的内皮细胞(例如优选E4ORF1+ETV2+工程化的内皮细胞)的培养物获得的条件细胞培养基。
在一些实施方式中，本发明还提供了一种核酸载体分子。例如，在一个实施方式中，本发明提供了包含编码ETS转录因子多肽的核苷酸序列和编码E4ORF1多肽的核苷酸序列的核酸载体。在优选的实施方式中，本发明提供了包含编码ETV2多肽的核苷酸序列和编码E4ORF1多肽的核苷酸序列的核酸载体。在一些这样的实施方式中，载体是表达载体。在一些这样的实施方式中，载体是慢病毒载体。在一些这样的实施方式中，载体是逆转录病毒载体。在一些这样的实施方式中，两个核苷酸序列处于分别不同的启动子的控制之下。在其他实施方式中，两个核苷酸序列处于相同的启动子的控制下。
本文所述的细胞群体、组合物和方法可用于多种应用(如本专利公开的其他部分进一步描述的)。通常，本文提供的工程化的内皮细胞以及相关的组合物和方法可以用于内皮细胞(例如天然内皮细胞或E4ORF1+内皮细胞)目前正在使用或可以使用的任何应用，包括但不限于基础科学研究应用，细胞培养方法(包括共培养方法)，目标发现，药物发现和药物功效，毒性和/或安全性测试。例如，在一些实施方式中，工程化的内皮细胞可以用于促进其他细胞类型的培养，例如用于扩增各种类型的干细胞或祖细胞，例如HSC。在一些实施方式中，本文提供的工程化的内皮细胞可用于治疗性应用，包括但不限于体内细胞移植过程。例如，在一些实施方式中，工程化的内皮细胞本身可以单独或与一种或多种另外的细胞类型(包括但不限于干细胞或祖细胞，如HSC)一起施用于受试者。
在本发明公开的其他部分中进一步描述了本发明的这些和其他实施例。另外，对于本领域技术人员来说显而易见的是，本发明描述的各种实施例的某些修改和组合均落入本发明的范围之内。
附图说明
图1A-1C显示了E4ORF1+ETV2-(图1A)，E4ORF1-ETV2+(图1B)和E4ORF1+ETV2+(图1C)第8代工程化的内皮细胞(7代转导后(7passages after transduction))的相位显微镜图像。
图2A-2C显示了E4ORF1+ETV2-(图2A)，E4ORF1-ETV2+(图2B)和E4ORF1+ETV2+(图2C)内皮细胞，与HSPC共培养10天后的相位显微镜图像。
图3显示了经改造的仅表达E4ORF1(E4ORF1+ETV2-)，仅表达ETV2(E4ORF1-ETV2+)，或同时表达E4ORF1和ETV2(E4ORF1+ETV2+)的内皮细胞(如x轴的柱状图标签所指示)对共培养的HSPC的作用。细胞共培养10天。y轴是以CD45+细胞数量的百分比表示的CD34+HSPC的数量。
具体实施方式
本发明公开的“发明内容”、“附图”、“附图简要说明”、“实施例”和“权利要求书”部分描述了本发明的一些主要实施方式。本“具体实施方式”部分提供了与本发明的组合物和方法相关的某些附加描述，旨在结合本专利公开的所有其他部分来阅读。此外，对于本领域的技术人员而言显而易见的是，贯穿本专利公开内容所描述的不同实施例可以并且旨在以各种不同的方式进行组合。这里描述的具体实施方式的各种组合亦在落入本发明的范围之内。
定义
下面提供了一些定义。其他术语或者在本发明公开内容的其他地方定义，具有从使用它们的上下文中清楚的含义，或者以根据本领域中通常的含义使用。
如本发明所使用的，术语“约”和“近似”在与数值相关使用时意指在所述值的+或-20％以内。
“培养”是指细胞或生物体在各种介质上或介质中的繁殖。“共培养”是指两种或更多种不同类型的细胞或生物体在各种培养基上或培养基中的增殖，例如在一些实施方式中，可以共培养内皮细胞和造血干细胞或祖细胞(HSPC)。
