一种用于筛选shRNA的双萤光素酶报告基因载体及其构建方法和应用与流程

本发明属于生物
技术领域：
，涉及一种用于准确筛选shrna的双萤光素酶报告基因载体及其构建方法和应用。
背景技术：
：rna干扰(rnai)是短发夹rna(shrna)或小干扰rna(sirna)介导的沉默或抑制目标基因表达的过程，该技术已广泛应用于基因功能、肿瘤发生发展及基因治疗等研究领域。为了使特定基因沉默表达，可针对该基因序列信息设计不同靶点的shrna，但不同的shrna所引起的沉默表达程度往往存在差异。因此，准确高效的筛选能够有效抑制靶基因表达的shrna是应用rnai技术进行研究和应用的基础。双萤光素酶报告基因实验(dual-luciferaseassay)是检测shrna对靶基因表达抑制程度的首选研究方法。该方法的基本原理是将靶基因构建到萤火虫萤光素酶(fireflyluciferase,fluc)基因的3'非翻译区，使靶基因跟随fluc基因一同转录为嵌合mrna。若shrna对靶基因具有抑制作用，则会降低fluc/靶基因嵌合mrna的稳定性，导致fluc表达量下降，引起fluc活力减弱。shrna对靶基因的抑制作用越强，fluc活力降低的程度越明显。为了减小细胞活性和转染效率等外在因素对fluc活力测定的影响，常在细胞中同时组成性表达海肾萤光素酶(renillaluciferase,rluc)作为内参，为试验提供基准线。双萤光素酶报告基因检测系统在细胞中同时表达fluc和rluc，两者来源于不同物种并对应不同的反应底物，故而没有交叉干扰。目前，应用双萤光素酶报告系统筛选抑制靶基因表达shrna的传统实验方法需要构建三个载体，一是将靶基因构建至fluc基因3'非翻译区的报告基因载体，二是产生待筛选shrna的真核表达载体，三是表达rluc的内参载体。实验中需要将上述三个载体按照一定比例混合后，共同瞬时转染细胞，而后分别测定fluc和rluc活力，计算二者比值，比值越低表示shrna对靶基因表达的抑制效果越强。然而在具体操作中，研究人员发现虽然在实验中使用rluc作为内参对照，但是由于受到无法避免的加样误差和细胞转染效率差异等因素的干扰，使得实际进入各个细胞的三个载体的比例必然不会完全相同，导致即使相同shrna实验组的不同重复样本的荧光素酶活力比值之间往往存在较大的波动，大大削弱了实验的准确性和可靠性。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种用于筛选shrna的双萤光素酶报告基因载体及其构建方法和应用，该载体同时具备报告基因载体、shrna真核表达载体和rluc内参载体三个功能，能够解决传统实验方法应用双萤光素酶报告系统筛选抑制靶基因表达shrna时测定结果波动较大、重复性差的问题。为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：一种用于筛选shrna的双萤光素酶报告基因载体，所述用于筛选shrna的双萤光素酶报告基因载体包括cmv启动子、fluc片段、用于插入待抑制靶基因的第一多克隆位点、sv40polya结构、rluc表达框、hsv-tk启动子、大肠杆菌启动子、sv40启动子、sv40复制起点、kan/neo抗性基因、用于插入待筛选shrna的第二多克隆位点和hsv-tkpolya结构。所述用于筛选shrna的双萤光素酶报告基因载体还包括用以增强rluc表达的嵌合人β-球蛋白内含子、f1单链dna复制起点、puc质粒复制起点、用于对插入第一多克隆位点的待抑制靶基因进行测序的测序引物fluc-c-f和用于对插入第二多克隆位点的待筛选shrna进行测序的测序引物shrna-f。其核苷酸序列如seq.id.no.1所示。所述的用于筛选shrna的双萤光素酶报告基因载体的构建方法，包括以下步骤：1)先以pgl3-basic载体为模板，采用pcr方法扩增制备出fluc片段，然后采用定向克隆法将制备的fluc片段替换pegfp-c1质粒中的egfp片段，构建成为pfluc-c质粒；2)以prl/tk载体为模板，采用pcr方法扩增制备出rluc表达框，再以同源重组的方法将rluc表达框插入pfluc-c质粒中，构建成为pfluc-c-tk-rluc载体；3)以pfluc-c-tk-rluc载体为模板，采用pcr方法在该载体的kan/neo抗性基因终止码后引入用于插入待筛选的shrna的多克隆位点，构建成为pfluc-c-tk-rluc-shrna载体，即为用于筛选shrna的双萤光素酶报告基因载体。