一种利用直链麦芽低聚糖生成酶制备直链麦芽六糖的方法与流程

本发明涉及一种利用直链麦芽低聚糖生成酶制备直链麦芽六糖的方法，属于功能糖生产技术领域。

背景技术：

直链麦芽低聚糖通常是指由3-10个α-D-吡喃葡萄糖单元通过α-1,4-糖苷键组成的功能性低聚糖。其具有良好的加工适应性和独特的生理功效，在食品、医药、纺织、造纸等多种领域的应用越来越广泛。直链麦芽低聚糖的甜度较低，可作为口感柔和的甜度剂；其持水力强而吸湿性小，可调节烘焙、膨化食品中的水分调节剂；其黏度为蔗糖的2-5倍，可提高冰淇淋的膨胀率或作为某些流质食品的增稠剂；能有效地抑制晶体结晶，抑制巧克力“返砂”；此外，直链麦芽低聚糖还能改善冷饮的抗融性能、延缓速冻食品的蛋白质变性和淀粉老化进程。

值得注意的是，直链麦芽低聚糖还具有独特的生理功能，它们可以不经胃的消化直接进入小肠，被小肠上皮细胞的α-葡萄糖苷酶水解，而进入血液后能迅速合成糖原，加速肝糖原和肌糖原的恢复，所以引起的胰岛素反应和血糖反应比葡萄糖平稳，能长时间地为人体提供能量，同时也能防止运动时大量乳酸的形成，因此对于运动员和一些胰脏切除病人、肾病患者来说是一种理想的能量补充来源。直链麦芽低聚糖还具其它生理特点：(1)可以促使人体更好地吸收Ca²⁺，有效预防中老年人骨质疏松；(2)不易被细菌发酵利用，有利于预防龋齿；(3)能选择性抑制肠道腐败菌的生长地而促进益生菌增殖，从而维护肠道内环境的健康。(4)提供信号促进双糖酶的成熟和转运为有利于其后续的消化，同时诱导小肠上皮细胞分化。

现有技术中报道的生产直链麦芽六糖的方法通常需要直链麦芽低聚糖生酶与脱支酶进行协同作用，并添加钙离子，才能获得60％以上的转化率。且目前国内外对直链麦芽低聚糖生产六糖的研究停留在实验室水平，其使用的底物浓度较低，一般为0.5％～5％，无法直接扩大并应用于工业化生产。工业上酶法工艺生产直链麦芽低聚糖，是通过直链麦芽低聚糖生成酶从淀粉非还原末端切下多个葡萄糖单元而成。在日本、美国等发达国家已开始批量生产直链麦芽低聚糖，而国内尚未有直链麦芽低聚糖的生产。随着直链麦芽低聚糖在各个领域中的应用前景越来越广泛，在国内开发具有工业应用价值的直链麦芽低聚糖势在必行。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供一种制备直链麦芽六糖的方法，所述方法是以2～10U/g底物的添加量加入直链麦芽低聚糖生成酶，水解淀粉或麦芽糊精生成含直链麦芽六糖的低聚糖浆。

在本发明的一种实施方式中，所述直链麦芽低聚糖生成酶的GenBank登录号为AIV43245.1。

在本发明的一种实施方式中，所述直链麦芽低聚糖生成酶由表达GenBank中的编号为AIV43245.1的酶的基因工程菌发酵获得。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌包括以Bacillus subtilis WB 600为宿主，以pST为载体，表达GenBank登录号为AIV43245.1的酶。

在本发明的一种实施方式中，所述淀粉包括玉米淀粉、马铃薯淀粉、蜡质玉米淀粉、木薯淀粉。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是以所述直链麦芽低聚糖生成酶为催化剂，以pH6.5～7.5的淀粉溶液或麦芽糊精溶液为底物，按2～10U/g底物的加酶量加入直链麦芽低聚糖生成酶，在60～80℃下反应24～72小时。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是以2U/g底物的加酶量加入直链麦芽低聚糖生成酶，在pH 7.0～7.5，60～80℃下反应24～72小时。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是以5U/g底物的加酶量加入直链麦芽低聚糖生成酶，在pH 7.0～7.5，60℃下反应24～72小时。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是以10U/g底物的加酶量加入直链麦芽低聚糖生成酶，在pH 7.0～7.5，60℃下反应24～48小时。

本发明的第二个目的是提供一种含30％以上麦芽六糖的低聚糖浆，是由所述方法制备获得的。

本发明还提供所述方法在制备含低聚糖的产品中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用包括制备含所述低聚糖的饮品、保健品。

本发明的有益效果在于：

1)本发明所用的直链麦芽低聚糖生成酶由食品级枯草芽孢杆菌表达，安全性好。该酶比酶活高，热稳定性好，可以水解麦芽糊精生成麦芽六糖含量达到30％以上的直链麦芽低聚糖浆，且即使延长反应时间葡萄糖的含量也很低。可用于生产功能性饮料及流质食品或生产高纯度的直链麦芽六糖，避免了直链麦芽低聚糖浆中葡萄糖对生产加工的影响，有利于直链麦芽低聚糖浆的深加工，从而更具有市场竞争力；

2)本发明所提供的生产直链麦芽六糖糖浆的方法，和其他生产淀粉糖的方法相比，不需要在生产过程中调节温度和pH、不需要普鲁兰酶、异淀粉酶等其他协同酶制剂，因此工艺更为简单、便捷，生产成本更低廉。

