本发明属于微生物分子检测领域，尤其涉及一种嗜肺军团菌ST1型菌株的快速检测试剂盒及方法。
背景技术：
：军团菌是一种胞内寄生的革兰阴性杆菌，在土壤和水系统中广泛存在。目前军团菌属有59种包括70多个血清型，并不断有新的菌种从环境中分离。近年来发现，约有一半的军团菌种与人类疾病有关，其中约90％军团菌感染是由嗜肺军团菌引起。嗜肺军团菌序列分型(即ST分型)是欧洲军团菌感染工作组(EWGLI)建立的嗜肺军团菌SBT分型方法。该方法对嗜肺军团菌7个基因flaA，pilE，asd，mip，mompS，proA和neuA特异片段进行PCR和测序片段，通过对核苷酸序列与EWGLI数据库进行比对，得到基因型别(Sequencetype，ST)，对结果进行基因序列分型(Sequence-BasedTyping，SBT)和系统进化分析。通过数据分析发现，全球流行最广的嗜肺军团菌菌株为ST1型，约占欧洲军团菌研究小组所报告的临床分离菌株的50％以上，表明了嗜肺军团菌ST1型菌株的高致病性。一项对中国境内六个城市跨越8年的研究也表明ST1型在主要的军团菌传染源水环境中分布最广，占所有分离到的LP菌株的52％-93％。因此，对水环境中分离菌株的ST型快速监测与检测的基础研究有利于军团菌疾病预防和爆发风险的评估。目前对军团菌的检测鉴定方法主要有血清抗体检测、尿可溶性抗原检测、军团菌分离培养等。但是上述的检测方法存在检测时间长、阳性率低、培养基的配置复杂和价格昂贵的缺陷，不利于军团菌的快速检测。而对嗜肺军团菌高致病性ST1型流行株的检测方法依赖于PCR、测序、序列比对的方法，缺乏较简便的方法。多重PCR方法具有很高的特异性与敏感性，其主要是通过检测军团菌中的特异基因，以达到快速检测军团菌的目的。采用多重PCR法，一次反应中即可检测出军团菌属，嗜肺军团菌，嗜肺军团菌高致病性ST1型流行株进行不仅对临床上快速检测和鉴定不同类型军团菌感染有重要意义，也对流行病学调查具有一定的意义。中国专利申请201410607389.6公开了一种快速区分非嗜肺、嗜肺与嗜肺I型军团菌的三重PCR检测方法，所述检测方法主要是针对军团菌种属、嗜肺军团菌种和嗜肺军团菌I型的16SrRNA、danI和ORF9三个基因的引物，对dNTPs和引物浓度比例以及退火温度进行优化，建立快速区分非嗜肺、嗜肺与嗜肺I型军团菌的三重PCR方法，该检测方法可以对分离培养到的可疑军团菌菌株进行快速有效的判定。但是，该检测方法只对可疑军团菌菌株进行分型，不能检测嗜肺军团菌高致病性ST1型流行株，检测范围较狭窄，特异性不强，不利于该检测方法的推广和应用。中国专利CN101717815B公开了一种军团菌快速检测与分型方法，该方法是以基因组DNA为模板进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳分析，对检测出阳性PCR产物进行酶切反应，对酶切反应产物作琼脂糖凝胶电泳分析进行分子分型。该检测方法能够检测出军团菌，且能将其分子分型为嗜肺军团菌或非嗜肺军团菌。但是，该检测方法的依然不能检测嗜肺军团菌ST1型菌株。技术实现要素：为解决现有技术中军团菌的检测试剂盒存在检测范围窄的缺陷，本发明提供一种嗜肺军团菌ST1型菌株快速检测的试剂盒及方法，以解决上述问题。本发明提供一种嗜肺军团菌ST1型菌株快速检测的引物，包括细菌基因组DNA提取液、PCR反应液、PCR引物混合液、阳性对照液和阴性对照液，所述PCR引物混合液、阳性对照液和阴性对照液含有军团菌属(GenusLegionella)特异引物、嗜肺军团菌(Legionellapneumophila)特异引物、嗜肺军团菌ST1型菌株(LegionellapneumophilaST1strain)特异引物；所述军团菌属特异引物为：GL-388F：5’-GGAGGGTTGATAGGTTAAGAGC-3’(SEQIDNO.1)，GL-388R：5’-CCAACAGCTAGTTGACATCGT-3’(SEQIDNO.2)；所述嗜肺军团菌特异引物为：LP-229F：5’-TCCGATGGTCAAGTGCGT-3’(SEQIDNO.3)，LP-229R：5’-TGAAGGGACTTGATGTGGCA-3’(SEQIDNO.4)；所述嗜肺军团菌ST1型菌株特异引物为：flaA1-F：5’-TCGGCAGCATAAAAGCTTCTTAC-3’(SEQIDNO.5)，flaA1-R：5’-TCCTCCTCCAATTGCGATAGAG-3’(SEQIDNO.6)；neuA1-F：5’-CTCCTGTTTAAGTTTCAGCAAATGGAT-3’(SEQIDNO.7)，neuA1-R：5’-ACGACACTTTTCCCCGTTACTTT-3’(SEQIDNO.8)。