催化甲醛合成羟基乙醛的酶及其应用的制作方法

本发明涉及生物
技术领域：
，尤其涉及催化甲醛合成羟基乙醛的酶及其应用。
背景技术：
：自然界中甲基营养菌能够利用碳一资源合成生长所必需的代谢物。甲基营养菌主要有三种途径同化甲醛，分别是核酮糖单磷酸途径(rump)、丝氨酸循环途径和甲醛完全氧化之后的calvin-benson-bassham(cbb)循环途径。在核酮糖单磷酸途径(rump)中，三分子甲醛缩合成一分子丙酮酸，然后脱羧形成乙酰辅酶a和co2，此过程碳利用率为67％。丝氨酸循环途径需要外部供应atp以驱动热力学不利反应。同样，甲醛完全氧化成co2然后利用calvin-benson-bassham(cbb)循环固定co2也需要额外的atp。atp的供应必须消耗额外的碳来驱动氧化磷酸化。存在于clostridiumljungdahlii的还原乙酰辅酶a途径，能够同化甲醛氧化的二氧化碳产生乙酰辅酶a，此过程没有碳的损失。但是由于此路径对氧极其敏感，很难在其他物种中应用。人工合成路径-甲醇缩合循环(mcc)，由核酮糖单磷酸途径(rump)和非氧化性糖酵解(nog)组成，此结合途径既没有碳的损失也不需要atp的供应。甲醛聚糖途径是将三分子甲醛缩合为1,3-二羟基丙酮，1,3-二羟基丙酮磷酸化为dhap(磷酸二羟基丙酮)。此过程中dhap转化为乙酰辅酶a同样有碳的损失。技术实现要素：本发明的一个目的是提供一种bfd突变体蛋白。本发明提供了bfd突变体蛋白，为如下1)-4)中任一所示：1)所示的bfd突变体w86r-n87t的氨基酸序列为将bfd氨基酸序列的第86位的色氨酸突变为精氨酸，且将第87位的天冬酰胺突变为苏氨酸，其他氨基酸残基保持不变，得到的序列；2)所示的bfd突变体w86r-n87t-l109g-l110e为将bfd氨基酸序列的第86位的色氨酸突变为精氨酸，且将第87位的天冬酰胺突变为苏氨酸，且将第109位的亮氨酸突变为甘氨酸，且将第110位的亮氨酸突变为谷氨酸，其他氨基酸残基保持不变，得到的序列；3)所示的bfd突变体w86r-n87t-l109g-l110e-a460m为将bfd氨基酸序列的第86位的色氨酸突变为精氨酸，且将第87位的天冬酰胺突变为苏氨酸，且将第109位的亮氨酸突变为甘氨酸，且将第110位的亮氨酸突变为谷氨酸，且将第460位的丙氨酸突变为甲硫氨酸，其他氨基酸残基保持不变，得到的序列；4)所示的bfd突变体w86r-n87t-l109g-l110e-h281v-q282f-a460m为将bfd氨基酸序列的第86位的色氨酸突变为精氨酸，且将第87位的天冬酰胺突变为苏氨酸，且将第109位的亮氨酸突变为甘氨酸，且将第110位的亮氨酸突变为谷氨酸，且将第460位的丙氨酸突变为甲硫氨酸，且将第281位的组氨酸突变为缬氨酸，且将第282位的谷氨酰胺突变为苯丙氨酸，其他氨基酸残基保持不变，得到的序列。上述bfd氨基酸序列为序列表中序列1。编码上述的蛋白的dna分子也是本发明保护的范围。含有上述dna分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。上述蛋白、上述dna分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在催化甲醛缩合成羟基乙醛或1,3-二羟基丙酮中的应用也是本发明保护的范围；或上述蛋白、上述dna分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备催化甲醛缩合成羟基乙醛或1,3-二羟基丙酮产品中的应用也是本发明保护的范围；或上述蛋白、上述dna分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在催化甲醛生成乙酰辅酶a或乙酰磷酸中的应用也是本发明保护的范围；或上述蛋白、上述dna分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备催化甲醛生成乙酰辅酶a或乙酰磷酸产品中的应用也是本发明保护的范围。上述蛋白和f/xpk蛋白在催化甲醛产生乙酰磷酸中的应用也是本发明保护的范围；或上述蛋白和f/xpk蛋白在制备催化甲醛产生乙酰磷酸产品中的应用也是本发明保护的范围；或上述蛋白、f/xpk蛋白和磷酸乙酰转移酶在催化甲醛产生乙酰辅酶a中的应用也是本发明保护的范围；或上述蛋白、f/xpk蛋白和磷酸乙酰转移酶在制备催化甲醛产生乙酰辅酶a产品中的应用也是本发明保护的范围。本发明另一个目的是提供一种制备羟基乙醛或1,3-二羟基丙酮的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤：以甲醛为底物，用上述蛋白催化甲醛缩合成羟基乙醛或1,3-二羟基丙酮。本发明第三个目的是提供一种利用甲醛生产乙酰辅酶a的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤：在上述蛋白、f/xpk蛋白和磷酸乙酰转移酶的作用下催化甲醛生产乙酰辅酶a。本发明第四个目的是提供一种催化甲醛产生乙酰磷酸的产品。本发明提供的产品，包括上述蛋白和f/xpk蛋白。本发明第五个目的是提供一种催化甲醛产生乙酰辅酶a的产品。本发明提供的产品，包括上述蛋白、f/xpk蛋白和磷酸乙酰转移酶。