一种检测次氯酸的荧光探针及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种快速检测次氯酸的荧光探针及其制备方法和在光谱测试、细胞成像中的应用，属于有机小分子荧光探针领域。

背景技术：

活性氧(ROS)是生物体内在很多生理和病理过程起着非常重要作用的一些含氧自由基(羟基自由基和超氧阴离子自由基等)和非自由基(次氯酸和次氯酸等)的总称。生物体内在氧化应激、炎症等生理和病理情况下通过酶促和非酶促反应产生各种ROS。近代的生物医学研究表明，体内产生的ROS与一些疾病的发生、发展和机体的老化有着密切的关系。

次氯酸(HClO)属于活性氧的一种，作为一种高效的杀菌剂，在生命的免疫系统中起到重要的作用。细胞内源性的次氯酸主要由白细胞(如单核细胞，嗜酸性细胞，嗜中性粒细胞等)中的髓过氧化物酶/双氧水/氯离子系统来产生。细胞免疫反应产生的次氯酸，但是一旦细胞中次氯酸的浓度发生异常，就会引起包括风湿性关节炎、心血管疾病和癌症在内的多种疾病。正是因为次氯酸具有如此重要的生理和病理学意义，对次氯酸的检测引起了人们的广泛重视。

可用于选择性检测次氯酸/次氯酸盐的方法有很多，如碘量滴定法、比色法、化学发光法、库仑法、极谱法和辐解法等。然而，这些方法往往比较繁琐，一些工作必须在有机介质或有机/水介质中进行，限制其应用。与上述方法相比，荧光探针被认为是生物研究理想的手段，因为荧光检测所需的仪器相对简单，选择性和灵敏度高，检测范围广，响应时间快速，而且检测过程对样品没有破坏，对细胞危害也很小，荧光检测结合显微镜可以提供实时结果。

一个具有应用前景的荧光探针应具有作用前后荧光变化明显、对目标分子响应快、选择性好、合成简单等优点。一般来说，荧光探针由两部分组成：一部分是荧光信号基团，另一部分是识别基团，次氯酸的识别位点有硫醚键、羟胺、苯胺基等。当探针识别目标，化学反应可以被转换成一个光谱信号。近年来，有较多检测活细胞中次氯酸荧光探针的报道，然而存在原料不易得、合成步骤及操作复杂，抗干扰性差，识别位点单一等多方面的问题。因此，发展新的识别位点应用于次氯酸的检测尤为重要，从而为研究细胞病变过程中次氯酸浓度变化情况提供可视化的检测工具。

技术实现要素：

针对目前次氯酸分子荧光探针检测所面临的问题，本发明提供了一种能够抗干扰、快速响应、具有新识别位点的次氯酸荧光探针及其制备方法。

本发明另一目的为提供该荧光探针在检测水溶液中或生物细胞内次氯酸分子的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种检测次氯酸的荧光探针，具有如下式(Ⅰ)所示的结构：

所述的荧光探针的合成路线如下：

所述的荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

(1)将吩噻嗪溶入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，在0℃中缓慢加入氢化钠，搅拌，在室温下加入碘乙烷，搅拌4-8小时，抽滤得到白色沉淀，即N-乙基吩噻嗪；

(2)在0℃下将三氯氧磷缓慢加入干燥的DMF，转移到室温反应2小时，得DMF溶液；将步骤(1)中产物N-乙基吩噻嗪溶解在二氯乙烷中，加入上述DMF溶液中，反应1小时后，升温至80-100℃，继续回流反应12-18小时；反应液用二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥后，柱层析分离得到N-乙基吩噻嗪-2-甲醛；

(3)将N-乙基吩噻嗪-2-甲醛、2-巯基苯胺和焦亚硫酸钠加入含有DMF的反应瓶中，于氮气氛围下加热回流，反应至点板检测原料消失，萃取，浓缩，柱层析分离得到次氯酸荧光探针。