所述步骤1)中pcr过程中使用的引物为p1和p2，获得的fluc片段中含有nhei和xhoi酶切位点，其中引物p1和p2具体如下：p1：5'-ggggctagcgtcgaccgccaccatggaagacgccaaaaacataaag-3'；p2：5'-tttctcgagccttctgttgggttaagaagtcgattacacggcgatctttccgcccttc-3'。所述步骤2)中pcr过程中使用的引物为p3和p4，获得的rluc表达框含有与pfluc-c质粒进行重组反应的短臂，其中引物p3和p4具体如下：p3：5'-caatttacgccttaaagatctaaatgagtcttcggacctc-3'；p4：5'-atcaatgtatcttaatcatgtctgctcgaagcggccgctc-3'。所述步骤3)中pcr过程中使用的引物为p5和p6，步骤3)中经pcr获得的扩增产物的5'端含有paci和ecori酶切位点，3'端含有xhoi和paci酶切位点，该扩增产物经paci酶切后，连接成环，构建成为pfluc-c-tk-rluc-shrna载体，其中引物p5和p6具体如下：p5：5'-aaattaattaaactagtgcgggactctggggttcgaaatgaccgac-3'；p6：5'-aaattaattaagatatctcagaagaactcgtcaagaaggcgatagaag-3'。所述的用于筛选shrna的双萤光素酶报告基因载体在双萤光素酶报告基因检测方面的应用。所述用于筛选shrna的双萤光素酶报告基因载体用于代替双萤光素酶报告基因检测系统中的三个载体，所述三个载体分别为将靶基因构建至fluc基因3'非翻译区的报告基因载体、产生待筛选shrna的真核表达载体以及表达rluc的内参载体。相对于现有技术，本发明的有益效果为：本发明构建了一个可单独使用的重组质粒载体，即用于筛选shrna的双萤光素酶报告基因载体(pfluc-c-tk-rluc-shrna载体)，由于该载体含有fluc片段、用于插入待抑制靶基因的第一多克隆位点、rluc表达框以及用于插入待筛选shrna的第二多克隆位点等基因片段，所以该载体能够同时具备将靶基因构建至fluc基因3'非翻译区的报告基因载体、产生待筛选shrna的真核表达载体和表达rluc的内参载体这三个功能。在进行双萤光素酶报告基因实验时，仅需要向细胞转染一个本发明提供的用于筛选shrna的双萤光素酶报告基因载体，即可替代传统实验共同转染三个载体的操作，彻底解决了由于三个载体比例出现偏差所引起的萤光素酶活力比值的波动问题，能够增强双萤光素酶报告系统的信噪比，提高筛选抑制靶基因表达shrna的准确性。本发明提供的用于筛选shrna的双萤光素酶报告基因载体能够用于替代现有双萤光素酶报告系统中的三个载体以避免实验结果的波动问题，具有十分明显的技术替代性，具有良好的应用前景。本发明构建的用于筛选shrna的双萤光素酶报告基因载体的三个功能具体如下：1、fluc基因终止码后为第一个多克隆位点，用于插入被抑制的靶基因序列，产生fluc/靶基因嵌合mrna，行使报告基因载体功能；2、kan/neo抗性基因终止码后为第二个多克隆位点，用于插入待筛选的shrna，行使shrna真核表达载体功能；3、包含rluc基因表达框，用于低水平、组成性地表达rluc，行使内对照载体功能。本发明提供的用于筛选shrna的双萤光素酶报告基因载体的构建方法，先用pcr扩增出的fluc片段替换pegfp-c1质粒中的egfp片段，构建成为pfluc-c质粒，再以同源重组的方法将pcr扩增出的rluc表达框插入pfluc-c质粒中，构建成为pfluc-c-tk-rluc载体，最后在该载体的kan/neo抗性基因终止码后引入用于插入待筛选的shrna的多克隆位点，即构建成为用于筛选shrna的双萤光素酶报告基因载体。该方法操作步骤简单，副产物少，采用常规的基因操作技术及实验条件即可完成，而且能够对目标产物方便的进行测序验证，具有良好的应用前景。