本发明涉及微生物干燥菌体的制造方法，更详细而言涉及在高温下长期保存后的活菌的存活率高的微生物干燥菌体的制造方法。
背景技术：
作为肠内细菌已知的乳酸菌一直以来被广泛用于酸奶、乳酪等乳制品的制造中，另外，近些年进行了针对使用了使乳酸菌干燥而成的物质的食品、饮料等的开发。此外，为了得到乳酸菌的效果，期望利用处于存活状态的菌体，但在得到干燥菌体的工序中使菌体损伤、死亡的情况较多，难以得到所需量的活菌体。
此外已知：为了减少菌体的损伤、死亡，在对菌体进行干燥时所使用的分散介质中包含的成分是重要的，例如公开了：向分散介质中添加谷氨酸钠(专利文献1)、海藻糖(非专利文献1)；或将它们组合使用的情况(专利文献2)。
另一方面，考虑到干燥菌体的流通方面，期望即使在常温(20～40℃)下长期保存也可较高地维持存活率的干燥菌体。可认为：通常在常温的范围下，温度越高越促进保存中的制品劣化，尤其在高温(30～40℃)下的品质稳定性是重要的。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利第3504365号
专利文献2：日本特开2010-4787号公报
非专利文献
非专利文献1：G.L.DE ANTONI et al.“Trehalose,a Cryoprotectant for Lactobacillus bulgaricus”Cryobiology 26,p.149-153,1989
技术实现要素：
发明要解决的问题
因此，本发明的课题在于提供在高温的长期保存后的活菌的存活率高的微生物干燥菌体的制造方法。
用于解决问题的方案
本发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究，结果发现：在使微生物菌体干燥前，预先将微生物菌体悬浮在组合包含保护剂、抗氧化剂和螯合剂的分散介质中，接着进行干燥，从而使在高温下长期保存后的活菌的存活率提高，完成了本发明。
即本发明为一种微生物干燥菌体的制造方法，其特征在于，将微生物菌体悬浮在包含保护剂、抗氧化剂和螯合剂的分散介质中，然后进行干燥。
另外，本发明为一种微生物干燥菌体，其是使用包含保护剂、抗氧化剂和螯合剂的分散介质使微生物菌体干燥而成的。
另外，本发明为一种微生物菌体的干燥用分散介质，其包含保护剂、抗氧化剂和螯合剂。
发明的效果
根据本发明方法，可以得到即使在高温下长期保存、活菌的存活率也高的微生物干燥菌体。因此，从流通、保存方面考虑，利用本发明方法得到的微生物干燥菌体是极其优异的。
具体实施方式
作为利用本发明方法可以得到微生物菌体干燥粉末的微生物，没有特别限定，例如可以列举出：干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、乳脂乳杆菌(Lactobacillus cremoris)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、日本乳杆菌(Lactobacillus yoghurti)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)、德氏乳杆菌德氏亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.delbrueckii)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、马里乳杆菌(Lactobacillus mali)等乳杆菌属细菌；两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)等双歧杆菌属细菌；嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、乳链球菌(Streptococcus lactis)等链球菌属细菌；乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)、乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp.cremoris)、植物乳球菌(Lactococcus plantarum)；棉子糖乳球菌(Lactococcus raffinolactis)等乳球菌属细菌；粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)等球菌属细菌，可以将它们使用1种或2种以上。优选列举出乳杆菌属细菌，更优选干酪乳杆菌、特别优选干酪乳杆菌YIT 9029(FERM BP-1366、保藏日：1981年5月1日、国家高级工业科学技术学院，国际专利生物保藏中心(〒292-0818日本千叶县木更津市上总镰足2-5-8 120号室))。