本发明中的术语“有效量”是指指定的试剂或细胞群体(例如ETV2或E4ORF1多肽，编码ETV2或E4ORF1多肽的核酸分子或E4ORF1+ETV2+工程化的内皮细胞的细胞群体)的量，如本发明所述，该数量足以实现对本文描述的一个或多个结果的可检测效果。例如，在内皮细胞中表达ETV2和E4ORF1的情况下，有效量的待引入/递送至内皮细胞的核酸分子(例如在载体中)可以是与任何合适的对照(例如，E4ORF1-ETV2-内皮细胞)相比，导致内皮细胞中可检测的增加的内皮细胞存活或增殖的量。在共培养方法中使用E4ORF1+ETV2+内皮细胞的情况下，E4ORF1+ETV2+内皮细胞的作用量可以是导致共培养细胞的可检测的扩增，或者与任何合适的对照(例如，E4ORF1-ETV2-内皮细胞)相比的工培养细胞的扩增的增加。在将编码ETV2和/或E4ORF1的核酸分子导入内皮细胞的情况下，有效量的核酸分子(例如在载体中)可以是导致内皮细胞存活或增殖可检测的增加的核酸分子，如与任何合适的对照相比(例如，E4ORF1-ETV2-细胞)。在涉及给受试者施用E4ORF1+ETV2+内皮细胞的方法的情况下，有效量可以是实现一种或多种期望的生物学或治疗学指标(例如，改善的内皮细胞移植、改善的内皮/血管再生、改善的血管生成、共同施用细胞类型如HSPC的改进的存活或植入等)，与任何合适的对照相比(例如E4ORF1-ETV2-内皮细胞)。在任何单一情况下适当的“有效量”可以凭经验确定，例如使用本领域已知的标准技术，例如剂量递增研究，并且可以考虑诸如计划使用、计划的递送模式/给药、期望的给药频率/给药等。此外，“有效量”可以使用如本发明公开的实施例部分中所述的测定法来测定，以评估内皮细胞或共培养细胞的作用。
当与细胞一起使用时，术语“工程化的”是指已被人工改造以产生所述表型的细胞(例如，E4ORF1+ETV2+)，或表达所列举的核酸分子或多肽。术语“工程化的细胞”不意图包括天然存在的细胞，而是意图涵盖例如包含重组核酸分子的细胞，或人为地(例如通过遗传修饰)已经被人工改变的细胞，例如，以便它们表达它们原本不会表达的多肽，或者使得它们以比在非工程化的内皮细胞中观察到的高得多的水平表达多肽。
在本发明中在细胞或细胞培养物的上下文中使用的术语“扩增”或“扩增的”是指某种类型(例如内皮细胞或HSC)的细胞数量从初始细胞群体增加，初始细胞与扩增后的细胞类型可能相同或不相同。用于扩增的初始细胞不需要与由于扩增而生成的细胞相同。例如，可以通过初始细胞群的生长和分化来产生扩增的细胞。
“遗传修饰”或“遗传修饰的”是指细胞的正常核苷酸序列的任何添加、缺失或破坏。在一些实施方式中，本发明所述的内皮细胞除了含有编码ETS转录因子多肽(例如ETV2)的核酸分子和编码腺病毒E4ORF1多肽的核酸分子外，还可以包含一种或多种其他遗传修饰-根据需要。术语“遗传修饰”包括基因递送载体的使用，包括但不限于转导(核酸向受体的体内或体外病毒介导的转移)，转染(分离的核酸的细胞摄取)，脂质体介导的转移和其他手段是本领域众所周知的。
术语“造血干细胞”或“HSC”是指能够最终分化为造血系统的所有细胞类型的克隆形成的自我更新多能细胞，包括B细胞、T细胞、NK细胞、淋巴样树突细胞、髓样树突细胞、粒细胞、巨噬细胞、巨核细胞和红细胞。如同造血系统的其他细胞一样，HSC通常由存在一组特征性细胞标记物来定义。
本发明中术语“造血干细胞或祖细胞”或“HSPC”涵盖如上所定义的HSC以及能够最终分化成造血系统的所有细胞类型的多能非自我更新祖细胞，以及能够分化成造血系统的某些细胞类型的寡能和单能祖细胞。HSPC包括CMP、MP、MEP和GMP，其中每一种都在本文其他地方定义。
本文中术语“分离的”是指从其天然存在状态下与其相关的至少一种其他产物、化合物或组合物中分离的产物、化合物或组合物，无论是天然状态还是合成制备获得。
本文中术语“重组”是指由人(包括通过机器)使用分子生物学和遗传工程(例如分子克隆)方法产生的核酸分子，包含在自然界不会以其他方式存在的核苷酸序列。因此，重组核酸分子与自然界中存在的核酸分子区分开，例如存在于生物体的基因组中的。包含mRNA序列的互补D NA或“cDNA”拷贝的核酸分子，没有任何插入的例如可以在对应的基因组DNA序列中找到的内含子序列，将被认为是重组核酸分子。举例来说，重组E4ORF1核酸分子可以包含与天然存在的腺病毒基因组中通常不与其相关的启动子和/或其它遗传元件可操作地连接的E4ORF1编码序列。类似地，重组ETV2核酸分子可以包含ETV2cDNA序列(即，生物基因组中天然不存在的序列)，和/或可以包含与启动子和/或其他通常不与生物基因组相关的遗传元件可操作地连接的ETV2编码序列编码序列。