进一步地，所述军团菌属特异引物靶基因为16srRNA基因，嗜肺军团菌特异引物靶基因为lpp0267基因，嗜肺军团菌ST1型菌株引物的靶基因为flaA1型等位基因和neuA1型等位基因。进一步地，所述细菌基因组DNA提取液的配方为：Chelex100resin5％；Tris-HCl10mM；pH8.3；乙二胺四乙酸二钠0.1mM；叠氮钠0.1％；蛋白酶K200μg/ml。进一步地，所述PCR反应液为2×PCR反应液，所述2×PCR反应液的组分及其组分浓度为：0.1U/μlEasyTaqDNA聚合酶；500μMdNTP；20mMTris-HCl；pH8.3；100mMKCl；3mMMgCl2。进一步地，所述8条引物同时存在于同一反应体系中，所述GL-388F、GL-388R、LP-229F、LP-229R、flaA1-F、flaA1-R、lneuA1-F、neuA1-R的浓度为200nM-500nM。进一步地，所述8条引物同时存在于同一反应体系中，所述GL-388F、GL-388R、LP-229F、LP-229R的浓度为200nM；所述flaA1-F、flaA1-R、lneuA1-F、neuA1-R的浓度为250nM。进一步地，所述阳性对照液含有嗜肺军团菌ST1型菌株基因组DNA、军团菌属特异引物、嗜肺军团菌特异引物和嗜肺军团菌ST1型菌株特异引物。另外，本发明还提供了一种嗜肺军团菌ST1型菌株快速检测的方法，包括如下步骤：S1应用细菌基因组DNA提取液提取待测标本中的细菌基因组DNA；S2以细菌基因组DNA为模板，采用军团菌属特异引物和嗜肺军团菌种特异引物、嗜肺军团菌血清型1型特异引物和嗜肺军团菌ST1型菌株引物进行多重PCR扩增；S3将阳性对照液和阴性对照液同时进行多重PCR扩增；S4将所得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。进一步地，所述步骤S2和步骤S3中的PCR扩增反应条件包括：阶段1：94℃3min；阶段2：94℃25s；阶段3：56℃25s；阶段4：72℃40s；35个循环；阶段5：72℃5min；在4℃贮存。进一步地，所述步骤S2中军团菌属特异引物：(GL-388F)-(GL-388R)扩增序列为388bp。其中，GL388F-GL388R引物对扩增序列为军团菌属16SrDNA基因一段保守序列，具体序列如下：GGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTGAGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTGGGGAGGAGGGTTAATAGGTTAAGAGCTGATTAACTGGACGTTACCCACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGTGGTTGATTAAGTTATCTGTGAAATTCCTGGGCTTAACCTGGGACGGTCAGATAATACTGGTTGACTCGAGTATGGGAGAGGGTAGTGGAATTTCCGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTACCTGGCCTAATACTGACACTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCAACTAGCTGTTGG。进一步地，所述步骤S2中嗜肺军团菌特异性引物：(LP-229F)-(LP-229R)引物对扩增片段为229bp；为嗜肺军团菌lpp0267基因内一段保守序列，具体序列为：TCCGATGGTCAAGTGCGTAGGTATTGTGCCTGATTATCCACAGCATAAAGGAACAGAGTATCTTACAGCCTCACCTTTATATAACCATTACTTTAAGGCGATAGAGGAGTTTGATAAAGAGTTTGCTGAGGTTCATGAAAAAATTTGGCAGGAGTACCTTACGTATTTCCGTATGACTTATATGCCCGTTTGTATGCGTGATCATTGCCTGCCACATCAAGTCCCTTCA；进一步地，所述步骤S2中嗜肺军团菌ST1型菌株引物引物对：(flaA1-F)-(flaA1-R)扩