本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种用于治疗阑尾炎的药物，本发明还涉及所述药物的制备方法和应用。
背景技术：
阑尾炎是腹部的常见病、多发病。可发生在任何年龄，但以青壮年为多见，20-30岁为发病高峰。临床上常有右下腹部疼痛、体温升高、呕吐和中性粒细胞增多等表现。是最常见的腹部外科疾病。若不早期治疗，可以发展为阑尾坏疽及穿孔，并发限局或弥漫性腹膜炎。急性阑尾炎有1％以下的死亡率，发生弥漫性腹膜炎后的死亡率为5-10％，近年临床发病率有不断上升的趋势。
现阑尾炎患者，除手术治疗外，一般均采用保守治疗：卧床休息，取半卧位，半流质或流质饮食。药物治疗，多选用广谱抗生素头孢类抗生素氨苄青霉素，或喹诺酮类抗生素，如氧氟沙星等，并加用甲硝唑等。但这些治疗效果都不令人十分满意。因此，仍然存在对提供更多具有治疗阑尾炎活性的药物的需求。
溴结构域和额外末端结构域(bet)蛋白是一种能识别乙酰化赖氨酸残基的蛋白结构域，通过溴结构域抑制干扰bet蛋白质相互作用导致转录程序的调节，转录程序通常与以细胞周期控制、炎症性细胞因子表达、病毒转录、造血分化、胰岛素转录和脂肪生成的调节异常为特征的疾病相关(belkina,a.c.和g.v.denis,“betdomainco-regulatorsinobesity,inflammationandcancer,”natrevcancer12(7):465-77,2012)。bet抑制剂被认为可用于治疗与全身性或组织炎症、对感染或缺氧的炎症反应、细胞活化和增殖、脂质代谢、纤维化相关的疾病或病状以及预防和治疗病毒感染(belkina,a.c.和g.v.denis,“betdomainco-regulatorsinobesity,inflammationandcancer,”natrevcancer12(7):465-77,2012；prinjha,r.k.,j.witherington和k.lee,“placeyourbets:thetherapeuticpotentialofbromodomains,”trendspharmacolsci33(3):146-53,2012)。bet抑制的抗炎和免疫调节作用也已在体内证实。bet抑制剂预防小鼠中内毒素或细菌性败血症诱导的死亡和盲肠结扎穿孔诱导的死亡，从而表明bet抑制剂在败血症和急性炎症性病症中的效用(nicodeme,e.,等人,“suppressionofinflammationbyasynthetichistonemimic,”nature468(7327):1119-23，2010)。bet抑制剂已被证明部分地通过抑制brd4与nf-κb的相互作用来改善hiv-1转基因小鼠(hiv相关肾病的动物模型)中的炎症和肾损伤(zhang,g.,等人,“down-regulationofnf-kappabtranscriptionalactivityinhivassociatedkidneydiseasebybrd4inhibition,”jbiolchem,287(34):8840-51,2012)。
bet抑制剂可用于治疗多种炎症性病状。因此，本发明提供了一种溴结构域抑制剂、包含其的药物组合物及其制备方法，所述溴结构域抑制剂能够治疗多种炎症性疾病，包括阑尾炎、胃炎、肠炎、胰腺炎等。
技术实现要素：
本发明一方面提供一种式i所示的化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体或水合物：
其中：
a各自独立地选自n或cr1，条件是至少有一个a表示n；
r1各自独立地选自：氢、卤素、氰基、羟基、巯基、氨基、c1-c6烷基、c3-c7环烷基、c1-c6烷氧基、c1-c6烷基氨基、芳基、杂环烷基；
r2各自独立地选自：氢、卤素、氰基、羟基、巯基、氨基、硝基、c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、c1-c6烷基氨基；
r3各自独立地选自：氢、卤素、氰基、羟基、巯基、氨基、c1-c6烷基、c3-c7环烷基、c1-c6烷氧基、c1-c6烷基氨基、芳基、杂环烷基；
