一种用磁珠法分离游离DNA的方法及分离试剂盒与流程

本发明涉及一种用磁珠从血清、血浆等无细胞体液中分离游离DNA的方法及分离试剂盒。

背景技术：

游离核酸最早是20世纪40年代两位法国科学家Mandel和Metais最早发现的。他们的研究发表在1947年DE BIOLOGIE DE STRASBOURG杂志上。1997年，YMD Lo等在国际著名医学期刊《柳叶刀》(Lancet)上，报道了在怀有男胎孕妇的外周血中检测到了Y染色体存在，从而证明了孕妇外周血中存在胎儿的游离DNA。随后，相关研究又发现胎儿游离DNA在孕妇外周血中的检出时间，主要与胎龄有关，胎龄越早胎儿成分相对越少。这一发现对孕妇进行无创产前检测具有重要的诊断意义。这对无创诊断提供了一种有效的途径。但血浆中母体来源的DNA占总DNA的比例非常高，一定程度上提高了检测胎儿DNA的难度。目前，游离DNA在临床上主要用于对父源性DNA检测，如SRY基因型鉴定胎儿性别、检测RhD血型及其它父源性遗传性疾病检测。产前诊断最常见的是21三体等非整倍体疾病检测，它要求对染色体拷贝数量进行精确定量，这对于游离DNA来说是个挑战。

目前，提取核酸的商品化的方法主要有硅膜离心柱吸附法和磁珠吸附法。硅膜离心柱吸附方法原理是通过核酸吸附到二氧化硅表面，其它物质如化学物、糖类、蛋白等杂质用洗涤液快速洗去，然后用洗脱液洗脱核酸，该方法简单快速，能有效的去除样本中的各种杂质，获得较纯度较高的DNA，但成本较高，需要多步高速离心，更换离心管，没有高通量的仪器配套，不适合临床大规模样本检测。磁珠法提取核酸是近几年才发展起来的核酸提取方法。其主要原理是在磁珠(主要为铁氧体)表面通过共聚合和表面修饰等引入活性基团，这些活性基团有羟基，羧基，氨基、巯基等，制备成具有磁性的亲和吸附剂，然后与核酸共同孵育后，通过疏水作用、静电作用、离子吸附等原理，使核酸吸附到磁珠表面，经过简单的洗涤，磁分离，得到表面结合有核酸的磁珠复合物，改变试剂pH值等条件可以把核酸从磁珠上洗脱下来。该方法操作简便、快速，获得的核酸纯度高，产量大，目前已有多家公司开发出配套的自动化系统，可以有效地提高工作效率。

目前，商品化的磁珠法游离核酸提取试剂盒操作复杂，需要使用蛋白酶K在37-56℃孵育样本10-30分钟，然后冷却至室温后加入无水乙醇或异丙醇，加入磁珠悬浮液进行混匀，静置5-10分钟，经过一系列漂洗步骤后置于室温晾干10-15分钟。步骤的繁琐性导致其自动化操作程度低，仪器普适性差。因此迫切需要开发操作简便、稳定高效的磁珠法游离核酸提取试剂盒。

技术实现要素：

本发明申请内容涉及生物医学领域，拟申请一种从血清、血浆等无细胞体液中分离游离DNA的方法及提取试剂。

本发明的提取方法步骤包括：1)释放游离核酸并在特定条件下吸附于磁珠表面；2)洗涤去除化学物质和蛋白质等杂质；3)洗脱得到DNA。

本发明提供的游离DNA提取方法，其特征在于：

1)释放核酸所用裂解结合液中含有高浓度的胍盐，可以是盐酸胍、异硫氰酸胍中的一种或两种,胍盐的浓度是1-6M。

2)释放核酸所用裂解结合液中含有1-20％的表面活性剂，该表面活性剂可以是Triton X-100、Tween 20、SDS、SLS、NP-40中的一种或几种；

3)释放核酸所用裂解结合液中含有高浓度的醇类，可以是乙醇、异丙醇、聚乙二醇的一种或多种,醇的浓度是10％-100％；

4)吸附介质是表面修饰的磁珠，修饰基团是羟基，羧基，氨基中的一种或两种；

5)洗涤液中含有高浓度的醇类，可以是乙醇、异丙醇中的一种或两种；醇的浓度是50％-100％

6)洗涤液中含有高浓度的盐，可以是盐酸胍、异硫氰酸胍、氯化锂、柠檬酸钠中的一种或多种；浓度是0.5-5M

7)洗脱时所用洗脱液可以是水，还可以是含有低浓度盐离子的水。盐的浓度是1mM-100mM

本发明提供的提取试剂盒，包括以下几种组份：裂解结合液、洗涤液、洗脱液I、洗涤液II、磁珠、使用说明书。

本发明提供的提取试剂盒，其特征在于：

1)释放核酸所用裂解结合液中含有高浓度的胍盐，可以是盐酸胍、异硫氰酸胍中的一种或两种,胍盐的浓度是1-6M。

2)释放核酸所用裂解结合液中含有1-20％的表面活性剂，该表面活性剂可以是Triton X-100、Tween 20、SDS、SLS、NP-40中的一种或几种；

3)释放核酸所用裂解结合液中含有高浓度的醇类，可以是乙醇、异丙醇、聚乙二醇的一种或多种,醇的浓度是10％-100％；

4)吸附介质是表面修饰的磁珠，修饰基团是羟基，羧基，氨基中的一种或两种；

5)洗涤液中含有高浓度的醇类，可以是乙醇、异丙醇中的一种或两种；醇的浓度是50％-100％

6)洗涤液中含有高浓度的盐，可以是盐酸胍、异硫氰酸胍、氯化锂、柠檬酸钠中的一种或多种；浓度是0.5-5M

7)洗脱时所用洗脱液可以是水，还可以是含有低浓度盐离子的水。盐的浓度是1mM-100mM

本发明所提供的游离DNA提取方法及试剂盒具有简便、快速、得率高、产物纯度高、便宜等优势，适用于从血清、血浆等无细胞体液中快速分离DNA，所得DNA可以直接应用于聚合酶链式反应等分子生物学实验。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例的流程图；

图2为本发明实施例的操作步骤示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

尽管本发明的内容是结合本实例进行说明，但是不能认为是对本发明专利的限制，本发明的范围由所附权利要求书限定。另外，本领域的技术人员在所附权利要求书限定

的范围内对本发明进行各种改动或修饰，这些改动或修饰形式同样属本发明的保护范围。

实施例1试剂成分

裂解结合液：2.8M GuSCN，50mM Tris(pH 7.5)，5％Triton X-100,30％IPA；

洗涤液I：5M LiCl，40％乙醇

洗涤液II：80％乙醇

洗脱液：5mM Tris(pH 8.0),0.5EDTA，DEPC水

实施例2游离RNA提取方法

1)取1.5mL离心管，加入200μL新鲜分离的血浆或血清，加入600μL裂解结合液，加入1mg磁珠振荡混匀。

2)室温放置10min。

3)磁分离，吸去上清。

4)加入800μL洗涤液I，涡旋混匀。

5)磁分离，吸去上清。

6)加入800μL洗涤液II，涡旋混匀。

7)磁分离，吸去上清。

8)开盖，室温干燥5min。

9)加入50μL洗脱液，涡旋混匀。

10)磁分离，收集上清，-20℃或-80℃保存。

在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详细描述的部分，可以参见其他实施例的相关描述。

以上对本发明实施例所提供的内容下载方法及相关设备、系统进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。