本发明属于嵌合抗原受体领域，具体涉及靶向间皮素的嵌合抗原受体及其用途。
背景技术：
胰腺癌(pancreaticcarcinoma)是临床上常见的消化系统恶性肿瘤，多见于50岁以上的人群。其发病率有明显的地区差异，近年来发病率呈逐渐上升趋势，在欧美国家已是第4位常见的恶性肿瘤，居消化道癌症死因的第2位，仅次于大肠癌,其发病隐匿，早期症状无特异性，手术切除率低。在肿瘤发生发展的进程中，很多基因的活化及其产物的表达起到了重要的作用，其内在确切的分子机制尚不完全明确，随着现代影像及内镜技术的飞速发展，对一些症状体征及影像表现较为明显的胰腺癌，明确诊断己没有太大困难，但此时大多己失去最佳手术时机，而对于一些早期患者诊断较难。因此寻求新的治疗手段，对于胰腺癌的治疗是当务之急。
在肿瘤的浸润转移过程的研究方面，间皮素(mesothelin)也是当前研究的热点。1996年chang等利用宫颈癌hela细胞克隆出单克隆抗体识别的抗原，研究发现该抗原存在于正常间皮细胞，故命名为mesothelin。肿瘤患者术后生存率低预后差的主要原因与它的浸润转移有关，肿瘤的浸润转移机制研究是目前的热点和难点。mesothelin基因编码一种69kda的前体蛋白，经加工形成一个40kda的膜结合蛋白(即mesothelin)和一个3lkda称之为巨核细胞促进因子mpf的脱落片断。间皮素高表达于多种肿瘤组织中，卵巢癌患者血清中的mesothelinmrna和蛋白质水平高表达，组织切片染色显示非粘蛋白卵巢癌中有66％呈间皮素阳性；在胸膜间皮瘤的检测中发现，15例确诊为上皮性间皮瘤的病例全都呈阳性，4例肉瘤性间皮瘤全为阴性；argani等研究报道，切除的原发性胰腺癌中，免疫组化法检测表明60例有54例强阳性，而周围正常胰腺组织则无mesothelin反应活性；在其他实体肿瘤分析中，官颈、头、颈、阴道、肺及食管的鳞癌冰冻切片中均可发现间皮素免疫活性，肺腺癌、子宫内膜癌、交界性滑膜肉瘤及结缔组织增生性小圆细胞肿瘤有少量间皮素表达，在乳腺癌，甲状腺癌、肾细胞癌、膀胱移细胞癌、黑色素癌及肝癌中仅有少许或没有mesothelin表达。mesothelin的生物学功能尚未明确。pastan等构建了一种mesothelin基因突变小鼠，这些基因突变小鼠与同胞的野生型小鼠生长和繁殖相同，并且二者的血小板计数没有统计学差异；有研究显示mesothelin与ca125结合能介导细胞粘附，由此研究者们也认为ca125和mesothelin在卵巢癌的转移扩散中可能起重要作用；另外，有研究亦表明，mesothelin基因的表达受到wnt等重要信号途径的调节，如在卵巢癌和胰腺癌中，wnt信号转导途径持续激活促使mesothelin表达增加。虽然。mesothelin的功能及其致癌作用仍有待于进一步明确，但其在正常组织中的分布有限而在某些肿瘤组织高度表达的特征，因而mesothelin可作为肿瘤特异性抗体治疗的靶向。
嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor-tcell，car-t)t细胞是指经基因修饰后，能以mhc非限制性方式识别特定目的抗原，并且持续活化扩增的t细胞。2012年国际细胞治疗协会年会中指出生物免疫细胞治疗已经成为手术、放疗、化疗外的第四种治疗肿瘤的手段，并将成为未来肿瘤治疗必选手段。嵌合抗原受体(car)是car-t的核心部件，赋予t细胞hla非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，这使得经过car改造的t细胞相较于天然t细胞表面受体tcr能够识别更广泛的目标。car的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原(tumor-associatedantigen，taa)结合区(通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scfv段)，一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号区。目标抗原的选择对于car的特异性、有效性以及基因改造t细胞自身的安全性来讲都是关键的决定因素。