术语“自我更新”是指细胞分裂并产生具有与亲本细胞相同(例如，自我更新)特征的至少一个子细胞的能力。第二个子细胞可能致力于特定分化途径。例如，自我更新的造血干细胞分裂并形成一个子干细胞以及一个致力于在髓样或淋巴途径中分化的子细胞。定型祖细胞典型地丧失了自我更新能力，并在细胞分裂时产生显示更分化的(即限制的)表型的两个子细胞。
除非另有说明，术语“受试者”或“患者”可互换使用并且指的是哺乳动物，例如人和非人灵长类，以及兔、大鼠、小鼠、山羊、猪和其他哺乳动物物种。
本文所用的与细胞群有关的短语“基本上纯的细胞群”是指特定类型的细胞群(例如，通过一种或多种特定细胞标志物的表达、形态学特征或功能特征所确定的)或在两种或更多种不同细胞类型一起使用的实施方案中的多种特定类型，该细胞群具有至少约50％，优选至少约75-80％，更优选至少约85-90％和最优选至少约95％的特定细胞构成总细胞群。因此，“基本上纯的细胞群”是指含有少于约50％，优选少于约20-25％，更优选少于约10-15％，最优选少于约5％的不属于上述某一种或多种特定类型的细胞。
核酸分子和多肽
本发明所述的本发明的几个实施方式涉及工程化的内皮细胞，其是E4ORF1+，ETS+和/或ETV2+。E4ORF1+细胞表达腺病毒E4ORF1多肽。ETS+细胞表达ETS转录因子多肽(例如ETV2转录因子多肽)。ETV2+细胞表达ETV2转录因子多肽。这些多肽在本文中统称为“本发明的多肽”。
“本发明的多肽”由核酸分子编码。因此，在一些实施方式中，本发明涉及编码腺病毒E4ORF1多肽的核酸分子，编码ETS转录因子多肽的核酸分子，和/或编码ETV2转录因子多肽的核酸分子。这样的核酸分子在本文中统称为“本发明的核酸分子”。
本发明的多肽和本发明的核酸分子可以具有本发明所指定的或本领域已知的氨基酸序列或核苷酸序列，或者可以具有氨基酸或核苷酸序列，其是该氨基酸或核苷酸序列的变体、衍生物、突变体或片段，只要这样的变体、衍生物、突变体或片段具有或编码具有本文所述的一种或多种功能特性的多肽(其包括但不限于支持内皮细胞在培养基中的维持或扩增(例如在无血清条件下)，和/或支持培养基中另一种细胞类型如HSPC的扩增)。
在涉及ETS转录因子多肽的那些实施方式中，多肽例如是ETV2多肽，该多肽可以是任何哺乳动物ETS转录因子多肽，例如人、非人灵长类动物、兔、大鼠、小鼠、山羊或猪多肽。在一些优选的实施方式中，多肽可以是人多肽。此类多肽的氨基酸序列和编码此类多肽的核酸序列在本领域中是公知的，并且可以在公知的公众可获得的数据库如Genbank数据库中获得。
在涉及腺病毒E4ORF1多肽的那些实施方式中，所使用的多肽序列可以来自任何合适的腺病毒类型或毒株，例如2，3，5，7，9，11，12，14，34，35，46，50或52型人类腺病毒。在一些优选的实施方式中，使用的多肽序列来自人类5型腺病毒。这样的腺病毒多肽的氨基酸序列和编码这种多肽的核酸序列在本领域中是公知的，并且可以在公知的可用数据库如Genbank数据库中获得。例如，合适的序列包括：人腺病毒9(Genbank登录号CAI05991)，人腺病毒7(Genbank登录号AAR89977)，人腺病毒46(Genbank登录号AAX70946)，人腺病毒52(Genbank登录号ABK35065)，人腺病毒34(Genbank登录号AAW33508)，人腺病毒14(Genbank登录号AAW33146)，人腺病毒50(Genbank登录号AAW33554)，人腺病毒2(Genbank登录号AP.sub.--000196)，人腺病毒12(Genbank登录号AP.sub.--000141)，人腺病毒35(Genbank登录号AP sub.--000607)，人类腺病毒7(Genbank登录号AP.sub.--000570)，人腺病毒1(Genbank登录号AP.sub.--000533)，人腺病毒11(Genbank登录号AP.sub.--000474)，人腺病毒3(Genbank登录号ABB 17792)和人腺病毒5型(Genbank登录号D12587)。