增序列为104bp，为嗜肺军团菌flaA1型等位基因一段保守序列，具体序列如下：TCGGCAGCATAAAAGCTTCTTCCATTGGTGGTATTGCCACGGCAACAGGAACAGAAGTAGCTGGTGCAGCAGCGACAGATATCACTATCGCAATTGGAGGAGGA；(NEUA1-F)-(NEUA1-R)，扩增序列为134BP，为嗜肺军团菌NEUA1型等位基因一段保守序列，具体序列如下：CTCCTGTTTAAGTTTCAGCAAATGGATGTTTTTTTTGACAGTGTATTGCTGTTACAACCAACTTCTCCATTTAGGAAGCCAGAAACCATAAGACATGCTGTTGAAATACATAAAGTAACGGGGAAAAGTGTCGT。本发明提供的嗜肺军团菌ST1型菌株快速检测的试剂盒对于所有军团菌属细菌，其会扩增出388bp的目地片段；对于嗜肺军团菌，其会扩增出除388bp军团菌属特异性片段外的229bp嗜肺军团菌种特异片段；对于嗜肺军团菌高致病性ST1型流行菌株，其会扩增出除军团菌属特异性的388bp片段和嗜肺军团菌种特异性229bp片段外，还会同时扩增出嗜肺军团菌高致病性ST1型流行菌株104bp和134bp片段。本发明提供的嗜肺军团菌ST1型菌株快速检测的试剂盒的方法是利用多重PCR原理，利用不同类型的军团菌菌株含有不同的特异基因，或相同的基因，其基因片段在不同型别菌种/菌株间的变异性，设计出针对不同类型菌株的4对特异引物，利用多重PCR的方式进行扩增，如果扩增出某种类型菌株含有的某个基因的特异片段，则说明存在该类型菌株。发明人经过生物信息学方法的研究发现16srDNA基因388bp片段所有军团菌属细菌中高度保守，而lpp0267基因为嗜肺军团菌所独有，flaA1型等位基因和neuA1型等位基因为嗜肺军团菌ST1型菌株所特有，设计针对上述不同类别特异的引物扩增不同大小片段。此外，发明人经过生物信息学方法的分析，也发现这8条引物，除了上述的4个引物对的配对方法能够扩增出不同长度的特异片段外，其他方式的两两组合方式，共计54种引物两两配对方式，均无非特异性片段出现，保证了反应的特异性。本发明提供的嗜肺军团菌ST1型菌株检测方法的结果判定方法是：对PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果进行分析，若出现388bp条带，则说明检测标本中含有军团菌属细菌，反之，则说明检测标本中不含军团菌属细菌；若除了出现388bp条带外还出现了229bp条带，则说明检出的军团菌为嗜肺军团菌；若除了388bp和229bp条带，还同时出现了104bp和134bp条带，则说明检测到的嗜肺军团菌军团菌为嗜肺军团菌ST1型菌株；如未同时出现134bp和104bp条带，则为嗜肺军团菌其他ST型菌株；其余组合状况可参考上述对于不同类型菌株特异性片段的说明。本发明提供嗜肺军团菌ST1型菌株检测试剂盒不仅能在临床中应用，还可以应用于环境水标本中，为环境水源风险性控制及军团菌感染流行病学调查提供依据和工具，有利于该检测方法的推广和应用。与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供的嗜肺军团菌ST1型菌株检测试剂盒，不仅能够检测军团菌属细菌，还能将其分型嗜肺军团菌和非嗜肺军团菌，并且可以进一步辨别嗜肺军团菌是否为嗜肺军团菌ST1型菌株，具有特异性好和准确性高的优点，提高了检测效率。该检测方法无需进行多次凝胶电泳分析，操作简便，而且检测结果准确，是一种理想的嗜肺军团菌ST1型菌株检测方法。附图说明图1为PCR扩增产物的凝胶电泳图；其中：Marker条带；从下到上分别为：100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、1200bp和1500bp，1-12分别为各个不同类型菌株鉴定结果，PC为阳性对照，NC为阴性对照。具体实施方式以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。其中，Chelex100resin购买自bio-rad公司(货号:1432832)。实施例1、引物本发明提供一种嗜肺军团菌ST1型菌株的引物。表1本发明提供的引物实施例2、引物的配对及其扩增片段大小本发明采用实施例1提供的军团菌属特异引物对扩增片段为388bp、嗜肺军团菌种特异引物扩增片段为229bp、嗜肺军团菌军团菌为ST1型菌株特异引物扩增片段为104bp和134bp片段。