上述荧光探针的合成方法中，步骤(1)中吩噻嗪：碘乙烷的摩尔比为2:2-3；步骤(3)中N-乙基吩噻嗪-2-甲醛：2-羟基苯胺的摩尔比为2:2-3。

上述荧光探针的合成方法中，步骤(2)中回流温度为80-100℃。

所述荧光探针应用于检测次氯酸时，荧光探针本身无荧光或荧光很弱，其与次氯酸反应后，生成具有式(II)的化合物，使荧光发生改变，用于定性检测次氯酸。检测次氯酸溶液时，激发波长为360nm，随着次氯酸含量的逐渐增加，其在440nm处的荧光峰值逐渐增强；检测细胞中次氯酸时，激发波长为405nm，在440nm处有荧光峰值。在一定浓度范围内，荧光强度与次氯酸浓度呈线性正相关，从而实现定量测定次氯酸的浓度。该荧光探针可以应用于水溶液或生物体系中次氯酸的传感检测；所述的传感检测包含荧光检测和细胞成像。

本发明具有以下优点：探针的各合成步骤简单，产物提纯简单；对次氯酸反应的专一性强，抗多种干扰物，实现了次氯酸分子探针的快速检测，灵敏度高，检测限低，线性范围广。基于本发明中次氯酸探针的特异性和显著的颜色变化，其可作为显示水溶液中和生物细胞内次氯酸分子存在的专一性指示剂，可进行实时定性检测和含量传感检测。故而，本发明是一种简单，快速，灵敏的次氯酸分子特异性检测试剂，在生物分子检测领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是实施例一中探针NS-ClO的¹H NMR图谱；

图2是探针NS-ClO荧光强度随HCLO浓度的变化；

图3是探针NS-ClO荧光强度与HCLO浓度的关系；

图4是探针NS-ClO荧光强度随时间的变化；

图5是探针NS-ClO选择性柱状图；

图6是探针NS-ClO应用于细胞中外源性HClO的荧光成像；

图7是探针NS-ClO应用于细胞中内源性HClO的荧光成像。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制，

实施例中化合物的号码对应上述方案中化合物的号码。

实施例1荧光探针NS-ClO的合成。

(1)将化合物1(0.1mmol，201.287mg)溶入2mL DMF中，在0℃中缓慢加入氢化钠(0.15mmol，35.6mg)，搅拌30min后，在室温下加入碘乙烷(0.15mmol，223.95mg)，搅拌6小时，抽滤得到白色沉淀，即化合物2。

(2)将三氯氧磷(2mmol，300mg)在0℃，缓慢加入1mL干燥的DMF中，转移到室温反应2小时。将化合物2(1mmol，229mg)溶解在1mL的二氯乙烷中，加入上述DMF溶液中，反应1小时后，升温至90℃，反应16小时。反应液用二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥后，柱层析提纯，得到化合物3。

(3)将化合物3(2mmol，510mg)、2-巯基苯胺(2mmol，340mg)和焦亚硫酸钠(2mmol，380mg)加入含有15mL DMF的反应瓶中，于氮气氛围下在加热回流5h后，点板检测反应至原料消失，萃取，浓缩，柱层析分离得到探针NS-ClO。产率60％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.05(d,J＝8.1Hz,1H),7.92-7.84(m,1H),7.82(d,J＝2.1Hz,1H),7.51-7.44(m,1H),7.40-7.33(m,1H),7.19-7.10(m,1H),6.97-6.86(m,1H),3.97(q,J＝7.0Hz,1H),1.45(t,J＝7.0Hz,1H)。

实施例2荧光探针NS-ClO荧光强度与HClO浓度的关系。

取实施例1制备的荧光探针NS-ClO溶于DMF中，制成1mmol/L储备液。在含有5％DMF的磷酸盐缓冲溶液(PBS溶液)(0.1mol/L，pH＝7.5)中加入15μL储备液，加入不同浓度(0-2×10^-4μM，即0-20equiv)的NaClO标准溶液(NaClO在中性条件下水溶液中即自发产生酸碱平衡移动而产生HClO，下同)，终体积为3mL，测量其荧光性质(λex＝360nm，光栅宽度为5nm，5nm)，荧光光谱如图2所示，横坐标为波长，纵坐标为相对荧光强度。根据NS-ClO荧光强度随HCLO浓度的变化，以HCLO浓度为横坐标，以荧光强度为纵坐标作图，如图3所示。由图3可知，随着HClO浓度的增加荧光强度逐渐增强，且在0-1×10^-4μM浓度范围内，荧光强度与HClO浓度呈线性正相关。

