本发明属于农业生物有机肥料领域，特别涉及一种简单快速提取微生物发酵有机肥中总DNA的方法及应用。
背景技术：
微生物发酵有机肥料中有60％～80％的微生物目前无法用传统的分离培养技术进行研究，从而阻碍了人们对其微生物结构及其多样性的客观认识。迄今为止，发酵有机肥料中只有极少部分微生物可以被培养，绝大多数还不为人所知。随着分子生物学和细胞生物学技术的发展，发酵有机肥料微生物的研究也深入到了基因和作用机制水平，人们能避开了传统菌的群分离培养过程，直接从DNA水平上对这些菌群进行相关研究，从样品中提取高质量的、具有代表性的菌群总DNA是生物发酵肥料微生物生态学研究的基础。
但是，由于以动物粪便为主的生物肥料不但组成成分复杂(含有多聚糖、胆酸、胆盐、胆色素、腐殖质、动物肠道脱落细胞及碎片、各种无机物和有机物等PCR的强抑制物)，而且粪便中细菌类型数目繁多，而不同细菌因其各自独特的细胞壁成分和结构，又对不同的提取方法的敏感程度有所差异，从而导致了不同方法的提取效率不尽相同，进而使得其菌群多样性分析结果不尽如人意，甚至造成偏差。
目前微生物发酵有机肥样品中总DNA的提取并没有标准、统一的方法，因而，选择较好的DNA提取方法对肥料微生态研究非常关键。目前，国内外常用的DNA提取方法主要包括机械法，如硅珠法、冻融法等；化学法，如SDS法、苯酚法等；酶法如溶菌酶、蛋白酶K等和商业试剂盒法。这几种类型的DNA提取方法中，机械法、化学法及酶或其组合方法是实验室常规提取方法。一般都是先用蛋白酶K、SDS、溶菌酶、超声波或反复冻融来裂解细胞释放出DNA，再用酚-氯仿、玻珠、二氧化硅等进行DNA的抽提，最后无水乙醇沉淀。这几种常规的提取方法的优点是：原理清楚，便于分析及查找实验中出现的问题，而不足之处在于所提取的DNA纯度不高或者得率较低，常含有大量的PCR抑制物，除微生物基因组外，还掺杂动物细胞、食物残渣的基因组DNA及杂质，纯度不够理想，需要进一步纯化处理才能用于后续的实验操作，如用蛋白酶裂解生物发酵有机肥的同时还另外用十六烷基三甲基溴化铵来除去PCR反应抑制物，并且还用酚-氯仿进行了多次的抽提才得到较高纯度的总DNA；在用蛋白酶K提取生物发酵有机肥样品总DNA后，再以聚丙烯酰胺葡聚糖柱子来纯化得到总DNA。
目前虽然有商业的试剂盒，但采用该试剂盒进行提取，所得总DNA浓度、得率低，并且试剂盒价格较昂贵、处理大批样品的科研成本太高，缺乏实验室通用性，不适于用于大规模生物发酵有机肥样品总DNA提取。另外由于专利等其它原因，试剂盒中具体成分及其含量不是很清楚，如果发生操作失败，很难分析找出实验失败原因。因此，需要找到一种新的能快速、高质、高效、廉价及无害提取微生物发酵有机肥中总DNA的方法。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的首先在于提供一种简单快速提取微生物发酵有机肥中总DNA的方法，该方法操作简单、快速、高效、高质，且价格经济，能适用于实验室大规模提取。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种简单快速提取微生物发酵有机肥中总DNA的方法，包括如下进行的步骤：
(1)预处理
取微生物发酵有机肥样品，加入PBS缓冲液、浸泡、离心、收集沉淀，重复上述的操作步骤，至离心后上清液无色，弃上清液，收集沉淀物，记为沉淀物Ⅰ；
(2)提取
在沉淀物Ⅰ中加入蒸馏水，重悬并离心，取上清液，然后向上清液中加入枯草杆菌蛋白酶和SDS溶液的混合液振荡混匀，于45-60℃水浴9-60分钟，离心，弃上清液，记为上清液Ⅰ，收集沉淀物；然后在收集的沉淀物中加裂解液和SDS溶液的混合液，并在温度低于25℃下使DNA复性，再次离心，取上清液，记为上清液Ⅱ，所述上清液Ⅱ中含有总DNA。