表2引物的配对及其扩增片段大小其中：(1)GL-388F与GL388-R引物扩增的核苷酸序列为：GGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTGAGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTGGGGAGGAGGGTTAATAGGTTAAGAGCTGATTAACTGGACGTTACCCACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGTGGTTGATTAAGTTATCTGTGAAATTCCTGGGCTTAACCTGGGACGGTCAGATAATACTGGTTGACTCGAGTATGGGAGAGGGTAGTGGAATTTCCGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTACCTGGCCTAATACTGACACTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCAACTAGCTGTTGG；(2)LP-229F和LP-229R引物扩增的核苷酸序列为：TCCGATGGTCAAGTGCGTAGGTATTGTGCCTGATTATCCACAGCATAAAGGAACAGAGTATCTTACAGCCTCACCTTTATATAACCATTACTTTAAGGCGATAGAGGAGTTTGATAAAGAGTTTGCTGAGGTTCATGAAAAAATTTGGCAGGAGTACCTTACGTATTTCCGTATGACTTATATGCCCGTTTGTATGCGTGATCATTGCCTGCCACATCAAGTCCCTTCA；(3)flaA1-F和flaA1-R扩增的核苷酸序列为：TCGGCAGCATAAAAGCTTCTTCCATTGGTGGTATTGCCACGGCAACAGGAACAGAAGTAGCTGGTGCAGCAGCGACAGATATCACTATCGCAATTGGAGGAGGA；neuA1-F和neuA-R扩增的核苷酸序列为：CTCCTGTTTAAGTTTCAGCAAATGGATGTTTTTTTTGACAGTGTATTGCTGTTACAACCAACTTCTCCATTTAGGAAGCCAGAAACCATAAGACATGCTGTTGAAATACATAAAGTAACGGGGAAAAGTGTCGT。实施例3、嗜肺军团菌ST1型菌株快速检测的方法1)应用细菌基因组DNA提取液提取待测标本中的细菌基因组DNA：选取标本进行预处理，再使用细菌基因组DNA提取液提取细菌基因组DNA，其中，所述DNA提取液的成分如下：DNA提取液组成浓度Chelex100resin5％质量浓度Tris-HCl,pH8.310mMEDTA-Na2(乙二胺四乙酸二钠)0.1mMNaN3(叠氮钠)0.1％质量浓度Protease-K(蛋白酶K)200μg/ml2)以细菌基因组DNA为模板，采用实施例1所述的军团菌属特异引物、嗜肺军团菌种特异引物、嗜肺军团菌ST1型菌株引物进行多重PCR扩增；所述的PCR反应混合液由以下组分组成：2×PCR反应混合液(2×EasyTaqPCRSuperMix，含0.1UTaqPolymerase/μl，500μMdNTP，20mMTris-HCl(pH8.3)，100mMKCl，3mMMgCl2)10μL，ddH2O6.2μL。3)将阳性对照和阴性对照同时进行多重PCR扩增；4)将所得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。凝胶成像结果，阳性对照应该有对照的4条条带分别为388bp，229bp，134bp和104bp，而阴性对照则无上述条带出现。若凝胶成像后，阴性对照出现388条带，或/和阳性对照未出现388bp，229bp，134bp和104bp电泳条带，则试验结果不可信，可能存在污染或操作有误。试验管的产物经过电泳若出现388bp条带，则说明标本中检出了军团菌，若无388bp条带出现，则标本中未检出军团菌，即标本中不存在军团菌；若除了出现388bp条带外还出现了229bp条带，则说明检出的军团菌为嗜肺军团菌；若除了388bp和229bp条带，还同时出现了134bp和104bp条带，则说明检测到的嗜肺军团菌军团菌为嗜肺军团菌ST1型菌株；如未同时出现134bp和104bp条带，则为嗜肺军团菌其他ST型菌株，其余组合状况可参考上述对于不同类型菌株特异性片段的说明。