本发明的实验证明，自然界不存在酶催化甲醛缩合为羟基乙醛或1,3-二羟基丙酮及1,3-二羟基丙酮转化为乙酰磷酸，本发明通过定点突变bfd发现该酶的突变体，突变体能催化甲醛缩合为羟基乙醛，这是首次发现的，实现了甲醛高效聚合，同时利用f/xpk实现了羟基乙醛或1,3-二羟基丙酮(dha)生成乙酰磷酸，结合磷酸乙酰转移酶(pta)，三步酶就能够实现甲醛到乙酰辅酶a，从而创建一条新的甲醛同化途径-甲醛三步合成乙酰辅酶a，此途径路线短，且没有碳损失及atp输入。附图说明图1为pet-28a-bfd、pet-28a-f/xpk质粒图谱。图2为f/xpk蛋白催化羟基乙醛或1,3-二羟基丙酮得到乙酰磷酸。图3为bfd突变体及f/xpk双酶催化甲醛得到乙酰磷酸。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、bfd突变体的制备bfd酶的编码基因种属来源为pseudomonasputida，bfd酶的氨基酸如序列1，bfd酶编码基因的核苷酸序列如序列2所示。分别对bfd酶进行单点突变或者多点突变，得到表1所示的bfd突变体。bfd突变体w86r-n87t为将bfd氨基酸序列(序列1)的第86位的色氨酸(trp)突变为精氨酸(arg)，且将第87位的天冬酰胺(asn)突变为苏氨酸(thr)，其他氨基酸残基保持不变，得到的序列。bfd突变体w86r-n87t的编码基因为将bfd酶编码基因核苷酸序列(序列2)的第256-258位的tgg突变为cgt，且将第259-261位的aac突变为acc，其他碱基保持不变，得到的序列。bfd突变体w86r-n87t-l109g-l110e为将bfd氨基酸序列(序列1)的第86位的色氨酸(trp)突变为精氨酸(arg)，且将第87位的天冬酰胺(asn)突变为苏氨酸(thr)，且将第109位的亮氨酸(leu)突变为甘氨酸(gly)，且将第110位的亮氨酸(leu)突变为谷氨酸(glu)，其他氨基酸残基保持不变，得到的序列。bfd突变体w86r-n87t-l109g-l110e的编码基因为将bfd酶编码基因核苷酸序列(序列2)的第256-258的tgg突变为cgt，且将第259-261的aac突变为acc，且将第325-327的ctg突变为ggg，且将第328-330的ctg突变为gag，其他碱基保持不变，得到的序列。bfd突变体w86r-n87t-l109g-l110e-a460m为将bfd氨基酸序列(序列1)的第86位的色氨酸(trp)突变为精氨酸(arg)，且将第87位的天冬酰胺(asn)突变为苏氨酸(thr)，且将第109位的亮氨酸(leu)突变为甘氨酸(gly)，且将第110位的亮氨酸(leu)突变为谷氨酸(glu)，且将第460位的丙氨酸(ala)突变为甲硫氨酸(met)，其他碱基保持不变，得到的序列。bfd突变体w86r-n87t-l109g-l110e-a460m的编码基因为将bfd酶编码基因核苷酸序列(序列2)的第256-258的tgg突变为cgt，且将第259-261的aac突变为acc，且将第325-327的ctg突变为ggg，且将第328-330的ctg突变为gag，且将第1378-1380位的gct突变为atg，其他碱基保持不变，得到的序列。bfd突变体w86r-n87t-l109g-l110e-h281v-q282f-a460m为将bfd氨基酸序列(序列1)的第86位的色氨酸(trp)突变为精氨酸(arg)，且将第87位的天冬酰胺(asn)突变为苏氨酸(thr)，且将第109位的亮氨酸(leu)突变为甘氨酸(gly)，且将第110位的亮氨酸(leu)突变为谷氨酸(glu)，且将第460位的丙氨酸(ala)突变为甲硫氨酸(met)，且将第281位的组氨酸(his)突变为缬氨酸(val)，且将第282位的谷氨酰胺(gln)突变为苯丙氨酸(phe)，其他氨基酸残基保持不变，得到的序列。bfd突变体w86r-n87t-l109g-l110e-h281v-q282f-a460m的编码基因为将bfd酶编码基因核苷酸序列(序列2)的第256-258的tgg突变为cgt，且将第259-261的aac突变为acc，且将第325-327的ctg突变为ggg，且将第328-330的ctg突变为gag，且将第1378-1380位的gct突变为atg，且将第841-843位的cac突变为gtt，且将第844-846位的cag突变为ttt，其他碱基保持不变，得到的序列。二、表达载体的构建1、表达bfd突变体的载体的构建各个表达bfd突变体的载体为将上述各个bfd突变体的编码基因插入pet-28a载体的ndei和xhoi酶切位点之间得到的载体。表达bfd酶的载体为将上述bfd酶的编码基因(序列2)插入pet-28a载体的ndei和xhoi酶切位点之间得到的载体，命名为pet-28a-bfd(如图1左图)2、表达f/xpk的载体的构建f/xpk基因种属来源为bifidobacteriumadolescentis，f/xpk蛋白的氨基酸如序列3所示，f/xpk蛋白的编码基因的核苷酸序列为序列4。表达f/xpk的载体为将上述f/xpk蛋白的编码基因插入pet-28a载体的ndei和xhoi酶切位点之间得到的载体，命名为pet-28a-f/xpk(如图1右图)。