附图说明图1为pgl3-basic质粒的结构示意图；图2为pegfp-c1质粒的结构示意图；图3为pfluc-c质粒的结构示意图；图4为prl/tk质粒的结构示意图；图5为pfluc-c-tk-rluc质粒的结构示意图；图6为pfluc-c-tk-rluc-shrna质粒的结构示意图；图7为pfluc-pd1-tk-rluc-shrna质粒的结构示意图；图8为pfluc-pd1质粒的结构示意图；图9为pegfp-pd1/furin-shrna#1/#2/#3/#4以及pegfp-shrna#nc质粒的结构示意图；图10为pfluc-pd1-tk-rluc-shrna#1/#2/#3/#4质粒的结构示意图；图11为应用本发明提供方法和传统三质粒共同转染方法筛选有效干涉pd1基因的shrna结果对比图；图12为pfluc-furin-tk-rluc-shrna质粒的结构示意图；图13为pfluc-furin质粒的结构示意图；图14为pfluc-furin-tk-rluc-shrna#1/#2/#3/#4质粒的结构示意图；图15为应用本发明提供方法和传统三质粒共同转染方法筛选有效干涉furin基因的shrna结果对比图。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。本发明是在美国clontech公司pegfp-c1载体、promega公司pgl3-basic和prl/tk载体的基础上进行改建。可以分别从http://www.clontech.com和http://www.promega.com网站获取载体结构和序列信息。人pd1基因(ncbi注册码：nm_005018.2)和人furin基因(ncbi注册码：nm_002569.2)orf全长cdna购自北京义翘神州生物技术有限公司。293a细胞购自美国atcc公司。nhei、xhoi、aflii、paci、xhoi、bamhi、ecorv、spei限制性核酸内切酶为美国neb公司产品。hsdna聚合酶、t4dna连接酶为takara公司产品。esaygeno快速重组克隆试剂盒、质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶dna回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。转染试剂lipofectaminetm2000、α-mem培养液、胎牛血清购自美国invitrogen公司。双荧光素酶报告基因检测试剂盒为美国promega公司产品。引物合成及基因合成技术服务由北京奥科鼎盛生物科技有限公司完成。荧光素酶报告基因检测使用promega公司gloma20/20luminometer照度计完成。本发明通过构建一个可单独使用的重组质粒载体pfluc-c-tk-rluc-shrna，使其同时具备报告基因载体、shrna真核表达载体和rluc内参载体三个功能。仅需要向细胞转染一个质粒，即可替代传统实验共同转染三个质粒的操作，彻底解决了由于三个载体比例出现偏差所引起的萤光素酶活力比值的波动，进一步增强双萤光素酶报告系统的信噪比，提高筛选抑制靶基因表达shrna的准确性。本发明构建pfluc-c-tk-rluc-shrna载体的步骤如下：首先，以pgl3-basic载体为模板，采用pcr方法扩增制备fluc片段，以定向克隆法将制备的fluc片段替换质粒pegfp-c1中的egfp片段，构建成为pfluc-c质粒；而后，以prl/tk载体为模板，pcr扩增制备rluc表达框，以同源重组方法将rluc表达框插入pfluc-c质粒，构建成为pfluc-c-tk-rluc载体；接着，以pfluc-c-tk-rluc载体为模板，应用pcr方法，在该载体kan/neo抗性基因终止码后引入三个酶切位点，构建成为pfluc-c-tk-rluc-shrna载体。所述的以pgl3-basic载体为模板，采用pcr方法扩增制备fluc片段，是根据pgl3-basic载体序列设计合成pcr引物p1和p2(序列见表1)，获得的fluc片段全长1708bp，含有nhei和xhoi酶切位点。所述的以prl/tk载体为模板，pcr扩增制备rluc表达框，是根据prl/tk载体序列设计合成pcr引物p3和p4(序列见表1)，获得的rluc表达框全长2029bp，含有与pfluc-c载体进行重组反应的短臂。所述的以pfluc-c-tk-rluc载体为模板，采用pcr方法引入三个酶切位点构建pfluc-c-tk-rluc-shrna载体，是根据pfluc-c-tk-rluc载体序列设计合成pcr引物，p5和p6(序列见表1)，获得的扩增产物全长7704bp，5'端含有paci和ecori酶切位点，3'端含有xhoi和paci酶切位点。该扩增产物经paci酶切后，连接成环，构建成为pfluc-c-tk-rluc-shrna载体，序列为seqidno.1。