实施例4、痰标本的军团菌检测1、含有嗜肺军团菌和非嗜肺军团菌的痰标本处理：1)在1.5ml离心管中加入0.5ml军团菌专用的痰消化液；痰消化液为自制，其具体组成为：二硫苏糖醇(DTT)0.2g，乙二胺四乙酸0.894g，氯化钾0.04g，磷酸氢二钾0.36g和磷酸二氢钾0.04g,加双蒸水混匀后定容为10ml。2)用枪头或灭菌牙签从痰标本中吸取或挑取约0.5ml痰标本，置于上述痰消化液中；3)充分混匀后，37℃水浴10～15min；4)在13000rpm的离心机中离心5分钟后，弃上清，用0.5ml无菌水洗涤2次后离心留沉淀。2.标本中细菌基因组DNA的提取：在上述留取沉淀的离心管中加入细菌基因组DNA提取液100μl，在56℃水浴30min，接着在100℃水浴10min，离心沉淀，在5000rpm下离心5min，上清液即为提取到的基因组DNA，供作DNA模版。3.PCR反应1)每个标本准备3个PCR管，每管中分别加入两种引物混合液3μl，标记好管的编号。阳性对照及阴性对照亦各为一管，编号为PC或NC，直接加入5μl双蒸水进行反应；阳性对照液与阴性对照液的组成参见表3。表3阳性对照液和阴性对照液的组成配方PCR反应条件为：94℃3min,94℃25s,56℃25s,72℃40s，35个循环，72℃5min,4℃贮存。4.琼脂糖凝胶电泳反应完成后，将产物琼脂糖凝胶电泳，取5μlPCR产物和5μlDNAMarker，加入1.5％琼脂糖凝胶中电泳40min，DNAMarker的条带从小到大分别为100bp，200bp，300bp，400bp，500bp，600bp，700bp，800bp，900bp，1000bp，1200bp和1500bp。5.试验结果：试验结果如图1所示，其中：Marker条带；从下到上分别为：100bp，200bp，300bp，400bp，500bp，600bp，700bp，800bp，900bp，1000bp，1200bp和1500bp，1-4分别为各个不同类型的菌种鉴定结果，PC为阳性对照，NC为阴性对照。1-4道均出现了388bp条带，说明均检出了军团菌属细菌；1道仅出现了388bp条带，说明检出了军团菌，且该军团菌为非嗜肺军团菌菌株；2-4道出现388bp条带和229bp条带，说明检出了嗜肺军团菌菌株，但是2-3道未同时出现104bp和134bp条带，说明检出的嗜肺军团菌为非ST1型菌株。4道同时出现了104bp和134bp条带说明检出的嗜肺军团菌ST1型菌株。本发明的嗜肺军团菌ST1型菌株检测方法的检测结果与实际的结果一致，证明本发明提供的嗜肺军团菌ST1型菌株检测方法具有良好的实用性。SEQUENCELISTING<110>广州金域医学检验中心有限公司<120>一种嗜肺军团菌ST1型菌株的快速检测试剂盒及方法<130><160>8<170>PatentInversion3.3<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>1ggagggttgataggttaagagc22<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>2cgatctctacgcatttcaccg21<210>3<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>3gtcaaccagtattatctgaccgt23<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>4ctgggcttaacctgggac18<210>5<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>5tcggcagcataaaagcttcttac23<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>6tcctcctccaattgcgatagag22<210>7<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>7ctcctgtttaagtttcagcaaatggat27<210>8<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>8acgacacttttccccgttacttt23当前第1页1 2 3