本发明的方法主要包括生物发酵有机肥样品的预处理、样品DNA提取。以采集新鲜发酵有机肥样品或冻存的样品为材料，先用PBS缓冲液等对样品进行预处理，以获得样品菌悬液，再分别以枯草杆菌蛋白酶与SDS溶液组成的混合液、裂解液与SDS溶液组成的混合液进行提取，共同裂解细胞释放DNA。
进一步，所述的一种简单快速提取微生物发酵有机肥中总DNA的方法，所述步骤(1)中，第一次加入PBS缓冲液的量相当于所述微生物发酵有机肥样品体积的3-15倍，浸泡不少于5分钟；其后每次在所得沉淀中加入PBS溶液，每200-300mg沉淀添加1-3mL PBS溶液。
优选的，所述步骤(1)中，第一次加入PBS缓冲液的量相当于所述微生物发酵有机肥样品体积的10倍，浸泡15分钟；其后每次在所得沉淀中加入PBS溶液，每200-300mg沉淀添加1mL PBS溶液。
本发明所述的方法，所述步骤(1)中，也可采用其它可实现除杂质及离心分离功能的缓冲液替代PBS缓冲液。
优选的，所述步骤(1)中，离心处理的条件为：4℃，10000转/分钟，离心至少3分钟。
进一步，所述的一种简单快速提取微生物发酵有机肥中总DNA的方法，所述步骤(2)中，在沉淀物Ⅰ中加入蒸馏水，重悬并离心，蒸馏水的加入量按照每200-300mg沉淀物Ⅰ添加1-3mL蒸馏水。
优选的，蒸馏水的加入量按照每200-300mg沉淀物Ⅰ添加1mL蒸馏水。
优选的，所述离心条件为10000转/分钟离心不少于3分钟。
进一步，所述的一种简单快速提取微生物发酵有机肥中总DNA的方法，所述步骤(2)中，所述枯草杆菌蛋白酶和SDS溶液的混合液中枯草杆菌蛋白酶和SDS溶液的体积比2-5：1-3，所述枯草杆菌蛋白酶的初始浓度为20±2mg/ml，所述SDS溶液的初始浓度为0.1-0.2mol/L。
优选的，所述枯草杆菌蛋白酶和SDS溶液的混合液中枯草杆菌蛋白酶和SDS溶液的体积比3：2，所述枯草杆菌蛋白酶的初始浓度为20mg/ml，所述SDS溶液的初始浓度为0.15mol/L。
进一步，所述的一种简单快速提取微生物发酵有机肥中总DNA的方法，所述步骤(2)中，所述上清液Ⅰ与加入的枯草杆菌蛋白酶和SDS溶液的混合液体积比为1：10-20。。
优选的，所述上清液Ⅰ与加入的枯草杆菌蛋白酶和SDS溶液的混合液体积比为1：15。
进一步，所述的一种简单快速提取微生物发酵有机肥中总DNA的方法，所述步骤(2)中，所述裂解液与SDS溶液的体积比为20-50：30，所述SDS溶液的初始浓度为0.1-0.2mol/L。
优选的，所述裂解液与SDS溶液的体积比为40：30，所述SDS溶液的初始浓度为0.15mol/L。
进一步，所述的一种简单快速提取微生物发酵有机肥中总DNA的方法，所述步骤(2)中，所述沉淀物Ⅱ与所述裂解液的体积比为1：10-20。
优选的，所述沉淀物Ⅱ与所述裂解液的体积比为1：15。
进一步，所述的一种简单快速提取微生物发酵有机肥中总DNA的方法，所述步骤(2)中，所述初次离心的条件是：4℃，12000转/分钟，离心10分钟。
进一步，所述的一种简单快速提取微生物发酵有机肥中总DNA的方法，所述步骤(2)中，所述裂解液为Clelex-100。
本发明的目的还在于提供简单快速提取微生物发酵有机肥中总DNA的方法的应用，体现在检测微生物发酵有机肥中的应用、制备检测微生物发酵有机肥的试剂盒中的应用等。
一种检测微生物发酵有机肥的方法，以本发明提取总DNA的方法所得的上清液Ⅱ中总DNA为模板，采用特异性引物进行PCR扩增，所述特异性引物的上游引物16sF如SEQ ID NO：1所示，下游引物16sR如SEQ ID NO：2所示。