实施例3荧光探针NS-ClO的荧光强度随时间的变化。

从实施例2中荧光探针储备液中取出15μL加入含有5％DMF的PBS溶液(0.1mol/L，pH＝7.5)中，加入NaClO(2×10^-4μM)标准溶液最终体积为3mL，于0-8min每隔1min分别测量其荧光性质，检测条件如实施例2。荧光光谱如图4所示，横坐标为波长，纵坐标为相对荧光强度。由图4可见，加入探针NS-ClO后，直接加入上述NaClO溶液，随时间在反应1分钟后荧光强度增加迅速达到最大，且荧光强度保持稳定在8分钟以上，实现了HClO的快速检测。

实施例4荧光探针NS-ClO对不同离子的选择性。

从实施例2中荧光探针储备液中取出30μL加入到5mL离心管当中，分别加入等摩尔量的干扰物质标准溶液：谷胱甘肽，L-半胱氨酸，血同型半胱氨酸，氟离子，氯离子，溴离子，羟自由基，过氧亚硝酸离子，过氧化二叔丁基，叔丁基过氧化氢，一氧化氮，过氧化氢，亚硝酸根，钴离子，铜离子，镍离子，其中一个加入等摩尔量的NaClO标准溶液，测试体系溶液体积为3mL，20min后检测溶液的荧光发射光谱变化，如图4所示，其中：1-无添加，2-GSH，3-Cys，4-Hcy，5-F^-，6-Cl^-，7-Br^-，8-·OH，9-ONOO^-，10-DTBP，11-TBHP，12-NO，13-H₂O₂，14-NO₂^-，15-Co⁺，16-Cu²⁺，17-Ni⁺，18-ClO^-，纵坐标为相对荧光强度。由图5可以发现，其他干扰物质对探针NS-ClO的荧光几乎没有影响，而HClO溶液的加入使探针NS-ClO的荧光显著增强。

实施例5荧光探针NS-ClO对细胞中外源性HClO荧光成像。

将荧光探针NS-ClO应用于HeLa细胞中HClO的检测，进行荧光成像，如图6所示，说明此荧光探针能够实现细胞中外源性HClO的检测。具体操作步骤如下：

a)将20μM探针DMF溶液加入到育有HeLa细胞的培养液中在二氧化碳培养箱中培养0.5h，明场成像，如图a)，可以看到细胞大致的轮廓；

b)将a)中细胞用405nm激光激发，得到成像图b)；

c)将图a)和图b)叠加，得图像c)；

d)将20μM探针DMF溶液加入到育有HeLa细胞的培养液中在二氧化碳培养箱中培养0.5h，加入HClO后，明场成像，如图d)，可以看到细胞大致的轮廓；

e)将d)中细胞用405nm激光激发得到成像图e)；

f)将图d)和图e)叠加，得图像f)。

实施例6荧光探针NS-ClO对细胞内源性HClO的细胞成像。

将荧光探针NS-ClO应用于Raw 264.7细胞中对内源性的HClO进行荧光成像，如图7所示，说明此荧光探针可以对细胞中内源性的HClO进行荧光成像。具体操作步骤如下：

a)将20μM探针DMF溶液加入到育有Raw 264.7细胞的培养液中在二氧化碳培养箱中培养0.5h，明场成像，如图a)，可以看到细胞大致的轮廓；

b)将a)中细胞用405nm激光激发得到成像图，得到成像图b)；

c)将图a)和图b)叠加，得图像c)；

d)先将Raw 264.7细胞加入LPS(2μg/mL)和PMA(2μg/mL)孵育2h，再将10μM探针DMF溶液加入到细胞的培养液中，在二氧化碳培养箱中培养0.5h后得到的明场成像，得到成像图d)，可以看到细胞大致的轮廓；

e)将d)中细胞用405nm激光激发得到成像图e)；

f)将图d)和图e)叠加，得图像f)。