在一些实施方式中，本发明的多肽和核酸分子具有与本文具体列举的或本领域已知的氨基酸(例如在公共序列数据库公开的，例如Genbank数据库中)或核苷酸序列相同的氨基酸或核苷酸序列。在一些实施方式中，本发明的多肽和核酸分子可以具有该序列的变体、衍生物、突变体或片段的氨基酸或核苷酸序列，例如与序列具有大于85％序列同一性的变体、衍生物、突变体或片段。在一些实施方式中，变体、衍生物、突变体或片段与已知序列具有约85％的同一性，或与已知序列具有约88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性。在一些实施方式中，使用相对于已知的核苷酸序列长度变化约50个核苷酸，或约45个核苷酸，或约40个核苷酸，或约35个核苷酸，或约30个核苷酸，或约28个核苷酸，26个核苷酸，24个核苷酸，22个核苷酸，20个核苷酸，18个核苷酸，16个核苷酸，14个核苷酸，12个核苷酸，10个核苷酸，9个核苷酸，8个核苷酸，7个核苷酸，6个核苷酸，5个核苷酸，4个核苷酸，3个核苷酸，2个核苷酸或1个核苷酸的已知核苷酸序列的变体、衍生物、突变体或片段。在一些实施方式中，使用相对于已知的氨基酸序列长度变化约50个氨基酸，或约45个氨基酸，或约40个氨基酸，或约35个氨基酸，或约30个氨基酸，或约28个氨基酸，26个氨基酸，24个氨基酸，22个氨基酸，20个氨基酸，18个氨基酸，16个氨基酸，14个氨基酸，12个氨基酸，10个氨基酸，9个氨基酸，8个氨基酸，7个氨基酸，6个氨基酸，5个氨基酸，4个氨基酸，3个氨基酸，2个氨基酸或1个氨基酸的已知氨基酸序列的变体、衍生物、突变体或片段。
在使用E4ORF1核酸或氨基酸序列的那些实施方式中，在一些实施方式中，单独使用前述序列而不与来自腺病毒E4区的其他序列一起使用-例如不被包含在整个E4区的核苷酸序列中，或者不与其他由E4区编码的多肽编码在一起使用。然而，在一些其他实施方式中，这样的序列可以与来自E4区的一个或多个其它核酸或氨基酸序列，例如E4ORF2、E4ORF3、E4ORF4或E4ORF5序列或其变体、突变体或片段结合使用。例如，尽管E4ORF1序列可用于含有其它序列、基因或编码区(如启动子、标志物基因、抗生素抗性基因等)的构建体(如病毒载体)中，但在某些实施方式中，E4ORF1序列用于不含整个E4区的构建体中，或不含整个E4区的其他ORF的构建体，如E4ORF2、E4ORF3、E4ORF4和/或E4ORF5。
根据所需用途，本发明的核酸分子可以用于含有各种其他核酸序列、基因或编码区的构建体中，例如抗生素抗性基因、报道基因或表达标签(例如编码GFP的核苷酸序列)或任何其他可能需要的核苷酸序列或基因。本发明的多肽可以单独表达或作为融合蛋白的一部分进行表达。
在一些实施方式中，本发明的核酸分子可以在一个或多个启动子的控制下进行表达。可以使用能够驱动所需细胞类型的核酸序列表达的任何启动子。合适的启动子的例子包括但不限于CMV、SV40、RSV、HIV-Ltr和MML启动子。启动子也可以是来自腺病毒基因组的启动子或其变体。例如，在使用E4ORF1的情况下，启动子可以是用于驱动腺病毒中相应基因表达的启动子。
在一些实施方式中，可以将本发明的核酸分子置于诱导型启动子的控制下，从而可以根据需要开启或关闭核酸序列的表达。可以使用任何合适的诱导型表达系统，例如四环素诱导型表达系统或激素诱导型表达系统。例如，本发明的核酸分子可以在需要时表达，然后在达到期望的结果时关闭，例如当内皮细胞已经达到足够的生长或增殖时。打开或关闭表达的能力对于体内应用可能特别有用。
本发明的核酸分子可以包含天然存在的核苷酸、合成的核苷酸或其组合。例如，在一些实施方式中，本发明的核酸分子可以包含RNA，例如在细胞内稳定的合成修饰的RNA，并可用于直接在细胞内指导蛋白质的表达/产生。在其他实施方式中，本发明的核酸分子可以包含DNA。在使用DNA的实施方式中，DNA序列可以可操作地连接于一个或多个合适的启动子和/或调节元件以允许(和/或促进、增强或调节)细胞内的表达，并可以在一种或多种合适的载体或构建体中。本发明的核酸分子可以在相同的核酸构建体中引入内皮细胞中，或者可以将其引入单独的核酸构建体中。