优选的，PCR扩增的反应条件：预变性，94℃，5min；变性，94℃45s；退火，56℃45s；延伸，72℃45s，循坏33次；最后72℃延伸10min。
一种检测微生物发酵有机肥的试剂盒，至少包括PCR扩增引物，所述PCR扩增引物的上游引物16sF如SEQ ID NO：1所示，下游引物16sR如SEQ ID NO：2所示。
进一步，所述的一种检测微生物发酵有机肥的试剂盒，还包括枯草杆菌蛋白酶、细胞裂解液和SDS溶液。用于提取微生物发酵有机肥中的总DNA。
进一步，所述的一种检测微生物发酵有机肥的试剂盒，还包括PBS缓冲液。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明的提取微生物发酵有机肥中总DNA的方法，该方法操作简单方便、快速、高效、高质，且价格经济，能适用于实验室大规模提取。
(2)本发明的方法所得的DNA片段较完整、大小约为1500bp，浓度、纯度、得率高，所得DNA可直接作为PCR扩增的模板，以及发酵肥料微生态学等方面的研究。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为DNA电泳检测图：图中编号1为空白对照组，编号2-4为试剂盒法提取的生物发酵有机肥总DNA；编号5-7为常规酚氯仿法提取的生物发酵有机肥总DNA；编号8-10为本发明的方法重复3次平行提取的生物发酵有机肥总DNA；上样量均为5μL。本发明的方法提取的DNA亮度明显高于其余2组。其中M为Marker DL-2000，分子量标准从下至上依次为100bp,250bp,500bp,750bp,1000bp,2000bp。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
实施例1
(1)预处理
称取备用的生物发酵有机肥样于一无菌的离心管A中，用10倍体积的PBS浸泡15分钟(在实践操作中，浸泡时间不少于5分钟，或用其它可实现除杂质及离心分离功能的缓冲液替代PBS缓冲液)。浸泡完成后，于漩涡振荡器上振荡混匀，充分悬浮清洗菌体；混匀的悬液于4℃，500转/分钟，离心10分钟后，去除粗颗粒(低速离心的目的在于去除生物发酵有机肥中的粗颗粒，除了离心之外，也可以采用如过滤等其它方式去除粗颗粒杂质)，将去除粗颗粒后的液体于另一只50mL灭菌离心管内B中，4℃，10000转/分钟，离心6分钟，收集沉淀物Ⅰ于Eppendorf管中。通过重复离心，将离心后得到的沉淀转移200-300mg入2mL灭菌的离心管中。
然后在离心管中加入1mL PBS缓冲液(或用其它可实现除杂质及离心分离功能的缓冲液替代PBS缓冲液)，振荡15秒混匀，10000转/分，离心3分钟，倾去上清，得沉淀，重复此步骤至上清液无异色，倾去上清，得沉淀物Ⅰ。
(2)提取
在沉淀物Ⅰ中加入1mL双蒸水，振荡混匀，10000转/分钟离心3分钟，倾去上清，重复此步骤1次；取出离心管，10000转/分钟离心5分钟后，吸取上清液Ⅰ450μL至另一2mL离心管中，加入30μL初始浓度为0.15mol/L的SDS溶液，20μL枯草杆菌蛋白酶(初始浓度为20mg/mL)，振荡混匀，55℃水浴消化，经实验证实，0.15-1小时均可实现水浴消化的效果。然后4℃，12000转/分钟离心10分钟，弃上清，得沉淀物Ⅱ，沉淀物Ⅱ可用于总DNA的提取；在沉淀物Ⅱ中加裂解液Clelex-100(20-50μL均可)，和30μL初始浓度为0.15mol/L的SDS溶液，浸没沉淀物Ⅱ，置于冰上3分钟，使DNA复性，然后离心2分钟，取上清得上清液Ⅱ，上清液Ⅱ于-20℃保存，测DNA含量备用。
