本发明涉及酶工程领域，具体涉及一种利用巴斯德毕赤酵母发酵生产β-葡萄糖苷酶的发酵工艺。
背景技术：
β-葡萄糖苷酶(β-D-Glucosidase，EC3.2.1.21)，又称β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，它属于纤维素酶类，是纤维素分解酶系中的重要组成成分，能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖苷键，同时释放出β-D-葡萄糖和相应的配基。β-葡萄糖苷酶参与生物体的糖代谢，对维持生物体正常生理功能起着重要作用，此外，β-葡萄糖苷酶能将果、蔬、茶中的风味前提物质水解为具有浓郁天然风味的香气物质，还能协助纤维素酶降解纤维素。因此，β-葡萄糖苷酶在食品、发酵领域均有重要的应用价值。
巴斯德毕赤酵母（pachia pastoris）是一种能高效表达外源蛋白的表达系统，具有遗传稳定、表达水平高、产物可分泌、可高密度发酵等许多优点。为此，巴斯德毕赤酵母作为基因工程菌株，在酶制剂行业得到了广泛的应用。然而在以甲醇作为碳源诱导产酶时，甲醇经常不能很好的控制补料，经常出现两种情况：一是甲醇补料过低，菌体得不到充足的碳源，导致菌体浓度和产酶量下降；二是甲醇补料过量，导致菌体生长停滞甚至死亡。这两种情况严重影响巴斯德毕赤酵母在以甲醇作为诱导物产酶时的产量，此外，巴斯德毕赤酵母在发酵生产β-葡萄糖苷酶过程中，大量的β-葡萄糖苷酶会吸附在巴斯德毕赤酵母上，导致在提取过程中收率较低。因此，开发一种产品收率较高的利用巴斯德毕赤酵母发酵生产β-葡萄糖苷酶的发酵工艺是本领域技术人员亟待解决的技术问题。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是：为克服上述背景技术中提到的甲醇补料不稳定及毕赤酵母产β-葡萄糖苷酶提取收率低的技术问题，提供一种利用巴斯德毕赤酵母发酵生产β-葡萄糖苷酶的发酵工艺。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种利用巴斯德毕赤酵母发酵生产β-葡萄糖苷酶的发酵工艺，该工艺包括一种甲醇补料策略，具体为：
；其中，Y为甲醇补料量（L/h）；a为发酵液起始体积（L）；系数b的范围：0.006-0.06；系数c的范围：0.00085-0.002，x为补料时间（h）；该补料策略可使发酵液中甲醇浓度控制在10-20 g/L。
进一步限定，上述技术方案中所述的补料策略为：
；当a=100L，控制发酵罐的溶氧在20-45%时，该补料策略可使发酵液中甲醇浓度控制在10-15.4 g/L。
进一步限定，上述技术方案中，当a=100L时，补料时间和甲醇补料量（x，Y）存在如下较优点，（x∈（1-4）,0.8），（5,0.95），（6,1.1），（7,1.25），（8,1.4），（9,1.55），（10,1.7），（11,1.85），（12,2），（x∈（13-120），2.15）。
一种利用巴斯德毕赤酵母发酵生产β-葡萄糖苷酶的发酵工艺，该发酵工艺在发酵结束后，向产β-葡萄糖苷酶的毕赤酵母发酵液中添加质量百分比为5-20%的氯化钠溶液，在0-400 rpm/min搅拌3-16 h，加入质量百分比为10-25% 的硅藻土溶液进行板框过滤。
进一步限定，上述技术方案中发酵结束后，向产β-葡萄糖苷酶毕赤酵母发酵液中添加质量百分比10%的氯化钠溶液，200 rpm/min搅拌12 h，后加入质量百分比20%的硅藻土溶液进行板框过滤。