可以使用本领域已知的任何合适的系统将本发明的核酸分子引入内皮细胞，所述系统包括但不限于转染技术和病毒介导的转导技术。可根据本发明使用的转染方法包括但不限于脂质体介导的转染，聚凝胺介导的转染，DEAE葡聚糖介导的转染，电穿孔，磷酸钙沉淀，显微注射和微粒子轰击。可以使用的病毒介导的转导方法包括但不限于慢病毒介导的转导，腺病毒介导的转导，逆转录病毒介导的转导，腺伴随病毒介导的转导和疱疹病毒介导的转导。
本发明还提供载体，包括含有本发明的核酸分子的表达载体。例如，在一个实施方式中，本发明提供了包含编码ETS转录因子多肽的核苷酸序列和编码E4ORF1多肽的核苷酸序列的表达载体。在一些这样的实施方式中，ETS转录因子是ETV2。在一些这样的实施方式中，表达载体是慢病毒载体。在一些实施方式中，编码ETS转录因子多肽的核苷酸序列和编码E4ORF1多肽的核苷酸序列分别在不同的启动子的控制下。在一些实施方式中，编码ETS转录因子多肽的核苷酸序列和编码E4ORF1多肽的核苷酸序列处于相同启动子的控制下，例如在ETS和E4ORF1序列之间具有内部核糖体进入位点序列(IRES)。
在一些实施方式中，可以使用肽模拟物。肽模拟物是设计成模拟多肽的小蛋白质样链。这种分子可被设计为模拟本发明的任何多肽(例如ETV2或E4ORF1多肽)。通过修饰肽产生肽模拟物或以其他方式设计肽模拟物的各种不同方式是本领域已知的，并可用于产生本发明多肽之一的肽模拟物。
可以使用分子生物学和细胞生物学的常规技术来进行本发明的多肽和核酸分子的处理、操作和表达。这样的技术在本领域中是公知的。例如，可以参考Sambrook,Fritsch and Maniatis eds.,"Molecular Cloning A Laboratory Manual,2nd Ed.,Cold Springs Harbor Laboratory Press,1989)，Methods ofEnzymology(Academic Press,Inc.)系列书籍或用于指导用于处理、操作和表达核苷酸和/或氨基酸序列的合适技术的任何其他标准文本。与处理或表达E4ORF1序列有关的其它方面在美国专利第8,465,732号给出了描述，其内容通过引用结合并入本文。
内皮细胞
在一些实施方式中，本发明提供“工程化的内皮细胞”，诸如E4ORF1+ETV2+工程化的内皮细胞。工程化的内皮细胞可以来源于本领域已知的任何合适的内皮细胞。例如，在一些实施方式中，内皮细胞是血管内皮细胞。在一些实施方式中，内皮细胞是原代内皮细胞。在一些实施方式中，工程化的内皮细胞是哺乳动物细胞，诸如人或非人灵长类细胞、或兔、大鼠、小鼠、山羊、猪或其他哺乳动物细胞。在一些实施方式中，内皮细胞是原代人内皮细胞。在一些实施方式中，内皮细胞是脐静脉内皮细胞(UVEC)，例如人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。可以使用的其它合适的内皮细胞，包括在美国专利第8,465,732号中描述的适用于E4ORF1-表达的那些，其内容在此引入并入本文。
在一些实施方式中，工程化的内皮细胞经过基因修饰，使得在特定列举的分子(例如，E4ORF1和ETV2)表达的同时和除去其表达以外，它们还包含一个或多个遗传修饰。例如，这样的细胞可以包含已知参与或怀疑参与影响内皮细胞的疾病或病症的基因的修正形式，或者可以是任何其他基因，如治疗有用的基因期望在内皮细胞中提供或使用工程化的内皮细胞施用或递送。
本发明的工程化的内皮细胞可以以各种形式存在或以各种形式提供。例如，在一些实施方式中，工程化内皮细胞可以包含细胞群体，例如分离的细胞群体。在一些实施方式中，工程化的内皮细胞可以包含体外细胞群体。在一些实施方式中，工程化的内皮细胞可以包含基本上纯的细胞群体。例如，在一些实施方式中，构成总细胞群体的至少约50％，优选至少约75-80％，更优选至少约85-90％，并且最优选至少约95％的细胞是本发明的工程化的内皮细胞。在一些实施方式中，工程化的内皮细胞可以以含有工程化细胞和一种或多种其他组分的组合物的形式提供。例如，在一些实施方式中，本发明可以提供包含如本文所述的工程化的内皮细胞的细胞群体与载体溶液(例如生理盐水溶液，细胞悬浮介质，细胞培养基等)的组合物。在一些实施方式中，此类组合物可以是治疗性组合物-包含适合施用于受试者(例如人受试者)的工程化的内皮细胞的细胞群体和载体溶液。如果需要，可以包括其他治疗上可接受的药剂。本领域普通技术人员根据预期的用途容易地选择可包含在治疗组合物中的合适试剂。