目前在clinicaltrials.gov注册的抗mesothelincar-t细胞治疗临床试验有10项，主要针对胰腺癌、卵巢癌、胸膜瘤、肺癌以及乳腺癌等恶性肿瘤。在宾夕法尼亚大学开展的i期临床研究中，病人都是在接受过一线治疗后病情进一步发展，并且肿瘤组织表达mesothelin，他们接受了瞬转carmrna的t细胞治疗。这种mesothelin特异性的二代car具有cd3ξ和4-1bb共刺激因子结构域。这些mesothelin特异性的cart存活期短，在两位病人中表现出了抗肿瘤作用，可见mesothelin能够作为cart细胞识别的抗原，并且瞬转mrna的方式也是可行的。另一项宾夕法尼亚大学开展的i期临床研究使用的是慢病毒转染的mesothelin特异性car。这项开始于2014年7月的研究是针对耐化疗的恶性胰腺癌、上皮性卵巢癌和恶性上皮胸膜间皮瘤。在6位病人的早期研究结果中，4位病人在cart细胞输注28天后病情稳定。cart细胞输注没有引起急性副反应，并且相比mrna瞬转，慢病毒转染构建的cart细胞的持续性得到提升。
通过临床试验的开展以及对试验结果的分析，研究者们对抗mesothelincar-t细胞治疗方法在应用中的缺陷有了更深刻的认识，从而能进一步开展针对性的研究克服存在的问题。鉴于在实体瘤治疗中，促使car-t细胞最大效率地进入肿瘤组织是取得治疗功效的重要保证。根据胸膜间皮瘤细胞能大量分泌趋化因子ccl2，宾夕法尼亚大学carljune研究小组设计了同时表达ccl2受体ccr2的抗mesothelincar-t细胞，从而通过ccl2/ccr2的作用趋化car-t细胞至肿瘤组织高效发挥杀伤作用。斯隆-凯特琳癌症中心则恶性胸膜瘤中比较了胸腔内输注和系统输注cart细胞的效果，发现胸腔内输注方式能使细胞持续性强，肿瘤内部积聚多，发挥更好的抗肿瘤作用。斯隆-凯特琳癌症中心即将就该种输注方式的安全性进一步开展临床研究。
car-t细胞的一大优点是它们是活性药物，一旦输入，生理机制会调控t细胞的平衡、记忆形成和抗原驱动的扩增。然而，这种治疗尚未完善，t细胞会脱靶而攻击其他的组织，或扩增量过高，超出治疗所需。鉴于car-t细胞已被纳入标准治疗范围，设计病人或药物可控的启动或关闭机制来调控car-t细胞的存在是非常有用的。由于技术原因，关闭机制更易应用于t细胞。作为其中之一，icas9系统正在临床研究当中。细胞在表达icas9时，使用小分子化合物可诱导icas9前体分子形成二聚体，激活凋亡途径，从而实现清除细胞的目的。在移植物抗宿主病中，小分子ap1903已被用于诱导icas9二聚体和清除t细胞，表明了这种方法的可行性(clincancerres.2016apr15；22(8):1875-84.)。
另外，还可利用临床上已经使用的清除性抗体，使car-t细胞同时表达这些抗体针对的蛋白，如tegfr，在治疗相关的毒性反应产生或是治疗已经完成后，通过给予抗体药物清除相应的car-t细胞(scitranslmed2015；7：275ra22.)。
白细胞介素18(interleukin-18),首先作为inf-γ诱导因子，由于其在炎症和免疫应答中的重要作用而被发现。il-18是1995年okamura等在脂多糖诱导的小鼠中毒性休克的肝脏中提取出[nature，1995，378(6552)：88.]，结构及胞内信号转导通路类似于il-1家族，而功能类似于il-12家族的1种蛋白分子。但是与il-12相比，il-18有更强的诱导生成inf-γ的能力。t细胞、nk细胞、树突状细胞、枯否细胞、关节软骨细胞、成骨细胞及滑膜成纤维细胞等均能分泌il-18。一些报道也提到了，癌症细胞也可以分泌il-18。il-18通过与其受体，即il-18r的结合来发挥其作用。il-18受体(il-18r)由异源二聚体组成，即α链(il-18rα)和β链(il-18rβ)。il-18r广泛地存在于多种细胞中，由于其只表达于th1细胞表面，所以可以将il-18r作为区分th1和th22种细胞的表面分子标志。同时，il-18r也在nk细胞和中性粒细胞中表达[interferoncytokineres，2006，26(7)：489.]。
众所周知，il-18有强效的诱导产生inf-γ的能力，它在独立或者有il-12参与的情况下可以激活免疫细胞。il-18通过将ap-1连接到inf-γ启动子区域来直接调节inf-γ启动子的活性，而il-12只有在t细胞cd28联合刺激信号激活后才诱导inf-γ产生[immunol,1998,160(8):3642.]。il-18同样也有激活免疫细胞来对抗病原的作用，它介导的免疫应答可以对抗细菌、病毒和真菌感染，还可以通过激活t细胞及nk细胞来对抗病原。
il-18作为1种免疫激活剂而被熟知，通过il-18激活的nk或者t细胞可以消除自发性肿瘤或者病原感染细胞。il-18在肿瘤移植中通过提高nk细胞的活性进而发挥其抗肿瘤作用，有报道证实了il-18的抗肿瘤作用通过nk细胞来介导。il-18还可以通过抑制血管生成而有效抑制肿瘤细胞生长[biochembiophysrescommun,2006,344(4):1284.]。