申请人用本发明的方法对同一生物发酵有机肥样品进行了3次的重复提取实验，如图1所示，结果表明本发明方法的多次重复提取的实验效果基本一致，这说明该发明方法非常地稳定，适用于生物发酵有机肥总DNA的大规模提取。
实施例2
对实施例1提取的DNA进行16SrDNA的PCR扩增检测。应用实施例1提取的DNA作为模板，以设计的特异性引物：上游引物为：16sF：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG(SEQ ID NO.1)，其下游引物为：16sR：ACGGCTACCTTGTTACGACTT(SEQ ID NO.2)，扩增生物发酵有机肥微生物16SrDNAV3区。PCR扩增体系如表1所示。
表1 50μL PCR反应体系组成
PCR的反应条件：预变性，94℃，5min；变性，94℃45s；退火，56℃45s；延伸，72℃45s，循坏33次；最后72℃延伸10min。反应产物经有溴化乙锭的1.0％琼脂糖凝胶80V30min电泳检测。
通过分析所得生物发酵有机肥总DNA的浓度、纯度、得率及16SrDNA全长扩增结果表明，本发明所得的DNA片段较完整、大小约为1500bp，浓度、纯度、得率高，所得DNA可直接作为PCR扩增的模板，以及发酵肥料微生态学等方面的研究。
实施例3与现有技术的对比试验
本实施例将本发明的方法与常规方法、试剂盒法提取生物发酵有机肥总DNA进行了比较。为了比较本发明与现有的常规方法和商业试剂盒提取法的平行效果，申请人同时进行了利用本发明方法、常规方法和试剂盒法提取的比较实验。利用常规法从生物发酵有机肥中提取总DNA：按照卢圣栋等编著(参见：现代分子生物学实验技术(第二版)61-62页)记载的方法进行。利用试剂盒法从生物发酵有机肥中提取总DNA：所用试剂盒购自美国omega，试剂盒的商品名称为Stool DNA Kit。上述两种方法使用的生物发酵有机肥样品同本发明相同，所提取的DNA溶于100ml的缓冲液中。本发明的方法按照实施例1进行提取。分别以利用常规方法、试剂盒法和本发明的方法制备的生物发酵有机肥总DNA 1μL作PCR反应的模板，以设计的特异性引物：上游引物为：16sF：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，其下游引物为：16sR：ACGGCTACCTTGTTACGACTT，分别扩增生物发酵有机肥微生物16SrDNA V3区。PCR扩增体系如表1所示，PCR的反应条件参照实施例2。
结果如图1所示。1为空白对照组；2-4为试剂盒法、5-7为常规方法、8-10为本发明方法，扩增结果表明，本发明方法PCR扩增的特异性条带完整，明亮，且较常规方法、试剂盒法更为清晰。
表2.各种方法提取DNA产量
采用本发明方法，常规法和试剂盒法分别从生物发酵有机肥中提取的总DNA结果有较大差别，本发明方法所提得的总DNA产量高(表2)，是常规方法的2.3倍、是试剂盒方法的6.6倍。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
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<120> 一种简单快速提取微生物发酵有机肥中总DNA的方法及应用
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引物16sF
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引物16sR
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