l表示-(cr4r5)s-，其中每个r4可以相同或者不同、每个r5可以相同或者不同，其各自独立地选自：氢、卤素、羟基、巯基、氨基、c1-c6烷基、c3-c7环烷基、c1-c6烷氧基、c1-c6烷基氨基，s表示1、2、3、4或5；
n表示0、1、2或3；
m表示0、1、2或3；
t表示0、1或2。
在一些实施例中，式i所示的化合物包括以下式ii所示的化合物：
在一些实施例中，式i所示的化合物包括以下式iii所示的化合物：
在一些实施例中，所述化合物为：
本发明另一方面提供一种制备如式i所示的化合物的方法，其包括以下步骤：
其中a、l、r1、r2、r3、n、m、t如上文所述；
x表示卤素，优选氯或溴，特别优选氯；
碱表示氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐或醋酸盐，优选氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾、醋酸钠或醋酸钾，最优选碳酸钾或醋酸钾；
催化剂表示钯催化剂，优选四(三苯基膦)钯或醋酸钯，最优选四(三苯基膦)钯。
在本发明中，卤素表示氯、氟、溴或碘。
烷基表示含有1-6个碳原子的直链或支链饱和烃基。烷基的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基或己基等。
环烷基表示含有3-7个碳原子的饱和环烃。环烷基的实例包括：环丙基、环丁基、环戊基或环己基等。
芳基表示碳环芳基或联芳基。碳环芳基是含有6-18个碳原子优选6-10个碳原子的芳香族环烃。它可以是单环、二环或三环的，例如苯基或萘基等。
杂环烷基表示饱和的单、二或三环烃，并含有一个或多个、优选1-3个选自o、n或s的杂原子。其优选含有3-18个环原子、更优选3-8个环原子。杂环烷基的实例包括：氮杂环丁基、氧杂环丁基、吡咯烷基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、四氢吡喃基、吡唑烷基、咪唑烷基、哌啶基、高哌啶基、吗啉基、硫代吗啉基、哌嗪基或高哌嗪基等。
药学上可接受的盐包括与常规酸形成的酸加成盐，所述酸例如是：无机酸，例如盐酸、硫酸或磷酸；或有机酸，例如脂肪族或芳香族羧酸或磺酸，例如乙酸、三氟乙酸、丙酸、琥珀酸、羟乙酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、马来酸、富马酸、羟基马来酸、丙酮酸、扑酸、甲磺酸、甲苯磺酸、萘磺酸、对氨基苯磺酸或环己基氨基磺酸；还有氨基酸，例如精氨酸和赖氨酸。
本发明的化合物可含有一个或多个手性中心，并且因此作为立体异构体，如对映体或非对映体而存在。
本发明的化合物可作为互变异构体存在并且两种互变异构形式均意图由本发明的范围所涵盖，虽然仅描绘一种互变异构结构。
本发明的水合物是指溶剂分子是水所形成的缔合物。
本发明另一方面提供了一种药物组合物，其包含与一种或多种药学上可接受的辅剂一起配制的至少一种式i的化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体或水合物。这些制剂包括适合用于口服、直肠、局部、经颊和胃肠外(例如，皮下、肌内、皮内或静脉内)施用的那些。
药学上可接受的辅剂包括任意的和所有的溶剂、赋形剂、稀释剂或其它液体媒介物、分散或混悬助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等，它们适合于所希望的特定剂型。本发明描述的药物组合物可以通过药理学领域中已知的任何方法来制备。
用于制备提供的药物组合物的药学上可接受的赋形剂包括惰性稀释剂、分散剂和/或造粒剂、表面活性剂和/或乳化剂、崩解剂、粘合剂、防腐剂、缓冲剂、润滑剂和/或油。诸如可可脂和栓剂蜡、着色剂、包衣剂、甜味剂、矫味剂和芳香剂的赋形剂也可以存在于所述组合物中。
示例性的稀释剂包括碳酸钙、碳酸钠、磷酸钙、磷酸二钙、硫酸钙、磷酸氢钙、磷酸钠乳糖、蔗糖、纤维素、微晶纤维素、高岭土、甘露醇、山梨醇、肌醇、氯化钠、干燥淀粉、玉米淀粉、糖粉等，以及它们的组合。