在一些实施方式中，本发明的工程化的内皮细胞可以以含有本发明的工程化的内皮细胞和一种或多种另外的细胞类型的组合物(例如治疗组合物)的形式提供。这样的另外的细胞类型可以是例如可以在工程化的内皮细胞存在下维持、培养或扩增的细胞类型(例如使用本发明的工程化的内皮细胞作为“饲养细胞”)或任何其它细胞类型，其可能希望与本发明的工程化的内皮细胞一起使用，例如用于体外模型系统或用于对受试者的共同施用。此类另外的细胞类型的例子包括但不限于干细胞或祖细胞，例如造血干细胞或祖细胞(HSPC)，其可以使用工程化的内皮细胞作为“饲养细胞”来扩增。美国专利第8,465,732号提供了可与本发明的工程化内皮细胞一起提供或使用的细胞的其它实例，其内容在此引入并入本文。
方法和应用
本发明的工程化的内皮细胞可以用于各种不同的应用。类似地，本文提供的用于制造这种工程化的内皮细胞的方法可以用于多种不同的环境中。通常，本文提供的工程化的内皮细胞可以用于目前使用或可以使用非工程化的内皮细胞的任何应用中，或目前使用或可以使用E4ORF1表达的内皮细胞，例如美国专利第8,465,732号中提供的那些应用，其内容通过引用结合并入本文。例如，工程化的内皮细胞可用于研究目的和/或用于治疗目的，例如用于治疗或预防可能需要施用内皮细胞的疾病、紊乱或病症，例如缺血性病症，例如心肌缺血，或一些其他会受益于增加的血管生成(例如伤口愈合)或被其缓解的病症。在治疗心肌缺血的情况下，可以将细胞直接给予心脏或在心脏附近。在治疗伤口的情况下，细胞可以直接施用于伤口部位或其附近，例如皮肤伤口处的皮肤。细胞可以以单剂量或多剂量给药。本领域技术人员将能够根据期望的用途来选择合适的施用方法。
在一些实施方式中，本发明提供了各种治疗方法，诸如通过向这些受试者施用有效量的本发明的工程化的内皮细胞(或包含这种工程化的内皮细胞的组合物)来治疗有需要的受试者的方法。在这样的治疗方法中，细胞可以使用本领域已知的任何合适的手段施用于受试者。例如，细胞可以通过注射或输注到期望位置的血流或组织中来给药。例如，在治疗血管系统的疾病、紊乱或病症的情况下，根据本发明的工程化的细胞可以直接施用到血管系统的受影响部位处或其附近。在一些实施方式中，工程化的内皮细胞可以与一种或多种另外的细胞类型一起施用。这样的另外的细胞类型可以是例如干细胞或祖细胞，例如可能经遗传修饰的HSPC和细胞类型，例如遗传修饰的HSPC。工程化的内皮细胞可以以单剂量或多剂量给药。本领域技术人员将能够根据期望的用途根据和合适的给药方案来选择合适的给药方法。
在一些实施方式中，可以在体内产生本发明的工程化的内皮细胞，例如用于研究目的或用于治疗应用。例如，在一些方面，本发明提供了各种治疗方法，例如治疗有需要的受试者的方法，包括向这些受试者施用有效量的编码ETS的核酸分子转录因子多肽(例如ETV2)和编码E4ORF1多肽的核酸分子(例如在合适的载体中，和/或在合适的启动子的控制下)，使得受试者体内的内皮细胞被转染或转导核酸分子并在体内变成工程化的内皮细胞。在这样的方法中，可以使用本领域已知的任何合适手段将核苷酸分子给予受试者。例如，核苷酸分子(例如在合适的载体中)可以通过注射或输注到期望位置的血流或组织中来施用。核酸分子可以以单剂量或多剂量施用。本领域技术人员将能够根据期望的用途根据和合适的给药方案来选择合适的给药方法。
在一些实施方式中，本发明的工程化的内皮细胞在使用(例如治疗用途)之前有丝分裂灭活，使得它们不能复制。这可以通过例如使用化学试剂如丝裂霉素C或通过照射工程化的内皮细胞来实现。
细胞培养方法