本发明对构建的靶向mesothelin的四代car，进行了双重修饰，第一重修饰是引入了安全开关即tegfr结构，它既可以使car-t细胞体内进行很好的被示踪，更重要的是此结构可以作为car-t细胞的安全开关：即不想其发挥作用时可加入妥西单抗，安全有效的控制输注的针对mesothelin靶点的car-t细胞在体内发挥作用；第二重修饰是引入了il18结构，il18是inf-γ的激活剂，有了此结构的加入，构建的car-t细胞将会有更强有力的杀伤功能。所以本发明既在安全性上对car-t细胞进行了修饰又增加了car-t细胞的功能性。为临床实验和临床治疗奠定良好的基础。
随着car-t细胞治疗经验的积累和不断完善，其在实体肿瘤中的应用越来越受到各界关注。在此环境下，我们要加快步伐，利用自身已有的工作基础、研发团队、医疗团队申请开展临床试验，推动car-t细胞治疗在实体瘤的道路上快速前进。
技术实现要素：
本发明第一方面提供一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自：
(1)含有依次连接的抗间皮素单链抗体的编码序列、人cd8α铰链区的编码序列、人cd8跨膜区的编码序列、人cd28胞内区的编码序列、人41bb胞内区的编码序列、人cd3ζ胞内区的编码序列、任选的egfr的含胞外结构域iii和胞外结构域iv的片段的编码序列、和人的il18结构编码序列的多核苷酸序列；和
(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列。
在一个或多个实施方案中，所述多核苷酸序列在所述抗间皮素单链抗体的编码序列前还含有信号肽的编码序列。在一个或多个实施方案中，所述信号肽的氨基酸序列如seqidno:2第1-22位氨基酸所示。在一个或多个实施方案中，所述抗间皮素单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:2第23-128位氨基酸所示。在一个或多个实施方案中，所述抗间皮素单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如seqidno:2第141-259位氨基酸所示。在一个或多个实施方案中，所述人cd8α铰链区的氨基酸序列如seqidno:2第260-306位氨基酸所示。在一个或多个实施方案中，所述人cd8跨膜区的氨基酸序列如seqidno:2第307-328位氨基酸所示。在一个或多个实施方案中，所述人cd28胞内区的氨基酸序列如seqidno:2第329-369位氨基酸所示。在一个或多个实施方案中，所述人41bb胞内区的氨基酸序列如seqidno:2第370-417位氨基酸所示。在一个或多个实施方案中，所述人cd3ζ胞内区的氨基酸序列如seqidno:2第418-528位氨基酸所示。在一个或多个实施方案中，所述egfr的片段含有egfr的胞外结构域iii、胞外结构域iv以及跨膜区，或由egfr的胞外结构域iii、胞外结构域iv以及跨膜区组成。在一个或多个实施方案中，所述egfr的片段含有人egfr的第310-646位氨基酸序列，或由人egfr的第310-646位氨基酸序列组成。在一个或多个实施方案中，所述egfr的片段的氨基酸序列如seqidno:2第577-911位氨基酸所示。在一个或多个实施方案中，所述多核苷酸序列还含有gm-csf受体α链信号肽的编码序列，所述gm-csf受体α链信号肽设置于所述egfr片段的n端。在一个或多个实施方案中，所述gm-csf受体α链信号肽的氨基酸序列如seqidno:2第555-576位氨基酸所示。在一个或多个实施方案中，所述多核苷酸序列还含有连接所述gm-csf受体α链信号肽与所述人cd3ζ胞内区的接头序列的编码序列。在一个或多个实施方案中，所述接头序列的氨基酸序列如seqidno:2第529-554位氨基酸所示。在一个或多个实施方案中，所述il-2信号肽的氨基酸序列如seqidno:2第937-956位氨基酸所示。在一个或多个实施方案中，所述il-18的氨基酸序列如seqidno:2第957-1113位氨基酸所示。