三、bfd野生型、bfd突变体和f/xpk的表达为了体外检测bfd突变体、f/xpk酶活性，在大肠杆菌中对该酶进行外源表达及纯化。(1)将上述二制备的大肠杆菌表达型重组质粒pet-28a-bfd、各个表达bfd突变体的载体、pet-28a-f/xpk分别转入e.colibl21(de3)中，获得表达bfd酶的重组菌、各个表达bfd突变体的重组菌和表达f/xpk的重组菌。采用卡那霉素抗性平板进行阳性克隆筛选(kan+，100mg/ml)，37℃过夜培养；(2)挑单克隆至5mllb液体培养基中(kan+，100mg/ml)，37℃、220r/min培养至od600为0.6-0.8。将5mllb培养基中菌液转接至800ml2yt培养基中(kan+，100mg/ml)，37℃、220rpm培养至od600为0.6-0.8时，降温至16℃，加iptg至终浓度0.5mm，诱导表达16h；(3)将上述培养菌液收集到收菌瓶中，5500rpm离心15min；(4)弃上清，用35ml蛋白缓冲液(50mm磷酸盐缓冲液，ph7.4)将所得菌体沉淀悬起，倒入50ml离心管中，-80℃冰箱保存，得到表达bfd酶的菌体、各个表达bfd突变体的菌体和表达f/xpk的菌体。四、bfd野生型，bfd突变体和f/xpk的纯化(1)破菌：采用高压低温破碎仪，在压力1200bar，4℃条件下分别对表达bfd酶的菌体、各个表达bfd突变体的菌体和表达f/xpk的菌体进行破菌2次。4℃、10000r/min离心45min；(2)纯化：上清液经0.45μm微孔滤膜抽滤，进行镍亲和层析纯化，具体步骤如下：a：柱平衡：挂上清前，先用ddh2o洗2个柱体积，再用蛋白缓冲液平衡ni亲和层析柱1个柱体积；b：上样：将上清按0.5ml/min流速缓慢经过ni亲和层析柱，重复一次；c：洗脱杂蛋白：用蛋白缓冲液冲洗1个柱体积，然后分别用50ml含50mm，100mm咪唑的蛋白缓冲液去洗脱结合较强的杂蛋白；d：洗脱目的蛋白：用20ml含200mm咪唑的蛋白缓冲液(50mm磷酸钾，ph＝7.4，5mmmgso4)将目的蛋白洗脱下来，取前几滴流川样品，制样，12％sds-page检测。(3)换液：将收集到的目的蛋白用50mlamicon超滤管(30kda，millipore公司)离心浓缩(4℃、3400r/min)，浓缩至1ml。加15ml不含咪唑的蛋白缓冲液，浓缩至1ml，重复1次，得到bfd、f/xpk蛋白。(4)用nondrop2000微量分光光度计检测浓缩后蛋白浓度并稀释至10mg/ml，即得到bfd蛋白、各个bfd突变体蛋白和f/xpk蛋白。实施例2、bfd突变体蛋白的功能检测一、bfd突变体蛋白催化甲醛缩合为羟基乙醛和1,3-二羟基丙酮检测方法：将实施例1的三制备的表达bfd酶的重组菌、各个表达bfd突变体的重组菌和表达f/xpk的重组菌于200ml2yt37℃培养至od600＝0.6，0.5mmiptg16℃诱导18h，3500rpm离心15min，蛋白缓冲液洗去培养基，收集菌体，再分别用20ml加入0.5mmtpp的蛋白缓冲液重悬。取500ul重悬菌液再加入500ul由蛋白缓冲液配制含0.5mmtpp的终浓度为5g/l的甲醛溶液，37℃，750rpm反应2h,离心取上清，进行液相检测。液相检测选用aminexhpx-87h,300x7.8mm柱子,5mm硫酸作为流动相，每次进样20ul,柱温箱35℃，200nm紫外条件下检测羟基乙醛和1,3-二羟基丙酮，外标法确定含量。结果如表1所示，可以看出，与未突变的bfd相比，bfd突变体蛋白催化甲醛缩合为1,3-二羟基丙酮产量均提高；与未突变的bfd相比，双突变的bfd突变体中w86r-n87t的羟基乙醛产量最高，4突变的bfd突变体中w86r-n87t-l109g-l110e的羟基乙醛产量最高，5突变的bfd突变体中w86r-n87t-l109g-l110e-a460m的羟基乙醛产量最高，7突变的bfd突变体中w86r-n87t-l109g-l110e-h281v-q282f-a460m的羟基乙醛产量最高，且高于其余突变位点。表1为bfd突变体活性检测二、f/xpk蛋白催化羟基乙醛或1,3-二羟基丙酮得到乙酰磷酸1、检测试剂的配置：2mph7.5盐酸羟胺(100ml)：称取13.5g盐酸羟胺固体溶解于190mlddh2o中，用固体氢氧化钠调节ph至6.5，后用ddh2o定容至200ml。显色液1：15％三氯乙酸(10ml)，称取150mg三氯乙酸溶解于10mlddh2o中。显色液2：4mhcl(10ml)，取3.333ml浓盐酸溶解于ddh2o中定容至10ml。显色液3：5％三氯化铁(10ml)，称取50mg三氯化铁溶解于0.1mhcl中，定容至10ml。2、反应1)f/xpk催化羟基乙醛或1,3二羟基丙酮：实验组：10mm1,3二羟基丙酮或羟基乙醛、50mmtri-cl缓冲液ph7.4、20mmkh2po4、2mg/mlf/xpk、1mmtpp、1mmmgcl2；37℃震荡反应2h，得到反应液。无酶对照：10mm1,3二羟基丙酮或羟基乙醛、50mmtri-cl缓冲液ph7.4、20mmkh2po4、1mmtpp、1mmmgcl2；37℃震荡反应2h，得到反应液。