表1引物序列表引物名称引物序列(5'至3'方向)p1ggggctagcgtcgaccgccaccatggaagacgccaaaaacataaagp2tttctcgagccttctgttgggttaagaagtcgattacacggcgatctttccgcccttcp3caatttacgccttaaagatctaaatgagtcttcggacctcp4atcaatgtatcttaatcatgtctgctcgaagcggccgctcp5aaattaattaaactagtgcgggactctggggttcgaaatgaccgacp6aaattaattaagatatctcagaagaactcgtcaagaaggcgatagaagfluc-c-fgttgtgtttgtggacgaagtaccgsv40polyataagatacattgatgagtttggacshrna-fcgctatcaggacatagcgttggcpd1-faaactcgagatgcagatcccacaggcgccctgpd1-raaaggatcctcagaggggccaagagcagtgtcfurin-faacagaaggctcgagatggagctgaggccctggttgctfurin-ragatccggtggatcctcagagggcgctctggtctttga下面通过实施例来具体介绍本发明提供的用于筛选shrna的双萤光素酶报告基因载体(pfluc-c-tk-rluc-shrna载体)的具体构建过程及其应用效果。实施例1、重组质粒pfluc-c-tk-rluc-shrna的构建1、重组质粒pfluc-c的构建(1)以pgl3-basic质粒(结构示意图见图1)为模板，使用p1和p2组成的引物对(序列见表1)，在hsdna聚合酶的作用下进行pcr扩增，电泳回收获得的fluc片段全长1708bp，该片段的5'和3'端分别含有nhei和xhoi酶切位点。(2)以限制性内切酶nhei和xhoi双酶切pegfp-c1质粒(结构示意图见图2)和步骤(1)获得的dna片段，分别回收约3.9kb和1.7kb的dna片段。(3)将步骤(2)回收的dna片段在t4dna连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pfluc-c。(4)将重组质粒pfluc-c进行测序。测序结果表明fluc基因成功替换了pegfp-c1质粒中的egfp片段。重组质粒pfluc-c的结构示意图见图3。2、重组质粒pfluc-c-tk-rluc的构建(1)以prl/tk质粒(结构示意图见图4)为模板，使用p3和p4组成的引物对(序列见表1)，在hsdna聚合酶的作用下进行pcr扩增，电泳回收2029bpdna片段，该片段5'端至3'端依次为15bp上游同源重组短臂、hsv-tk启动子、人β-球蛋白内含子、rluc编码基因和15bp下游同源重组短臂。(2)以限制性内切酶aflii对重组质粒pfluc-c进行线性化，电泳回收约5.7kb的dna片段。(3)将步骤(1)获得的dna片段和步骤(2)获得的线性化质粒应用easygeno重组克隆试剂盒进行定向重组连接，得到重组质粒pfluc-c-tk-rluc。(4)将重组质粒pfluc-c-tk-rluc进行测序。测序结果表明，在重组质粒pfluc-c的sv40polya结构和f1单链dna复制起点结构之间插入了单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(hsv-tk)启动子、人β-球蛋白内含子和rluc编码基因。重组质粒pfluc-c-tk-rluc的结构示意图见图5。3、重组质粒pfluc-c-tk-rluc-shrna的构建(1)以重组质粒pfluc-c-tk-rluc为模板，使用p5和p6组成的引物对(序列见表1)，在hsdna聚合酶的作用下进行pcr扩增，电泳回收7704bpdna片段，该dna片段的5'端含有paci和spei酶切位点，3'端含有ecorv和paci酶切位点。(2)以限制性内切酶paci酶切步骤(1)获得的dna片段，回收约7.7kb的dna片段。(3)将步骤(2)回收的dna片段在t4dna连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pfluc-c-tk-rluc-shrna。(4)将重组质粒pfluc-c-tk-rluc-shrna进行测序，该质粒核苷酸序列如序列表中序列1所示，该质粒结构示意图见图6。