示例性的造粒剂和/或分散剂包括马铃薯淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉、羟基乙酸淀粉钠、粘土、海藻酸、瓜尔胶、柑橘浆、琼脂、皂粘土、纤维素和木材制品、天然海绵、阳离子交换树脂、碳酸钙、硅酸盐、碳酸钠、交联的聚(乙烯基吡咯烷酮)(交聚维酮)、羧甲基淀粉钠(羟基乙酸淀粉钠)、羧甲基纤维素、交联的羧甲基纤维素钠(交联羧甲纤维素)、甲基纤维素、微晶淀粉、不溶于水的淀粉、羧甲基纤维素钙、月桂基硫酸钠、季铵化合物等，以及它们的组合。
所施用的活性化合物的量可取决于所治疗的受试者、受试者的体重、施用方式以及处方医师的判断。例如，给药时间表可涉及在约1μg至约1000mg的感知剂量下每日或每半日施用包封化合物。在另一个实施方案中，可采用间歇施用包封化合物的剂量。包封有助于可及作用部位并允许同时施用活性成分，从而在理论上产生协同作用。根据标准给药方案，医师将容易地确定最佳剂量，并且将能够容易地修改施用以实现这类剂量。
本发明另一方面提供式i所示的化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体或水合物在制备溴结构域抑制剂中的应用。
本发明另一方面提供式i所示的化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体或水合物在制备抗炎药物中的应用，优选地，所述药物用于治疗阑尾炎、胃炎、肠炎、胰腺炎，最优选地，所述药物用于治疗阑尾炎。
在一些实施例中，式i所示的化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体或水合物与一种或多种抗炎剂组合施用。抗炎剂可包括免疫抑制剂、tnf抑制剂、皮质类固醇类、非类固醇抗炎药、改善疾病的抗风湿药物等。
具体实施方式
在下文中更详细地描述了本发明以有助于对本发明的理解。
所属领域的技术人员将认识到：本发明所描述的化学反应可以用来合适地制备许多本发明的其他化合物，且用于制备本发明的化合物的其它方法都被认为是在本发明的范围之内。例如，根据本发明那些非例证的化合物的合成可以成功地被所属领域的技术人员通过修饰方法完成，如适当的保护干扰基团，通过利用其他已知的试剂除了本发明所描述的，或将反应条件做一些常规的修改。另外，本发明所公开的反应或已知的反应条件也公认地适用于本发明其他化合物的制备。
实施例1：3-[(2h-1,2,3-三唑-2-基)甲基]-6-羟基-5-(6-甲基吡啶-2-基)苯并[d]噁唑-2(3h)-酮(化合物a)
将6-羟基-5-氯苯并[d]噁唑-2(3h)-酮(1.8g，10mmol)、3-溴甲基-2h-1,2,3-三唑(1.8g，11mmol)、碳酸钾(2.8g，20mmol)在乙腈(200ml)中的混合物在70℃搅拌16h，真空除去溶剂，将残余物通过硅胶柱色谱纯化，用石油醚/乙酸乙酯20:1洗脱，得到3-[(2h-1,2,3-三唑-2-基)甲基)-5-氯-6-羟基苯并[d]噁唑-2(3h)-酮，其为橙色固体(2.3g，85％)，esi-ms：267.02[m+h]+。
向干燥的schlenk反应管中加入3-[(2h-1,2,3-三唑-2-基)甲基)-5-氯-6-羟基苯并[d]噁唑-2(3h)-酮(0.26g，1mmol)、6-甲基吡啶-2-基硼酸(0.15g，1.1mmol)、四(三苯基膦)钯(58mg，0.05mmol)、醋酸钾(0.12g，1.2mmol)，在氮气保护下，加入1,4-二氧六环(2ml)、水(0.5ml)，45℃反应4h。反应结束后，减压除去溶剂，硅胶柱色谱分离，用石油醚/乙酸乙酯4:1洗脱，得到3-[(2h-1,2,3-三唑-2-基)甲基]-6-羟基-5-(6-甲基吡啶-2-基)苯并[d]噁唑-2(3h)-酮，其为浅黄色固体(0.26g，81％)。
esi-ms：324.10[m+h]+
元素分析：理论值/实测值，c(59.44/59.64)，h(4.05/3.98)，n(21.66/21.58)，o(14.85/14.80)