对于本发明方法的实施，首先，依据常规方法培养微生物；接着，使用例如德拉瓦型连续离心机等进行集菌，根据需要进行清洗。
将该集菌的微生物菌体加入至包含保护剂、抗氧化剂和螯合剂的水溶液的分散介质(以下将其简称为“本发明分散介质”)中并使其悬浮，对该悬浮液进行干燥，就能够得到目标微生物干燥菌体。作为上述分散介质的溶剂，没有特别限定，例如可以使用：纯化水、去离子水等可以饮用的水。本发明分散介质是微生物菌体的干燥用分散介质，其包含保护剂、抗氧化剂和螯合剂。另外，优选由保护剂、抗氧化剂和螯合剂组成的分散介质。
作为本发明分散介质中使用的保护剂，没有特别限定，例如可以使用：谷氨酸或其盐、二糖类、丙三醇、麦芽糊精、环糊精、脱脂奶粉等，优选使用谷氨酸或其盐和/或二糖类，例如作为谷氨酸盐，可列举出：谷氨酸钠、谷氨酸钾等，特别优选谷氨酸钠。作为二糖类，可列举出：海藻糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖等，优选海藻糖。另外优选谷氨酸钠和/或二糖类、更优选谷氨酸钠和/或海藻糖。本发明分散介质中的保护剂的含量优选1～40质量％(以下由％表示)、更优选5～30％。
另外，作为本发明分散介质中使用的抗氧化剂，没有特别限定，例如可以使用：抗坏血酸或其盐、维生素E、儿茶素、谷胱甘肽、虾青素等，例如作为抗坏血酸盐，可列举出：抗坏血酸钠、抗坏血酸钙等，特别优选抗坏血酸钠。本发明分散介质中的抗氧化剂的含量优选0.01～10％、更优选0.05～5％。
进而，作为本发明分散介质中使用的螯合剂，没有特别限定，例如可以使用：乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸或其盐、植酸等。其中，作为柠檬酸盐，例如可列举出柠檬酸钠等。本发明分散介质中的螯合剂的含量优选0.1～10％、更优选0.5～5％。
另外，作为本发明分散介质，优选使用含有谷氨酸钠、海藻糖、抗坏血酸钠和柠檬酸钠的水溶液。
将微生物菌体悬浮在本发明分散介质中的菌体悬浮液中的微生物菌体数为1.0×105～4.0×1014cfu/mL左右，更优选1.0×107～4.0×1013cfu/mL。
本发明方法中干燥没有特别限定，例如可以利用冷冻干燥、喷雾干燥等公知的干燥方法，为了提高在干燥工序中的微生物的存活率，优选冷冻干燥。作为冷冻干燥法中的干燥条件，例如可以列举出在-35℃～-45℃下进行6～12小时的冷冻处理，然后在12℃～32℃下进行40～90小时的干燥处理的条件。需要说明的是，作为冷冻干燥机的例子，可以列举出TAKARA FREEZE-DRYER TF20-80TANNS(TAKARA ATM Ltd.)。
对于按上述方式得到的微生物干燥菌体(以下也称为“本发明的微生物干燥菌体”)，如后述实施例中所示那样在高温下长期保存后的活菌的存活率高，具体而言，利用研磨机将微生物干燥菌体粉碎，在通常的大气组成下不进行脱气地以每胶囊中0.2g填充至胶囊(羟丙甲基纤维素制)中，与脱氧剂(Mitsubishi Gas Chemical Company,Inc.制)一起放入铝袋中，在35℃下保存4周时的、保存后的活菌数相对于保存开始时的活菌数的比例(存活率)为30％以上。另外，利用研磨机将微生物干燥菌体粉碎，在通常的大气组成下不进行脱气地以每胶囊中0.2g填充至胶囊(羟丙甲基纤维素制)中，与脱氧剂(Mitsubishi Gas Chemical Company,Inc.制)一起放入铝袋中，作为在保存时变更温度的保存条件，在2℃1天、35℃2天、30℃6天、22℃6个月一系列的条件下保存时的存活率为35％以上、在22℃保存6个月时的存活率为40％以上。
本发明的微生物干燥菌体由于在刚冷冻干燥后的强度不大，因此具有容易进行之后的粉碎这样的效果。进而，悬浮于水时的分散性良好，以短的时间完成冷冻干燥。另外，吸湿性低、在长期保存后也不会形成块，处理性良好，外观、色调、气味等也与保存开始时没有区别，是良好的微生物干燥菌体。
另外，本发明的微生物干燥菌体是使用包含保护剂、抗氧化剂和螯合剂的分散介质使微生物菌体干燥而成的微生物干燥菌体。可以将该干燥菌体直接用于食品、饮料中；或者通过与添加至通常食品中的其它食品原材料混合用于食品、饮料中。例如，作为食品，可列举出：火腿、香肠等的食肉加工食品、鱼糕、圆筒状鱼糕等的水产加工食品；面包、点心、黄油、酸奶、发酵乳等，作为饮料，可列举出：清凉饮料、乳制品乳酸菌饮料、乳酸菌饮料等。另外，作为饮食品的形态为通常使用的饮食品的形态，例如可列举出：粉末、颗粒等的固体状、糊状、液态等。另外，还可以将微生物干燥菌体加工成片剂、散剂、咀嚼剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、丸剂等。