根据测序结果，对重组质粒pfluc-c-tk-rluc-shrna进行结构描述如下：1～589bp为cmv启动子，在哺乳动物细胞中转录生成fluc与待抑制靶基因嵌合的mrna，翻译生成fluc；610～2262bp为fluc编码序列；2287～2339bp为多克隆位点1，包含xhoi、saci、kpni、apai、bamhi五个酶切位点，用于插入待抑制靶基因；2364～2584bp为sv40polya结构，用于终止fluc与待抑制靶基因嵌合的mrna以及rluc基因mrna的转录；2616～3551bp(互补序列)为rluc编码序列；3623～3759bp(互补序列)为嵌合人β-球蛋白内含子，用以增强rluc的表达；3826～4578bp(互补序列)为hsv-tk启动子，保证rluc低水平、组成性地表达；4594～5049bp为f1单链dna复制起点；5111～5146bp为大肠杆菌启动子，用于在大肠杆菌中表达卡那霉素抗性基因；5223～5491bp为sv40启动子，用于在哺乳动物细胞中表达新霉素抗性基因；5390～5525bp为sv40复制起点；5574～6368bp为卡那霉素/新霉素抗性基因；6369～6388bp为多克隆位点2，包含ecorv、paci、spei三个酶切位点，用于插入待筛选的shrna；6563～6832bp为hsv-tkpolya结构，用于终止卡那霉素/新霉素抗性基因mrna的转录；6973～7616bp为puc质粒复制起点。测序引物fluc-c-f和sv40polya用于对插入重组质粒pfluc-c-tk-rluc-shrna多克隆位点1的待抑制靶基因进行测序鉴定；测序引物shrna-f用于对插入重组质粒多克隆位点2的待筛选shrna进行测序鉴定。引物序列见表1。实施例2、应用重组质粒pfluc-c-tk-rluc-shrna筛选有效干涉pd1基因的shrna，并与传统三质粒共同转染方法进行对比1、重组质粒pfluc-pd1-tk-rluc-shrna和pfluc-pd1的构建(1)以人pd1基因orf全长cdna为模板，使用pd1-f和pd1-r组成的引物对(序列见表1)，在hsdna聚合酶的作用下进行pcr扩增，电泳回收约900bpdna片段，该片段的5'和3'端分别含有xhoi和bamhi酶切位点，核苷酸序列见序列表中序列2。(2)以限制性内切酶xhoi和bamhi双酶切pfluc-c-tk-rluc-shrna质粒、pfluc-c质粒和步骤(1)获得的dna片段，分别回收约7.6kb、5.6kb和900bp的dna片段。(3)将步骤(2)回收的900bpdna片段在t4dna连接酶的作用下分别与7.6kb、5.6kb片段进行连接，得到重组质粒pfluc-pd1-tk-rluc-shrna和pfluc-pd1。(4)将重组质粒pfluc-pd1-tk-rluc-shrna及pfluc-pd1以测序引物fluc-c-f和sv40polya进行测序。测序结果表明，pfluc-c-tk-rluc-shrna质粒多克隆位点1及pfluc-c质粒多克隆位点均成功插入了pd1基因。重组质粒pfluc-pd1-tk-rluc-shrna的结构示意图见图7，pfluc-pd1结构示意图见图8。2、五个重组质粒pfluc-pd1-tk-rluc-shrna#1/#2/#3/#4/#nc的构建(1)根据人pd1基因序列，设计合成四条shrna，命名为pd1-shrna#1～#4，具体序列如seq.id.no.3～seq.id.no.6所示。设计合成一条对人类基因无干涉作用的shrna作为对照，命名为shrna#nc，具体序列如seq.id.no.7所示。上述五条shrna片段的5'端含有xhoi和ecorv酶切位点、3'端含有spei和ecori酶切位点。上述五条shrna片段由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成后，以xhoi和ecori双酶切克隆入pegfp-c1质粒交付使用，重组质粒命名为pegfp-pd1-shrna#1/#2/#3/#4以及pegfp-shrna#nc，结构示意图见图9。(2)以限制性内切酶ecorv和spei双酶切pfluc-pd1-tk-rluc-shrna质粒和步骤(1)获得的五个重组质粒，分别回收约8.5kb和130bp的dna片段。(3)将步骤(2)回收的dna片段在t4dna连接酶的作用下进行连接，得到五个重组质粒pfluc-pd1-tk-rluc-shrna#1/#2/#3/#4/#nc。