1hnmr(400mhz,cdcl3)δ11.29(s,1h),8.36(s,1h),7.66(d,2h),7.35(q,1h),7.21(d,1h),7.14(d,1h),6.72(s,1h),5.43(s,2h),2.51(s,3h)。
实施例2：3-[(2h-1,2,3-三唑-2-基)甲基]-5-(5-苯基嘧啶-2-基)苯并[d]噁唑-2(3h)-酮(化合物b)
将5-氯苯并[d]噁唑-2(3h)-酮(1.7g，10mmol)、3-溴甲基-2h-1,2,3-三唑(1.8g，11mmol)、碳酸钾(2.8g，20mmol)在乙腈(200ml)中的混合物在70℃搅拌16h，真空除去溶剂，将残余物通过硅胶柱色谱纯化，用石油醚/乙酸乙酯25:1洗脱，得到3-[(2h-1,2,3-三唑-2-基)甲基]-5-氯-苯并[d]噁唑-2(3h)-酮，其为淡黄色固体(2.0g，79％)，esi-ms：251.03[m+h]+。
向干燥的schlenk反应管中加入3-[(2h-1,2,3-三唑-2-基)甲基]-5-氯-苯并[d]噁唑-2(3h)-酮(0.25g，1mmol)、5-苯基嘧啶-2-基硼酸(0.22g，1.1mmol)、四(三苯基膦)钯(58mg，0.05mmol)、醋酸钾(0.12g，1.2mmol)，在氮气保护下，加入1,4-二氧六环(2ml)、水(0.5ml)，55℃反应6h。反应结束后，减压除去溶剂，硅胶柱色谱分离，用石油醚/乙酸乙酯3:1洗脱，得到3-[(2h-1,2,3-三唑-2-基)甲基]-5-(5-苯基嘧啶-2-基)苯并[d]噁唑-2(3h)-酮，其为黄色固体(0.26g，69％)。
esi-ms：371.12[m+h]+
元素分析：理论值/实测值，c(64.86/64.98)，h(3.81/3.88)，n(22.69/21.53)，o(8.64/8.45)
1hnmr(400mhz,cdcl3)δ9.29(s,2h),8.05(s,1h),7.82(d,1h),7.65(d,2h),7.42-7.53(m,5h),7.20(d,1h),5.44(s,2h)。
按照类似的方法，合成以下化合物：
生物活性测试实施例：结合单独bet溴结构域的四乙酰化组蛋白h4的抑制
将蛋白质克隆且过度表达为具有n-末端6xhis标签，然后通过镍亲和、接着尺寸排阻色谱法进行纯化。即，用重组表达载体转化大肠杆菌bl21(de3)细胞，所述载体编码来自brd2、brd3、brd4的n-末端镍亲和标记的溴结构域。将细胞培养物在37℃下摇动孵育至适当密度并且用iptg诱导过夜。将溶解细胞的上清液上样至ni-ida柱上用于纯化。级分洗脱蛋白质、浓缩并且通过尺寸排阻色谱法进一步纯化。级分代表单体蛋白的级分、浓缩、等分并且冷冻在-80℃下用于在随后实验中使用。
四乙酰化组蛋白h4与bet溴结构域的结合通过同质时间分辨荧光共振能量转移方法进行确认。将n-末端his标记的溴结构域(200nm)和生物素化的四乙酰化组蛋白h4肽(25-50nm，millipore)在铕穴状化合物标记的链霉亲和素和xl665-标记的单克隆抗-his抗体存在下在白色96孔微量滴定板中孵育。对于抑制测定，将连续稀释的测试化合物以0.2％最终dmso浓度添加至这些反应。一式两份的孔用于每个测试的浓度。最终缓冲液浓度是30mmhepesph7.4、30mmnacl、0.3mmchaps、20mm磷酸盐ph7.0、320mmkf、0.08％bsa。在室温下孵育2小时之后，通过synergyh4板阅读器在665和620nm下测量荧光。通过665nm相对于620nm荧光的降低来显示结合抑制活性。从剂量响应曲线确定ic50值。结果示于以下表1中：
表1：如通过fret测量的四乙酰化组蛋白h4与brd4溴结构域1结合的抑制
通过上述试验结果能够看出，本发明化合物具有非常优异的溴结构域抑制作用，其ic50均低于50nm，因此能够治疗多种炎症性疾病，包括阑尾炎、胃炎、肠炎、胰腺炎等。
以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。