有益效果：与现有技术相比，采用本发明的技术方案能有效克服现有工艺中甲醇诱导产β-葡萄糖苷酶时容易出现的发酵液浓度过低或过高严重影响毕赤酵母生长及产β-葡萄糖苷酶能力的问题，能很好控制发酵液中甲醇浓度在10-20g/L，使菌体快速繁殖，且高效表达β-葡萄糖苷酶；同时通过改进提取工艺，解决β-葡萄糖苷酶提取收率低的问题，使提取收率达到71%，具有较大的工业应用价值，适宜进一步推广应用。
具体实施方式
下面所示的实施例不对权利要求所记载的发明内容起任何限定作用，并且，下面实施例所表示构成的全部内容不限于作为权利要求所记载发明的解决方案所必须的。下述实施例中涉及β-葡萄糖苷酶的测定和甲醇的测定，其中β-葡萄糖苷酶的测定方法具体如下：
试剂准备：
（1）缓冲液：
准确称取358.05 g磷酸氢二钠（Na2HPO4﹒12H2O）溶于4000 mL新沸放冷的蒸馏水中，定溶至5000 mL，摇匀，标记为0.2M磷酸氢二钠；准确称取105.05 g柠檬酸（C6H8O7·H2O）溶于4000 mL新沸放冷的蒸馏水中，定溶至5000 mL，摇匀，标记为0.1M柠檬酸；量取2465 mL0.2 M 磷酸氢二钠和2535 mL0.1 M的柠檬酸，混合摇匀，用精密pH计测定其pH值，必要时用0.2M 磷酸氢二钠或0.1M的柠檬酸调pH值至4.80，摇匀后标记为缓冲液,同时标记pH=4.80及配制日期。在4℃条件下保存；
（2）1%底物（4-硝基苯酚-β-D-吡喃葡萄糖苷简称p-NPG）
精密称取1.0000 g低聚糖转换酶底物缓慢加入到80mL缓冲液（3.2.1）中，磁力搅拌至完全溶解。用0.1 M柠檬酸或0.2 M磷酸氢二钠调pH值至4.80，再用pH=4.80的缓冲液定容至100 mL。标记为10 mg/mL低聚糖转换酶底物，同时标记pH=4.80及配制日期；4℃条件下保存，有效期7天；
（3）0.2 moL/LNa2CO3溶液
称取2.12g Na2CO3于100mL容量瓶中定容；
（4）待测酶液的制备
液体酶：用缓冲液稀释原酶液，控制待测酶液的浓度在0.031—0.035I U/g之间；固体酶：称取酶粉1 g，精确至0.0002 g，用约80mL缓冲液溶解，室温下磁力搅拌10 min，最后全部移入100 mL容量瓶中，用缓冲液定容至刻度；离心，取上清液用缓冲液稀释，控制待测酶液的浓度在0.031-0.035IU/g之间；
实验步骤：
（1）取0.05 M柠檬酸缓冲液1.0mL、0.5 mL粗酶液和0.5 mL底物于25mL的刻度管中，45℃水浴中反应15 min，立即加入2mL 0.2 M Na2CO3终止反应,然后在410 nm处测吸光值；以蒸馏水作为空白；
（2）酶活计算公式：y=（0.0573x-0.0003）/15*N，
其中，y—酶活（U/mL）；x—410 nm的吸光值；15—反应15 min；N—稀释倍数。
甲醇的测定方法具体如下：
试剂准备：
（1）高锰酸钾-磷酸溶液：称取3 g高锰酸钾，加入15 mL 85%磷酸与70 mL水的混合液中，溶解后加水至100 mL；贮于棕色瓶中，防止氧化力下降，保存时间不宜过长；
（2）草酸-硫酸溶液：称取5 g无水草酸（H2C2O4）或7 g H2C2O4·2H2O溶于硫酸（1+1）中至100 mL；