(4)将五个重组质粒pfluc-pd1-tk-rluc-shrna#1/#2/#3/#4/#nc以测序引物shrna-f进行测序。测序结果表明shrna序列成功插入到pfluc-pd1-tk-rluc-shrna质粒多克隆位点2区域。重组质粒pfluc-pd1-tk-rluc-shrna#1/#2/#3/#4/#nc的结构示意图见图10。3、待筛选shrna对pd1基因抑制效果的测定(1)pfluc-pd1-tk-rluc-shrna#1/#2/#3/#4/#nc质粒单独转染方法a细胞培养：293a细胞以α-mem+10％(v/v)胎牛血清培养，接种至48孔板中(1×105个细胞/孔)，待细胞汇合率达到85～95％进行转染；b转染混合液配制：吸取0.4μgpfluc-pd1-tk-rluc-shrna#1/#2/#3/#4/#nc质粒加入25μl无血清α-mem培养液混匀；吸取1μllipofectamine2000加入25μl无血清α-mem培养液混匀，室温静置5分钟；将二者混匀后室温静置20分钟；c转染：吸弃48孔板中培养液，将转染混合液加入孔板，置37℃培养箱继续培养；d撤液：6小时后吸弃转染混合液，每孔加入200μlα-mem+10％(v/v)胎牛血清培养液，置37℃培养箱继续培养48小时后进行报告基因检测。(2)传统的三质粒共同转染方法a细胞培养方法与单质粒转染方法相同；b转染混合液配制：吸取0.3μgpfluc-pd1质粒(fluc报告基因载体)、0.1μgpegfp-pd1-shrna#1/#2/#3/#4或pegfp-shrna#nc质粒(shrna表达载体)以及5ngprl/tk质粒(rluc内参载体)加入25μl无血清α-mem培养液混匀；吸取1μllipofectamine2000加入25μl无血清α-mem培养液混匀，室温静置5分钟；将二者混匀后室温静置20分钟；c转染和撤液方法与单质粒转染方案相同。(3)报告基因检测a吸弃转染后细胞培养液，以d-pbs洗涤细胞一次；b每孔加入100μl1×passivelysisbuffer(promega)裂解细胞；c转移细胞裂解液于1.5ml离心管中，12000rpm，4℃离心15min；d吸取5μl细胞裂解上清与10μllucifersaeassaybufferii(promega)在1.5ml离心管中充分混匀后，在照度计中读数10秒，检测fluc活力；再向离心管中加入10μlstop&gloreagent(promega)充分混匀，再次读数10秒，检测rluc活力。(4)检测数据处理及分析首先计算各样品第一次读数与第二次读数的比值；再将各样品读数比值与shrna#nc组样品读数比值相除，对检测数据进行均一化处理；计算均一化处理后各shrna组样品的均值和方差，均值越小表示该shrna对靶基因的抑制效果越好；应用spss软件以单因素方差分析法比较各shrna处理组之间是否具有显著性差异。结果显示，应用本发明构建的pfluc-c-tk-rluc-shrna重组质粒载体进行单质粒转染方法与传统的三质粒转染方法得到结果较为一致，均提示在待筛选的4条shrna中，shrna#1对靶基因pd1的抑制效果最显著(图11)。通过对两种测定方法的结果比较可以发现，应用单质粒转染方法得到的各组样品的方差均显著低于传统三质粒转染方法，提示本发明提供的单质粒转染方法所得数据的重复性明显优于传统方法。实施例3、应用重组质粒pfluc-c-tk-rluc-shrna筛选有效干涉furin基因的shrna，并与传统三质粒共同转染方法进行对比1、重组质粒pfluc-furin-tk-rluc-shrna的构建(1)以人furin基因orf全长cdna为模板，使用furin-f和furin-r组成的引物对(序列见表1)，在hsdna聚合酶的作用下进行pcr扩增，电泳回收约2.4kbdna片段，该片段的5'和3'端含有15bp与pfluc-c-tk-rluc-shrna和pfluc-c同源的重组短臂，核苷酸序列如seq.id.no.8所示。(2)以限制性内切酶xhoi和bamhi双酶切pfluc-c-tk-rluc-shrna质粒及pfluc-c质粒，回收约7.6kb及5.6kbdna片段。(3)将步骤(1)获得的dna片段和步骤(2)获得的线性化pfluc-c-tk-rluc-shrna质粒及pfluc-c质粒应用easygeno重组克隆试剂盒进行定向重组连接，得到重组质粒pfluc-furin-tk-rluc-shrna和pfluc-furin。