培养细胞的方法是本领域众所周知的，可以使用任何合适的细胞培养方法。例如，可以使用已知可用于培养其他内皮细胞的方法，或已知可用于培养表达E4ORF1的内皮细胞的方法来培养本发明的工程化的内皮细胞，例如如美国专利第8,465,732号所描述的那样，其内容通过引用结合并入本文。在一些实施方式中，本发明的工程化的内皮细胞可以在不存在血清的情况下，或者在不存在外源性生长因子的情况下，或者在同时不存在血清和外源性生长因子的情况下进行培养。本发明的工程化的内皮细胞也可以被冷冻保存。细胞培养和细胞的各种方法冷冻保存对于本领域技术人员是已知的，例如R.Ian Freshney("Freshney")Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique,4th Edition(2000)中描述的方法，其内容在此引用并入文本。
在一些实施方式中，本发明提供了饲养细胞、条件培养基和细胞产物，其包含或源自本发明的工程化的内皮细胞并且可用于支持其他细胞类型的存活或生长，例如采用共同培养的方法。例如，在一个实施方式中，工程化的内皮细胞的细胞群体可以用作饲养细胞以支持干细胞或祖细胞例如HSPC和已经被遗传修饰的HSPC的生长。类似地，在其他实施方式中，本发明可以提供从本发明工程化的内皮细胞的培养物获得的条件细胞培养基，或从本发明的工程化的内皮细胞培养物获得的细胞产物(例如总细胞裂解物、细胞部分或特定细胞产物)。
在一些实施方式中，本发明提供了用于培养感兴趣的细胞群体的共培养方法。这样的“感兴趣的细胞”包括但不限于癌细胞(如原发癌细胞、癌干细胞和癌细胞系)，杂交瘤细胞，干细胞或祖细胞(如胚胎干细胞，诱导多能干细胞(IPSC))，以及来自任何胎儿或成人组织的干细胞，例如造血干细胞，神经干细胞，皮肤干细胞，精原干细胞，肠道干细胞和癌症干细胞等)，以及通常使用饲养细胞培养或希望使用饲养细胞培养系统的其他细胞类型。这样的共培养方法可以包括在相同的培养容器中一起培养本发明的感兴趣的细胞群和工程化的内皮细胞的细胞群体。在一些这样的实施方式中，工程化的内皮细胞可以在培养容器的表面上形成饲养细胞层，并且感兴趣的细胞可以被放置在饲养细胞层上。在另一个实施方式中，本发明提供培养感兴趣的细胞的方法，包括：使感兴趣的细胞群体与从本发明的工程化的内皮细胞的培养物获得的条件培养基接触。在一些实施方式中，本发明还提供了从本发明的工程化内皮细胞的培养物获得的条件细胞培养基。
试剂盒
本发明还提供用于实施本发明所述的各种方法或用于生产本发明提供的工程化的内皮细胞的试剂盒。此类试剂盒可含有本发明所述的任何组分，包括但不限于核苷酸序列(例如在载体中)，内皮细胞，工程化的内皮细胞的细胞群体，对照非工程化的内皮细胞，样品/标准工程化内皮细胞，用于检测工程化的内皮细胞或其中表达的蛋白质或核酸分子(例如核酸探针、抗体等)的手段或组合物，用于维持或扩增工程化的内皮细胞的培养基或组合物，由工程化的内皮细胞获得的条件培养基，用于向受试者施用工程化的内皮细胞的手段或组合物，或其任意组合。所有这样的试剂盒可以任选地包含使用说明、容器、培养容器等。标签可以伴随试剂盒，并且可以包括任何书写或记录材料，其可以是电子或计算机可读形式(例如，盘，光盘，存储器芯片或磁带)，提供用于使用试剂盒内容的指令或其他信息。
本发明的某些方面可以在以下的非限制性实施例中进一步描述。
实施例
E4QRF1+ETV2+内皮细胞的产生和使用
人脐静脉内皮细胞(HUVEC)被工程化改造用于表达(a)单独E4ORF1(E4ORF1+ETV2-)，(b)单独ETV2(E4ORF1-ETV2+)或(c)E4ORF1和ETV2(E4ORF1+ETV2+)两者。编码腺病毒E4ORF1的核酸分子被引入到慢病毒载体中的HUVEC中，如之前在Seandel等人，PNAS,2008；105(49):pp.19288-93，其内容在此引入并入本发明。编码人ETV2的核酸分子(Genbank登录号NM_01429)是使用相同的慢病毒系统引入的(使用两个单独的慢病毒构建体，一个用于E4ORF1，另一个用于ETV2)。慢病毒以1-5的感染复数(MOI)递送。通过PCR确认ETV2的表达。E4ORF1表达被证实表型(如先前已经报道的，E4ORF1+内皮细胞可以在无血清培养基中存活，而E4ORF1-内皮细胞在无血清条件下死亡)。工程化的内皮细胞在含有抗生素、HEPES、FGF2细胞因子、肝素和谷氨酰胺(Glutamax)的含血清的M199培养基(10％FBS)中培养并保持传代2-15次。