无底物对照：50mmtri-cl缓冲液ph7.4、20mmkh2po4、2mg/mlf/xpk、1mmtpp、1mmmgcl2；37℃震荡反应2h，得到反应液。检测方法：取上述反应液75ul与75ul2mph7.5盐酸羟胺溶液30℃反应10min。后加入显色液1，显色液2，显色液3各50ul。将显色后的反应液12000rpm离心2min，取上清130ul，在505nm下测量(乙酰磷酸)其吸光值。结果见图2，可以看出，上述bfd突变体w86r-n87t-l109g-l110e-h281v-q282f-a460m得到的羟基乙醛或1,3-二羟基丙酮可在f/xpk蛋白催化下获得乙酰磷酸。2)bfd突变体及f/xpk双酶催化甲醛得到乙酰磷酸实验组：3g/l甲醛、50mmtri-cl缓冲液ph7.4、20mmkh2po4、1mg/mlbfd或其突变体、2mg/mlf/xpk、1mmtpp、1mmmgcl2；37℃震荡反应2h，得到反应液。无酶对照：3g/l甲醛、50mmtri-cl缓冲液ph7.4、20mmkh2po4、1mmtpp、1mmmgcl2；37℃震荡反应2h，得到反应液。无底物对照：50mmtri-cl缓冲液ph7.4、20mmkh2po4、1mg/mlbfd或其突变体、2mg/mlf/xpk、1mmtpp、1mmmgcl2；37℃震荡反应2h，得到反应液。检测方法：取上述反应液75ul与75ul2mph7.5盐酸羟胺溶液30℃反应10min。后加入显色液1，显色液2，显色液3各50ul。将显色后的反应液12000rpm离心2min，取上清130ul，在505nm下测量(乙酰磷酸)其吸光值。bfd突变体w86r-n87t-l109g-l110e-h281v-q282f-a460m结果如图3所示，可以看出，上述bfd突变体蛋白与f/xpk蛋白将甲醛催化得到乙酰磷酸。三、乙酰磷酸在pta酶的催化下合成乙酰辅酶a1、pta催化乙酰磷酸生成乙酰辅酶a1mg/mlpta、20mmnh4cl、20mmkcl、1mmtpp、5mmmgcl2、3mm乙酰磷酸(上述二的2中bfd突变体w86r-n87t-l109g-l110e-h281v-q282f-a460m和f/xpk催化甲醛得到的乙酰磷酸)、10mm磷酸钾、2mm辅酶a、50mmph7.5tris-clbuffer，37℃震荡反应0min，10min，得到反应液。检测方法：取反应液100ul加入900ul50mmph7.5tris-clbuffer，于233nm测量其吸光值，结果见表2。表2为乙酰磷酸合成乙酰辅酶a检测数据反应时间od2330min0.64010min1.077计算方法：取反应0min时的od233为e1，反应10min时的od233为e2。乙酰辅酶a与辅酶a的摩尔消光系数之差为△ε。c乙酰辅酶a为乙酰辅酶a的浓度c乙酰辅酶a＝10*(e2-e1)/△ε乙酰辅酶a浓度为0.98mm。2、bfd突变体w86r-n87t-l109g-l110e-h281v-q282f-a460m、f/xpk及pta三酶催化甲醛生成乙酰辅酶a0.2mg/mlbfd突变体w86r-n87t-l109g-l110e-h281v-q282f-a460m、0.2mg/mlf/xpk、0.2mg/mlpta、20mmnh4cl、20mmkcl、1mmtpp、5mmmgcl2、0.1g/l甲醛、10mm磷酸钾、2mm辅酶a、50mmph7.5tris-clbuffer，37℃震荡反应2h，得到反应液。检测方法：取反应液100ul加入900ul50mmph7.5tris-clbuffer，于233nm测量其吸光值.结果见表3。表3为甲醛生成乙酰辅酶a检测数据反应时间od2330min0.033120min0.147计算方法：取反应0min时的od233为ea，反应120min时的od233为eb。乙酰辅酶a与辅酶a的摩尔消光系数之差为△ε。c乙酰辅酶a为乙酰辅酶a的浓度c乙酰辅酶a＝10*(eb-ea)/△ε可以看出，以甲醛为底物得到乙酰辅酶a浓度为0.257mm。野生型bfd催化0.1g/l甲醛，得不到羟基乙醛和1,3-二羟基丙酮，因此野生型bfd与其余两个酶反应检测不到乙酰辅酶a。四、甲醛生物合成乙酰辅酶a途经获得从上述可以看出，甲醛生物合成乙酰辅酶a途经可以为如下两条中任一条：(1)(2)序列表<110>中国科学院天津工业生物技术研究所<120>催化甲醛合成羟基乙醛的酶及其应用<160>4<170>patentinversion3.5<210>1<211>528<212>prt<213>人工序列<220><223><400>1metalaservalhisglythrthrtyrgluleuleuargargglngly151015ileaspthrvalpheglyasnproglyserasngluleupropheleu202530lysasppheprogluasppheargtyrileleualaleuglngluala354045cysvalvalglyilealaaspglytyralaglnalaserarglyspro505560alapheileasnleuhisseralaalaglythrglyasnalametgly65707580alaleuserasnalatrpasnserhisserproleuilevalthrala859095glyglnglnthrargalametileglyvalglualaleuleuthrasn100105110valaspalaalaasnleuproargproleuvallystrpsertyrglu115120125proalaseralaalagluvalprohisalametserargalailehis130135140metalasermetalaproglnglyprovaltyrleuservalprotyr145150155160aspasptrpasplysaspalaaspproglnserhishisleupheasp165170175arghisvalserserservalargleuasnaspglnaspleuaspile180185190leuvallysalaleuasnseralaserasnproalailevalleugly195200205proaspvalaspalaalaasnalaasnalaaspcysvalmetleuala210215220gluargleulysalaprovaltrpvalalaproseralaproargcys225230235240propheprothrarghisprocyspheargglyleumetproalagly245250255ilealaalaileserglnleuleugluglyhisaspvalvalleuval260265270ileglyalaprovalpheargtyrhisglntyraspproglyglntyr275280285leulysproglythrargleuileservalthrcysaspproleuglu290295300alaalaargalaprometglyaspalailevalalaaspileglyala305310315320metalaseralaleualaasnleuvalglugluserserargglnleu325330335prothralaalaprogluproalalysvalaspglnaspalaglyarg340345350leuhisprogluthrvalpheaspthrleuasnaspmetalaproglu355360365asnalailetyrleuasngluserthrserthrthralaglnmettrp370375380glnargleuasnmetargasnproglysertyrtyrphecysalaala385390395400glyglyleuglyphealaleuproalaalaileglyvalglnleuala405410415gluprogluargglnvalilealavalileglyaspglyseralaasn420425430tyrserileseralaleutrpthralaalaglntyrasnileprothr435440445ilephevalilemetasnasnglythrtyrglyalaleuargtrpphe450455460alaglyvalleuglualagluasnvalproglyleuaspvalprogly465470475480ileasppheargalaleualalysglytyrglyvalglnalaleulys485490495alaaspasnleugluglnleulysglyserleuglnglualaleuser500505510alalysglyprovalleuilegluvalserthrvalserprovallys515520525<210>2<211>1584<212>dna<213>人工序列<220><223><400>2atggcttctgttcacggtaccacctacgaactgctgcgtcgtcagggtatcgacaccgtt60ttcggtaacccgggttctaacgaactgccgttcctgaaagacttcccggaagacttccgt120tacatcctggctctgcaggaagcttgcgttgttggtatcgctgacggttacgctcaggct180tctcgtaaaccggctttcatcaacctgcactctgctgctggtaccggtaacgctatgggt240gctctgtctaacgcttggaactctcactctccgctgatcgttaccgctggtcagcagacc300cgtgctatgatcggtgttgaagctctgctgaccaacgttgacgctgctaacctgccgcgt360ccgctggttaaatggtcttacgaaccggcttctgctgctgaagttccgcacgctatgtct420cgtgctatccacatggcttctatggctccgcagggtccggtttacctgtctgttccgtac480gacgactgggacaaagacgctgacccgcagtctcaccacctgttcgaccgtcacgtttct540tcttctgttcgtctgaacgaccaggacctggacatcctggttaaagctctgaactctgct600tctaacccggctatcgttctgggtccggacgttgacgctgctaacgctaacgctgactgc660gttatgctggctgaacgtctgaaagctccggtttgggttgctccgtctgctccgcgttgc720ccgttcccgacccgtcacccgtgcttccgtggtctgatgccggctggtatcgctgctatc780tctcagctgctggaaggtcacgacgttgttctggttatcggtgctccggttttccgttac840caccagtacgacccgggtcagtacctgaaaccgggtacccgtctgatctctgttacctgc900gacccgctggaagctgctcgtgctccgatgggtgacgctatcgttgctgacatcggtgct960atggcttctgctctggctaacctggttgaagaatcttctcgtcagctgccgaccgctgct1020ccggaaccggctaaagttgaccaggacgctggtcgtctgcacccggaaaccgttttcgac1080accctgaacgacatggctccggaaaacgctatctacctgaacgaatctacctctaccacc1140gctcagatgtggcagcgtctgaacatgcgtaacccgggttcttactacttctgcgctgct1200ggtggtctgggtttcgctctgccggctgctatcggtgttcagctggctgaaccggaacgt1260caggttatcgctgttatcggtgacggttctgctaactactctatctctgctctgtggacc1320gctgctcagtacaacatcccgaccatcttcgttatcatgaacaacggtacctacggtgct1380ctgcgttggttcgctggtgttctggaagctgaaaacgttccgggtctggacgttccgggt1440atcgacttccgtgctctggctaaaggttacggtgttcaggctctgaaagctgacaacctg1500gaacagctgaaaggttctctgcaggaagctctgtctgctaaaggtccggttctgatcgaa1560gtttctaccgtttctccggttaaa1584<210>3<211>825<212>prt<213>人工序列<220><223><400>3metthrserprovalileglythrprotrplyslysleuasnalapro151015valsergluglualailegluglyvalasplystyrtrpargalaala202530asntyrleuserileglyglniletyrleuargserasnproleumet354045lysgluprophethrarggluaspvallyshisargleuvalglyhis505560trpglythrthrproglyleuasnpheleuileglyhisileasnarg65707580leuilealaasphisglnglnasnthrvalileilemetglyprogly859095hisglyglyproalaglythralaglnsertyrleuaspglythrtyr100105110thrglutyrpheproasnilethrlysaspglualaglyleuglnlys115120125phepheargglnphesertyrproglyglyileproserhistyrala130135140progluthrproglyserilehisgluglyglygluleuglytyrala145150155160leuserhisalatyrglyalavalmetasnasnproserleupheval165170175proalailevalglyaspglyglualagluthrglyproleualathr180185190glytrpglnserasnlysleuileasnproargthraspglyileval195200205leuproileleuhisleuasnglytyrlysilealaasnprothrile210215220leuserargileseraspglugluleuhisgluphephehisglymet225230235240glytyrgluprotyrgluphevalalaglypheaspasngluasphis245250255leuserilehisargargphealagluleuphegluthrvalpheasp260265270gluilecysaspilelysalaalaalaglnthraspaspmetthrarg275280285prophetyrprometileilepheargthrprolysglytrpthrcys290295300prolyspheileaspglylyslysthrgluglysertrpargserhis305310315320glnvalproleualaseralaargaspthrglualahisphegluval325330335leulysasntrpleuglusertyrlysproglugluleupheaspglu340345350asnglyalavallysprogluvalthralaphemetprothrglyglu355360365leuargileglygluasnproasnalaasnglyglyargileargglu370375380gluleulysleuprolysleugluasptyrgluvallysgluvalala385390395400glutyrglyhisglytrpglyglnleuglualathrargargleugly405410415valtyrthrargaspileilelysasnasnproaspserpheargile420425430pheglyproaspgluthralaserasnargleuglnalaalatyrasp435440445valthrasnlysglntrpaspalaglytyrleuseralaglnvalasp450455460gluhismetalavalthrglyglnvalthrgluglnleusergluhis465470475480glnmetgluglypheleugluglytyrleuleuthrglyarghisgly485490495iletrpsersertyrgluserphevalhisvalileaspsermetleu500505510asnglnhisalalystrpleuglualathrvalarggluileprotrp515520525arglysproilesersermetasnleuleuvalserserhisvaltrp530535540argglnasphisasnglypheserhisglnaspproglyvalthrser545550555560valleuleuasnlyscyspheasnasnasphisvalileglyiletyr565570575pheprovalaspserasnmetleuleualavalalaglulyscystyr580585590lysserthrasnlysileasnalaileilealaglylysglnproala595600605alathrtrpleuthrleuaspglualaargalagluleuglulysgly610615620alaalaglutrplystrpalaserasnvallysserasnaspgluala625630635640glnilevalleualaalathrglyaspvalprothrglngluilemet645650655alaalaalaasplysleuaspalametglyilelysphelysvalval660665670asnvalvalaspleuvallysleuglnseralalysgluasnasnglu675680685alaleuseraspglugluphealagluleuphethrgluasplyspro690695700valleuphealatyrhissertyralaargaspvalargglyleuile705710715720tyraspargproasnhisaspasnpheasnvalhisglytyrgluglu725730735glnglyserthrthrthrprotyraspmetvalargvalasnasnile740745750aspargtyrgluleuglnalaglualaleuargmetileaspalaasp755760765lystyralaasplysileasngluleuglualapheargglngluala770775780pheglnphealavalaspasnglytyrasphisproasptyrthrasp785790795800trpvaltyrserglyvalasnthrasnlysglnglyalaileserala805810815thralaalathralaglyaspasnglu820825<210>4<211>2477<212>dna<213>人工序列<220><223><400>4atgacctctccggttatcggtaccccgtggaaaaaactgaacgcgccggtttctgaagaa60gcgatcgaaggtgttgacaaatactggcgtgcggcgaactacctgtctatcggtcagatc120tacctgcgttctaacccgctgatgaaagaaccgttcacccgtgaagacgttaaacaccgt180ctggttggtcactggggtaccaccccgggtctgaacttcctgatcggtcacatcaaccgt240ctgatcgcggaccaccagcagaacaccgttatcatcatgggtccgggtcacggtggtccg300gcgggtaccgcgcagtcttacctggacggtacctacaccgaatacttcccgaacatcacc360aaagacgaagcgggtctgcagaaattcttccgtcagttctcttacccgggtggtatcccg420tctcactacgcgccggaaaccccgggttctatccacgaaggtggtgaactgggttacgcg480ctgtctcacgcgtacggtgcggttatgaacaacccgtctctgttcgttccggcgatcgtt540ggtgacggtgaagcggaaaccggtccgctggcgaccggttggcagtctaacaaactgatc600aacccgcgtaccgacggtatcgttctgccgatcctgcacctgaacggttacaaaatcgcg660aacccgaccatcctgtctcgtatctctgacgaagaactgcacgagttcttccacggtatg720ggttacgaaccgtacgagttcgttgcgggtttcgacaacgaagaccacctgtctatccac780cgtcgtttcgcggaactgttcgaaaccgttttcgacgaaatctgcgacatcaaagcggcg840gcgcagaccgacgacatgacccgtccgttctacccgatgatcatcttccgtaccccgaaa900ggttggacctgcccgaaattcatcgacggtaaaaaaaccgaaggttcttggcgttctcac960caggttccgctggcgtctgcgcgtgacaccgaagcgcacttcgaagttctgaaaaactgg1020ctggaatcttacaaaccggaagaactgttcgacgaaaacggtgcggttaaaccggaagtt1080accgcgttcatgccgaccggtgaactgcgtatcggtgaaaacccgaacgcgaacggtggt1140cgtatccgtgaagaactgaaactgccgaaactggaagactacgaagttaaagaagttgcg1200gaatacggtcacggttggggtcagctggaagcgacccgtcgtctgggtgtttacacccgt1260gacatcatcaaaaacaacccggactctttccgtatcttcggtccggacgaaaccgcgtct1320aaccgtctgcaggcggcgtacgacgttaccaacaaacagtgggacgcgggttacctgtct1380gcgcaggttgacgaacacatggcggttaccggtcaggttaccgaacagctgtctgaacac1440cagatggaaggtttcctggaaggttacctgctgaccggtcgtcacggtatctggtcttct1500tacgaatctttcgttcacgttatcgactctatgctgaaccagcacgcgaaatggctggaa1560gcgaccgttcgtgaaatcccgtggcgtaaaccgatctcttctatgaacctgctggtttct1620tctcacgtttggcgtcaggaccacaacggtttctctcaccaggacccgggtgttacctct1680gttctgctgaacaaatgcttcaacaacgaccacgttatcggtatctacttcccggttgac1740tctaacatgctgctggcggttgcggaaaaatgctacaaatctaccaacaaaatcaacgcg1800atcatcgcgggtaaacagccggcggcgacctggctgaccctggacgaagcgcgtgcggaa1860ctggaaaaaggtgcggcggaatggaaatgggcgtctaacgttaaatctaacgacgaagcg1920cagatcgttctggcggcgaccggtgacgttccgacccaggaaatcatggcggcggcggac1980aaactggacgcgatgggtatcaaattcaaagttgttaacgttgttgacctggttaaactg2040cagtctgcgaaagaaaacaacgaagcgctgtctgacgaagagttcgcggaactgttcacc2100gaagacaaaccggttctgttcgcgtaccactcttacgcgcgtgacgttcgtggtctgatc2160tacgaccgtccgaaccacgacaacttcaacgttcacggttacgaagaacagggttctacc2220accaccccgtacgacatggttcgtgttaacaacatcgaccgttacgaactgcaggcggaa2280gcgctgcgtatgatcgacgcggacaaatacgcggacaaaatcaacgaactggaagcgttc2340cgtcaggaagcgttccagttcgcggttgacaacggttacgaccacccggactacaccgac2400tgggtttactctggtgttaacaccaacaaacagggtgcgatctctgcgaccgcggcgacc2460gcgggtgacaacgaatg2477当前第1页12