(4)将重组质粒pfluc-furin-tk-rluc-shrna和pfluc-furin以测序引物fluc-c-f和sv40polya进行测序。测序结果表明，pfluc-c-tk-rluc-shrna质粒多克隆位点1及pfluc-c质粒多克隆位点均成功插入了furin基因。重组质粒pfluc-furin-tk-rluc-shrna的结构示意图见图12，pfluc-furin的结构示意图见图13。2、五个重组质粒pfluc-furin-tk-rluc-shrna#1/#2/#3/#4/#nc的构建(1)根据人furin基因序列，设计合成四条shrna，命名为furin-shrna#1～#4，具体序列如seq.id.no.9～seq.id.no.12所示。这四条shrna片段的5'端含有xhoi和ecorv酶切位点、3'端含有spei和ecori酶切位点。上述四条shrna片段由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成后，以xhoi和ecori双酶切克隆入pegfp-c1质粒交付使用，重组质粒命名为pegfp-furin-shrna#1/#2/#3/#4，结构示意图见图9。(2)用重组质粒pfluc-furin-tk-rluc-shrna代替pfluc-pd1-tk-rluc-shrna，用含有干涉furin基因shrna片段的pegfp-furin-shrna#1/#2/#3/#4质粒代替含有干涉pd1基因shrna片段的pegfp-pd1-shrna#1/#2/#3/#4质粒，其他同实施例2步骤2的(2)和(3)，得到五个重组质粒pfluc-furin-tk-rluc-shrna#1/#2/#3/#4/#nc。(3)将五个重组质粒pfluc-furin-tk-rluc-shrna#1/#2/#3/#4/#nc以测序引物shrna-f进行测序。测序结果表明shrna序列成功插入到pfluc-furin-tk-rluc-shrna质粒多克隆位点2区域。重组质粒pfluc-furin-tk-rluc-shrna#1/#2/#3/#4/#nc的结构示意图见图14。3、待筛选的shrna对furin基因抑制效果的测定(1)pfluc-furin-tk-rluc-shrna#1/#2/#3/#4/#nc质粒单独转染方法用重组质粒pfluc-furin-tk-rluc-shrna#1/#2/#3/#4/#nc替代pfluc-pd1-tk-rluc-shrna#1/#2/#3/#4/#nc，其他同实施例2步骤3的(1)。(2)传统的三质粒共同转染方法用重组质粒pfluc-furin替代pfluc-pd1，用重组质粒pegfp-furin-shrna#1/#2/#3/#4替代pegfp-pd1-shrna#1/#2/#3/#4，其他同实施例2步骤3的(2)。(3)报告基因检测检测步骤同实施例2步骤3的(3)。(4)检测数据处理及分析数据处理方法同同实施例2步骤3的(4)。传统三质粒转染方法结果显示，相对于shrna#1和shrna#4，shrna#2和shrna#3都对靶基因furin具有显著地抑制作用。但是由于同组内样品数据的波动较大，导致两组数据各自的方差值较高，统计结果显示shrna#2和shrna#3对furin基因的抑制作用并无显著性差异(p＝0.789)(图15)。应用本发明构建的pfluc-c-tk-rluc-shrna重组质粒载体以单质粒转染方法进行shrna筛选实验，能够最大程度地提高同组数据的重复性，准确地反映出shrna#3比shrna#2具有更强的furin基因抑制作用(p<0.001)。以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。核苷酸序列表<110>中国人民解放军第四军医大学<120>一种用于筛选shrna的双萤光素酶报告基因载体及其构建方法和应用<160>12<210>1<211>7698<212>dna<213>人工序列<400>1tagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccg60cgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccatt120gacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtca180atgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgcc240aagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagta300catgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattac360catggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacgggg420atttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacg480ggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgt540acggtgggaggtctatataagcagagctggtttagtgaaccgtcagatccgctagcgtcg600accgccaccatggaagacgccaaaaacataaagaaaggcccggcgccattctatccgctg660gaagatggaaccgctggagagcaactgcataaggctatgaagagatacgccctggttcct720ggaacaattgcttttacagatgcacatatcgaggtggacatcacttacgctgagtacttc780gaaatgtccgttcggttggcagaagctatgaaacgatatgggctgaatacaaatcacaga840atcgtcgtatgcagtgaaaactctcttcaattctttatgccggtgttgggcgcgttattt900atcggagttgcagttgcgcccgcgaacgacatttataatgaacgtgaattgctcaacagt960atgggcatttcgcagcctaccgtggtgttcgtttccaaaaaggggttgcaaaaaattttg1020aacgtgcaaaaaaagctcccaatcatccaaaaaattattatcatggattctaaaacggat1080taccagggatttcagtcgatgtacacgttcgtcacatctcatctacctcccggttttaat1140gaatacgattttgtgccagagtccttcgatagggacaagacaattgcactgatcatgaac1200tcctctggatctactggtctgcctaaaggtgtcgctctgcctcatagaactgcctgcgtg1260agattctcgcatgccagagatcctatttttggcaatcaaatcattccggatactgcgatt1320ttaagtgttgttccattccatcacggttttggaatgtttactacactcggatatttgata1380tgtggatttcgagtcgtcttaatgtatagatttgaagaagagctgtttctgaggagcctt1440caggattacaagattcaaagtgcgctgctggtgccaaccctattctccttcttcgccaaa1500agcactctgattgacaaatacgatttatctaatttacacgaaattgcttctggtggcgct1560cccctctctaaggaagtcggggaagcggttgccaagaggttccatctgccaggtatcagg1620caaggatatgggctcactgagactacatcagctattctgattacacccgagggggatgat1680aaaccgggcgcggtcggtaaagttgttccattttttgaagcgaaggttgtggatctggat1740accgggaaaacgctgggcgttaatcaaagaggcgaactgtgtgtgagaggtcctatgatt1800atgtccggttatgtaaacaatccggaagcgaccaacgccttgattgacaaggatggatgg1860ctacattctggagacatagcttactgggacgaagacgaacacttcttcatcgttgaccgc1920ctgaagtctctgattaagtacaaagg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