（3）品红—亚硫酸溶液：称取0.1 g碱性品红，研细，分次加入共60 mL 80℃的水中，边加水边研磨使其溶解，用滴管吸取上层溶液滤于100 mL 容量瓶中，冷却后加入10 mL 100 g/L亚硫酸钠溶液、1mL盐酸，再加水至刻度，充分混匀，放置过夜；如溶液有颜色，可加入少量活性炭，搅拌后过滤，贮于棕色瓶中，置暗处保存，溶液呈红色时就弃去重新配制；
（4）甲醇标准溶液：称取1.000 g甲醇，置于100 mL容量瓶中，加水至刻度；置低温保存；此溶液含10 mg/mL。
（5）甲醇标准使用液：吸取10.0 mL甲醇标准溶液，置于100 mL容量瓶中，加水稀释至刻度；
（6）100 g/L亚硫酸钠溶液，存于冰箱中，一周内可用。
实验步骤：
（1）根据样品甲醇浓度，适当稀释；吸取4 mL甲醇稀释液置于25 mL具塞比色管中；依次加入2 mL高锰酸钾—磷酸溶液、混匀，放置10 min后加入2 mL草酸-硫酸溶液，混匀使之褪色，再各加入5 mL品红-亚硫酸溶液，混匀；于20-30℃静默30 min，在OD590测吸光值。
（2）甲醇含量计算公式：
y=0.5429x+0.1427；其中，y—甲醇的含量（g/L）；x—OD590测的吸光值。
实施例一
一种利用巴斯德毕赤酵母发酵生产β-葡萄糖苷酶的发酵工艺，该工艺包括如下步骤：
（1）在300 L发酵罐中，用甲醇诱导100 L含毕赤酵母（湿重200 g/L）的发酵液产β-葡萄糖苷酶的发酵，甲醇的补料策略采用：进行补料，其中差数a=100 L，根据上述公式计算甲醇的具体补料量Y见下表1：
表1 甲醇的补料差数
根据上表甲醇的补料参数，诱导毕赤酵母产β-葡萄糖苷酶，控制发酵罐的溶氧在20-45%；每隔一段时间取样，测定发酵液中菌体的湿重、发酵液酶活及甲醇含量，结果如下表2：
表2 发酵主要参数
由表2可看出，根据上述的甲醇补料策略进行补甲醇，诱导毕赤酵母产β-葡萄糖苷酶，在诱导120 h期间，毕赤酵母表达产β-葡萄糖苷酶的同时，发酵液中的甲醇稳定地控制在10-15 g/L的浓度范围内；诱导期间，毕赤酵母生长旺盛，菌体湿重从200 g/L增长到409 g/L；同时，菌体高效表达β-葡萄糖苷酶，诱导120 h时，发酵液酶活达到216 U/mL。通过以上结果可以看出，该补料策略能很好的控制甲醇浓度在10-20 g/L，使菌体快速繁殖，且高效表达β-葡萄糖苷酶。
实施例二
下述实施例是在上述实施例所采用的工艺方法基础上，进一步分别向发酵液中添加质量百分比分别为5%、10%、15%的氯化钠溶液，200 rpm/h处理12 h，加入20%的硅藻土，进行板框过滤，测定过滤液的酶活，结果如下表3：
表3 不同处理方式下的过滤液酶活
注：对照表示没有添加氯化钠的发酵液。占比（%）计算采用：。从上表可看出，氯化钠的添加有效的提高了过滤液的酶活，相比于对照，5%、10%、15%的氯化钠添加处理后，可使过滤液酶活分别提高13%、61%、45%。因此，通过添加氯化钠可有效的提高β-葡萄糖苷酶的提取收率。
实施例三
下述实施例是在上述实施例所采用的工艺方法基础上，向186.5 kg发酵液（此时发酵液酶活145 U/mL），添加18.65 kg氯化钠（10%），200 rpm/min搅拌12 h，后加入37.3 kg硅藻土（20%），混匀后进行板框过滤。最后得到过滤液169.2 kg，过滤液酶活113.8 U/mL，酶收率达到71%。
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。