在一个或多个实施方案中，在所述抗间皮素单链抗体的编码序列前的所述信号肽的编码序列如seqidno:1第1-66位核苷酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述抗间皮素单链抗体的轻链可变区的编码序列如seqidno:1第67-384位核苷酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述抗间皮素单链抗体的重链可变区的编码序列如seqidno:1第421-777位核苷酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述人cd8α铰链区的编码序列如seqidno:1第778-918位核苷酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述人cd8跨膜区的编码序列如seqidno:1第919-984位核苷酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述人cd28胞内区的编码序列如seqidno:1第985-1107位核苷酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述人41bb胞内区的编码序列如seqidno:1第1108-1251位核苷酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述人cd3ζ胞内区的编码序列如seqidno:1第1252-1584位核苷酸序列所示。在一个或多个实施方案中，连接所述gm-csf受体α链信号肽与所述人cd3ζ胞内区的所述接头序列的编码序列如seqidno:1第1585-1662位核苷酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述gm-csf受体α链信号肽的编码序列如seqidno:1第1663-1728位核苷酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述egfr的片段的编码序列如seqidno:1第1729-2733位核苷酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述il-2信号肽的编码序列如seqidno:1第2809-2868位核苷酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述il-18的片段的编码序列如seqidno:1第2869-3339位核苷酸序列所示。
本发明第二方面提供一种融合蛋白，所述融合蛋白选自：
(1)含有依次连接的抗间皮素单链抗体、人cd8α铰链区、人cd8跨膜区、人cd28胞内区、人41bb胞内区和人cd3ζ胞内区的融合蛋白和任选的egfr的含胞外结构域iii和胞外结构域iv的片段的编码序列和人的il18结构编码序列；和
(2)在(1)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且保留活化t细胞活性的由(1)衍生的融合蛋白；
优选地，所述抗间皮素单链抗体为抗间皮素单克隆抗体ss1。
本发明第三方面提供一种核酸构建物，所述核酸构建物含有本文所述的多核苷酸序列。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物为载体。在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物为逆转录病毒载体，含有复制起始位点，3’ltr，5’ltr，pis包装信号，酶切位点，土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件，本文所述的多核苷酸序列，以及任选的可选择的标记。
本发明第四方面提供一种逆转录病毒，所述逆转录病毒含有本文所述的核酸构建物，优选含有所述载体，更优选含有所述逆转录病毒载体。
本发明第五方面提供一种基因修饰的t细胞，所述细胞含有本文所述的多核苷酸序列，或含有本文所述的核酸构建物，或感染了本文所述的逆转录病毒，或稳定表达本文所述的融合蛋白和任选的egfr的含胞外结构域iii、胞外结构域iv和任选的跨膜区的片段,或稳定表达本文所述的融合蛋白和任选的il-18片段部分。
本发明第六方面提供一种含本文所述的基因修饰的t细胞的药物组合物。
本发明第七方面提供本文所述的多核苷酸序列、融合蛋白、核酸构建物或逆转录病毒在制备活化的t细胞中的应用。
本发明第八方面提供本文所述的多核苷酸序列、融合蛋白、核酸构建物、逆转录病毒、或基因修饰的t细胞或其药物组合物在制备治疗间皮素介导的疾病的药物中的用途。
在一个或多个实施方案中，所述间皮素介导的疾病为卵巢癌、胸膜间皮瘤、胰腺癌，以及宫颈、头、颈、阴道、肺及食管的鳞癌。在一个或多个实施方案中，所述间皮素介导的疾病为恶性胸膜间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌及肺癌。
附图说明