3)本发明的直链麦芽低聚糖生成酶对底物的转化率和产物纯度较高，分别达到75％和30％以上，可以有效降低高纯度直链麦芽低聚糖浆的生产加工成本，更具有工业应用价值。

附图说明

图1为采用实施例1的方法制备的糖浆产品的HPAEC-PAD曲线(稀释1000倍)；G1～G7分别代表葡萄糖、麦芽糖、直链麦芽三糖、直链麦芽四糖、直链麦芽五糖、直链麦芽六糖、直链麦芽七糖；

图2为采用实施例1的方法制备的糖浆产品中样品组分及相对含量；G1～G7分别代表葡萄糖、麦芽糖、直链麦芽三糖、直链麦芽四糖、直链麦芽五糖、直链麦芽六糖、直链麦芽七糖；

图3为采用实施例2的方法制备的糖浆产品中样品组分及相对含量；G1～G7分别代表葡萄糖、麦芽糖、直链麦芽三糖、直链麦芽四糖、直链麦芽五糖、直链麦芽六糖、直链麦芽七糖。

具体实施方式

实施例1

配制10％的麦芽糊精(DE＝4)溶液为底物，调节pH 7.0，按2U/g加酶量加入直链麦芽低聚糖生成酶(氨基酸序列在GenBank中的编号为AIV43245.1)，在60℃下反应72h，反应结束后沸水浴灭酶，采用高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法(HPAEC-PAD)测定样品的谱图如图1所示。样品中各组分相对含量如图2所示，此时糖浆中主产物直链麦芽六糖含量为32.3％，底物转化率达75.5％，而葡萄糖含量极低，无DP值大于等于8的直链低聚糖检出，说明反应体系中未被转化的底物可能以大分子的形式存在，分离较容易。

实施例2

配制30％的麦芽糊精(DE＝4)溶液为底物，调节pH 7.0，按2U/g加酶量加入直链麦芽低聚糖生成酶(氨基酸序列在GenBank中的编号为AIV43245.1)，在80℃下反应48h，反应结束后沸水浴灭酶，采用高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法(HPAEC-PAD)测定样品的组分与含量结果如图3所示，此时糖浆中主产物直链麦芽六糖含量为32.8％，底物转化率达76.2％。

实施例3

配制10％的马铃薯淀粉溶液为底物，调节pH 7.5，按2U/g加酶量加入直链麦芽低聚糖生成酶(氨基酸序列在GenBank中的编号为AIV43245.1)，在60℃下反应72h，反应结束后沸水浴灭酶，糖浆中主产物麦芽六糖含量为31.5％，底物转化率达76.8％。

实施例4

采用实施例3的方法，将马铃薯淀粉替换为玉米淀粉、蜡质玉米淀粉或木薯淀粉，主产物直链麦芽六糖含量均在30％以上，底物转化率均在75％以上。

实施例5

配制10％的蜡质玉米淀粉溶液为底物，调节pH 7.0，按5U/g加酶量加入直链麦芽低聚糖生成酶(氨基酸序列在GenBank中的编号为AIV43245.1)，分别在60℃下反应24，48h，72h，反应结束后沸水浴灭酶，采用高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法(HPAEC-PAD)测定样品的组分与含量结果如表1所示，此时糖浆中主产物直链麦芽六糖含量为35.0％～37.7％，底物转化率达75.％以上。

表1不同反应时间对糖浆产品中样品组分及相对含量的影响。

实施例6

配制10％的麦芽糊精(DE＝4)溶液为底物，调节pH 7.0，分别按2U/g、5U/g、10U/g加酶量加入直链麦芽低聚糖生成酶(氨基酸序列在GenBank中的编号为AIV43245.1)，在60℃下反应48h，反应结束后沸水浴灭酶，采用高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法(HPAEC-PAD)测定样品的组分与含量结果如表2所示，此时糖浆中主产物麦芽六糖含量为30.02～33.9％，底物转化率达75％以上。

表2不同加酶量对糖浆产品中样品组分及相对含量的影响

实施例7

配制30％的麦芽糊精(DE＝4)溶液为底物，调节pH 6.5，按5U/g加酶量加入直链麦芽低聚糖生成酶(氨基酸序列在GenBank中的编号为AIV43245.1)，分别在60～80℃下反应24h，反应结束后沸水浴灭酶，采用高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法(HPAEC-PAD)测定样品的组分与含量结果如表3所示，此时糖浆中主产物直链麦芽六糖含量为31.67～35.15％，底物转化率达75％以上。

表3不同反应温度对糖浆产品中样品组分及相对含量的影响。

实施例8

按实施例1的方法制备糖浆，区别在于分别采用GenBank中的编号为AAS99099.1、CAA39096.1和CAL64397.1的酶进行酶解反应，对反应结束后的糖浆中低聚糖产品的组分和含量进行测定，结果显示，采用GenBank中编号为AAS99099.1的直链麦芽六糖生成酶，底物转化率为51.24％，主产物直链麦芽六糖的比例为31.72％；采用GenBank中编号为CAA39096.1的直链麦芽六糖生成酶，底物转化率为57.12％，主产物直链麦芽六糖的比例为26.74％；采用GenBank中编号为CAL64397.1的直链麦芽低聚糖生成酶，底物转化率为60.34％，主产物直链麦芽六糖的比例为30.14％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。