实施例
以下列举实施例对本发明进行更详细地说明，但本发明不受这些实施例的任何限制。需要说明的是，在以下的实施例中，利用以下方法测定了干酪乳杆菌的活菌数。
干酪乳杆菌活菌数
用生理盐水(0.85％NaCl)对干酪乳杆菌干燥菌体进行梯度稀释。将稀释液1mL用添加BCP的孔板计数琼脂培养基混合稀释，在37℃下进行72小时培养，然后计测存活的菌落，乘以稀释率，作为干酪乳杆菌活菌数。
实施例1
干酪乳杆菌干燥菌体的制备(1)：
用包含酵母提取物1％、磷酸二氢钾0.1％、磷酸氢二钾0.2％、乳糖2％的培养基(pH7)，在37℃下对干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)YIT 9029进行厌氧培养20小时。培养结束后，将液体温度冷却至20℃以下，用5N的氢氧化钠溶液将pH调整至7.0。将该培养液离心分离(14000G、4℃、30分钟)并回收得到的菌体，按下述表1所示的组成、以总量为1000mL的方式制造分散介质，对于菌体，以成为2.0×1011cfu/mL的方式悬浮在分散介质中。将菌体悬浮液分注于托盘中，利用冷冻干燥法制备了干燥菌体。需要说明的是，冷冻干燥使用冷冻干燥机TAKARA FREEZE-DRYER TF20-80TANNS(TAKARA ATM Ltd.)，以在室温-40℃下9小时、然后在20℃下80小时的条件进行。利用研磨机将得到的干燥菌体粉碎，在通常的大气组成下不进行脱气地以每胶囊中0.2g填充至胶囊(羟丙甲基纤维素制)中，与脱氧剂(Mitsubishi Gas Chemical Company,Inc.制)一起放入铝袋，在35℃下保存4周后，测定干酪乳杆菌的活菌数。将保存后的活菌数相对于保存开始时的活菌数的比例(存活率)示于表1。
[表1]
与使用了不包含抗氧化剂和螯合剂的分散介质的比较方法1和比较方法2相比，使用了含有保护剂(谷氨酸钠和海藻糖)、抗氧化剂(抗坏血酸钠)和螯合剂(柠檬酸钠)的分散介质的发明方法1的存活率高。
实施例2
干酪乳杆菌干燥菌体的制备(2)：
将分散介质的组成变更为下述表2所示的组成，除此以外利用与实施例1同样的方法制备干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)YIT 9029的冷冻干燥菌体，在通常的大气组成下不进行脱气地以每胶囊中0.2g填充至胶囊(羟丙甲基纤维素制)中，与脱氧剂(Mitsubishi Gas Chemical Company,Inc.制)一起放入铝袋，在35℃下保存4周后，测定干酪乳杆菌的活菌数。将保存后的活菌数相对于保存开始时的活菌数的比例(存活率)示于表2。
[表2]
使用了不包含螯合剂的分散介质的比较方法3～5的存活率比发明方法1低。由实施例1和2的结果显示出：与仅使用了保护剂的情况、仅使用了保护剂和抗氧化剂的情况相比，利用包含保护剂、抗氧化剂和螯合剂这3种成分的分散介质制造的干燥菌体在高温下长期保存后的存活率高。
实施例3
干酪乳杆菌干燥菌体的制备(3)：
利用与实施例1的发明方法1同样的方法制备干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)YIT 9029的冷冻干燥菌体，在通常的大气组成下不进行脱气地以每胶囊中0.2g填充至胶囊(羟丙甲基纤维素制)中，进行PTP包装(Press Through Package(铝塑泡罩包装)、铝片和氯乙烯制)，与脱氧剂(Mitsubishi Gas Chemical Company,Inc.制)一起放入铝袋，在表3所示的条件下保存，然后测定干酪乳杆菌的活菌数。将保存后的活菌数相对于保存开始时的活菌数的比例(存活率)示于表3。需要说明的是，2℃1天→35℃2天→30℃6天→22℃6个月的保存条件假定为如下条件：在30～35℃下运输冷冻干燥菌体，然后在22℃下保管。另外，保存后的冷冻干燥菌体的吸湿性低、且未形成块，外观、色调、气味也与保存开始时没有区别，是良好的冷冻干燥菌体。
[表3]
在2℃1天→35℃2天→30℃6天→22℃6个月和22℃6个月的任意保存条件下，均显示出存活性为良好，特别是在假定2℃1天→35℃2天→30℃6天→22℃6个月的实用化的保存条件下，显示出存活性为良好。
产业上的可利用性
利用本发明方法得到的微生物干燥菌体即使在高温下长期保存活菌的存活率也高。因此，从流通、保存方面考虑是极其优异的。另外，利用本发明方法得到的微生物干燥菌体可以用于食品、饮料等。
PCT/RO/134表