图1：mscv-meso-tegfr-il18car逆转录病毒表达载体(rv-meso-tegfr-il18)示意图。sp：信号肽；vl：轻链可变区；lk：接头(g4s)3；vh：重链可变区；h：cd8α铰链区；tm：cd8跨膜区；wpre：土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件。
图2：mscv-meso-tegfr-il18car逆转录病毒表达载体(rv-meso-tegfr-il18)的部分测序结果峰值图。
图3为流式细胞仪显示逆转录病毒感染t细胞72小时的meso-tegfr-il18cart表达效率
图4为elisa检测rv-mesocar-tegfr-il18病毒上清和meso-tegfr-il18cart上清中il18量
图5为流式细胞仪显示靶细胞k562-meso细胞mesothelin表达
图6为制备5天的meso-tegfr-il18cart细胞与靶细胞共培养5小时cd107a表达
图7为制备5天的meso-tegfr-il18cart细胞与靶细胞共培养5小时inf-γ的分泌
图8为制备5天的meso-tegfr-il18cart细胞与靶细胞共培养16小时后对肿瘤细胞的杀伤作用
具体实施方式
本发明提供一种靶向间皮素的嵌合抗原受体(car)。该car含有依次连接的抗间皮素单链抗体、人cd8α铰链区、人cd8跨膜区、人cd28胞内区、人41bb胞内区、人cd3ζ胞内区、任选的egfr的含胞外结构域iii和胞外结构域iv的片段和人的il18结构片段。
适用于本发明的抗间皮素单链抗体可衍生自本领域周知的各种抗间皮素单克隆抗体。优选的是，这些单克隆抗体特异性识别间皮素第296到390位氨基酸区段。
因此，在某些实施方案中，适用于本发明的抗间皮素单链抗体含有特异性识别人间皮素的第296到390位氨基酸区段的单克隆抗体的轻链可变区和重链可变区。任选地，所述轻链可变区和重链可变区可通过接头序列连接在一起。可举例的这类单链抗体包括但不限于yp218fv-pe38、yp223和ss1。在某些实施方案中，所述单克隆抗体是ss1。
形成本发明的融合蛋白，如抗间皮素单链抗体的轻链可变区和重链可变区、人cd8α铰链区、人cd8跨膜区、人cd28胞内区、41bb和人cd3ζ胞内区等，相互之间可直接连接，或者可通过接头序列连接。接头序列可以是本领域周知的适用于抗体的接头序列，例如含g和s的接头序列。通常，接头含有一个或多个前后重复的基序。例如，该基序可以是gggs、ggggs、ssssg、gsgsa和ggsgg。优选地，该基序在接头序列中是相邻的，在重复之间没有插入氨基酸残基。接头序列可以包含1、2、3、4或5个重复基序组成。接头的长度可以是3～25个氨基酸残基，例如3～15、5～15、10～20个氨基酸残基。在某些实施方案中，接头序列是多甘氨酸接头序列。接头序列中甘氨酸的数量无特别限制，通常为2～20个，例如2～15、2～10、2～8个。除甘氨酸和丝氨酸来，接头中还可含有其它已知的氨基酸残基，例如丙氨酸(a)、亮氨酸(l)、苏氨酸(t)、谷氨酸(e)、苯丙氨酸(f)、精氨酸(r)、谷氨酰胺(q)等。
应理解，在基因克隆操作中，常常需要设计合适的酶切位点，这势必在所表达的氨基酸序列末端引入了一个或多个不相干的残基，而这并不影响目的序列的活性。为了构建融合蛋白、促进重组蛋白的表达、获得自动分泌到宿主细胞外的重组蛋白、或利于重组蛋白的纯化，常常需要将一些氨基酸添加至重组蛋白的n-末端、c-末端或该蛋白内的其它合适区域内，例如，包括但不限于，适合的接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸等。因此，本发明的融合蛋白(即所述car)的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本文。例如，所述的标签可以是flag，ha，ha1，c-myc，poly-his，poly-arg，strep-tagii，au1，ee，t7，4a6，ε，b，ge以及ty1。这些标签可用于对蛋白进行纯化。
本发明也包括seqidno:2第23-528位氨基酸序列所示的car、seqidno:2第23-911位氨基酸序列所示的car、seqidno:2第1-528位氨基酸序列所示的car或seqidno:2所示的car的突变体。这些突变体包括：与该car具有至少80％，优选至少85％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少97％的序列相同性并保留该car的生物学活性(如活化t细胞)的氨基酸序列。可采用例如ncbi的blastp计算两条比对的序列之间的序列相同性。