如果细胞在一个烧瓶中至少48-72小时不分裂，则更换培养基。发现E4ORF1-ETV2+内皮细胞(即，表达ETV2但不表达E4ORF1的那些)与未转导的(E4ORF1-ETV2-)内皮细胞类似地行为，因为它们不能在培养中维持多次传代，而是开始在培养中衰老并丧失其内皮细胞表型。然而，即使在无血清条件下，E4ORF1+ETV2+内皮细胞可以培养更多的传代而不衰老，并继续积极增殖而不丧失其内皮细胞表型。图1显示了E4ORF1+ETV2-(图1A)，E4ORF1-ETV2+(图1B)和E4ORF1+ETV2+(图1C)第8代工程化的内皮细胞(慢病毒7代转导后(7passages after transduction))的显微照片。可以看出，E4ORF1-ETV2+内皮细胞看起来正在衰老，而E4ORF1+ETV2-和E4ORF1+ETV2+内皮细胞看起来是健康的和非衰老的。与初始E4ORF1-ETV2-内皮细胞相比，E4ORF1-ETV2+细胞显示无增殖差异。E4ORF1-ETV2+内皮细胞以与E4ORF1+ETV2-细胞大约相同的速率生长2-3代，随后增殖降低直到在8-10代左右时最终发生衰老。
允许各种工程化的内皮细胞生长至融合，然后在没有细胞因子补充剂(StemCell Technologies的StemspanTM培养基)的情况下过夜转移至造血培养基-在开始与人共培养造血干细胞和祖细胞(HSPC)之前。HSPC来自脐带血的血沉棕黄层。使用来自Miltenyi Biotech的磁性柱从血沉棕黄层样品中纯化CD34+HSPC。然后用50ng/ml的细胞因子团(tpo/flt31/scf)将CD34+HSPCs细胞加入到内皮细胞培养物中。以相同的方式(用相同的细胞因子处理)处理HSPC的“细胞因子单独”对照组，但不与内皮细胞共培养。
图2显示了E4ORF1+ETV2-(图2A)，E4ORF1-ETV2+(图2B)和E4ORF1+ETV2+(图2C)内皮细胞，与HSPC共培养10天后的相位显微镜图像。单独表达ETV2的内皮细胞(E4ORF1-ETV2+)在HSPC共培养和扩增过程中经历了显著的细胞死亡，而单独表达E4ORF1(E4ORF1+ETV2-)或ETV2和E4ORF1(E4ORE1+ETV2+)的内皮细胞即使在无血清培养基存在的情况下，在大部分的共培养和扩增过程中仍然保持存活并且大部分发生融合。共培养10天后，测量总细胞计数，并使用CD34、CD45RA、CD38和CD49F标记进行流式细胞术。这允许计算CD34+细胞的数量占细胞总数的百分比或者占CD45+细胞总数的百分比。
这个实验的数据在图3中提供。据发现，尽管表达内皮细胞的E4ORE1促进CD34+HSC的扩增(如先前已经证明的)，但是同时表达E4ORE1和ETV2的内皮细胞甚至更有效–与单独的E4ORE1相比实现了甚至更大的CD34+HSC扩增。E4ORE1+ETV2-和E4ORF1+ETV2+共培养组之间的HSPC扩增的这种差异在统计学上是显著的。此外，发现E4ORF1和ETV2的组合使用与单独使用E4ORF1或ETV2相比观察到的“更原始”HSPC更大的扩增-其中“更原始(more primitive)”的HSPC是CD34+高的、CD45RA-(以及CD38-、CD49F+)。“较不原始(less primitive)”HSPC是CD45RA+和CD34+高的(较不原始(less primitive))或CD34+(更不原始(even less primitive))。(HSPC越原始，则CD34表达越高)。
尽管如本发明描述的实验中，单独表达ETV2的内皮细胞(E4ORF1-ETV2+)可以在一定程度上扩增CD34+HSPC，鉴于观察到的显著衰老和细胞死亡，这样的细胞对于更大规模的应用例如作为临床应用可能是成问题的。另一方面，表达E4ORF1和ETV2(E4ORF1+ETV2+)的内皮细胞(其不受这些问题的影响)可以为需要大规模内皮细胞培养或大规模内皮细胞培养的应用提供独特且有价值的内皮细胞来源细胞共培养，包括临床应用。
所附的权利要求进一步描述了本发明。