突变体还包括：在seqidno:2第23-528位所示的氨基酸序列、seqidno:2第23-911位所示的氨基酸序列、seqidno:2第1-528位所示的氨基酸序列或seqidno:2所示的氨基酸序列中具有一个或数个突变(插入、缺失或取代)、同时仍保留该car的生物学活性的氨基酸序列。所述数个突变通常指1－10个以内，例如1－8个、1－5个或1－3个。取代优选是保守性取代。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行保守性取代时，通常不会改变蛋白质或多肽的功能。“性能相近或相似的氨基酸”包括例如，具有相似侧链的氨基酸残基的家族，这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，在本发明多肽中用来自同一侧链类的另一氨基酸残基替换一个或几个位点，将不会在实质上影响其活性。
本发明包括编码本发明融合蛋白的多核苷酸序列。本发明的多核苷酸序列可以是dna形式或rna形式。dna形式包括cdna、基因组dna或人工合成的dna。dna可以是单链的或是双链的。dna可以是编码链或非编码链。本发明也包括编码融合蛋白的多核苷酸序列的简并变异体，即编码相同的氨基酸序列但核苷酸序列有所不同的核苷酸序列。
本文所述的多核苷酸序列通常可以用pcr扩增法获得。具体而言，可根据本文所公开的核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cdna库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cdna库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次pcr扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。例如，在某些实施方案中，编码本文所述融合蛋白的多核苷酸序列如seqidno:1第67－1584位核苷酸所示，或如seqidno:1第1-1584位核苷酸所示。
在某些实施方案中，本发明的多核苷酸序列还包含编码egfr的片段的核苷酸序列。
适用于本发明的egfr可以是本领域周知的egfr，例如来自人的egfr。egfr含有n末端胞外结构域i和ii，胞外结构域iii，胞外结构域iv，跨膜区，近膜区结构域以及酪氨酸激酶结构域。本发明优选使用截短的egfr(“tegfr”，即本文所述的egfr的片段)，尤其是不包括其胞内区域(近膜区结构域及酪氨酸激酶结构域)的截短的egfr。在某些实施方案中，还可以进一步将不包括胞内区域的egfr进一步截短成不包括胞外结构域i和ii。因此，在某些实施方案中，本发明使用的tegfr含有egfr的胞外结构域iii、胞外结构域iv以及跨膜区，或由egfr的胞外结构域iii、胞外结构域iv以及跨膜区组成。在某些实施方案中，所述tegfr含有人egfr的第310-646位氨基酸序列，或由人egfr的第310-646位氨基酸序列组成，其中第310-480位氨基酸序列为人egfr的胞外结构域iii，第481-620为人egfr的胞外结构域iv，第621-646位氨基酸为人egfr的跨膜区。在某些实施例中，所述tegfr的氨基酸序列的胞外结构域iii和iv如seqidno:2第577-888位氨基酸所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述tegfr的跨膜区序列如seqidno:2第889-911位氨基酸所示。
为促进tegfr的表达，还可在其n端设置前导序列。在某些实施方案中，本发明使用来自gm-csf受体(“gmcsfr”)α链的信号肽。在某些实施方案中，所述信号肽的氨基酸序列如seqidno:2第555-576位氨基酸所示。
除此之外，可通过t2a多肽的编码序列将所述信号肽及tegfr的编码序列与本发明car中人cd3ζ胞内区的编码序列相连。在一个或多个实施方案中，所述t2a肽的氨基酸序列如seqidno:2第529-554位氨基酸所示。
因此，在某些实施方案中，本发明的多核苷酸序列含有本发明car的编码序列、t2a多肽的编码序列、来自gm-csf受体α链的信号肽的编码序列、以及tegfr的编码序列。在某些实施方案中，本发明多核苷酸的序列如seqidno:1第67-2733位核苷酸所示，或如seqidno:1所示。
本发明也涉及核酸构建物，该核酸构建物含有本文所述的多核苷酸序列，以及与这些序列操作性连接的一个或多个调控序列。本发明所述的多核苷酸序列可以多种方式被操作以保证所述融合蛋白(car和/或tegfr)的表达。在将核酸构建物插入载体之前可根据表达载体的不同或要求而对核酸构建物进行操作。利用重组dna方法来改变多核苷酸序列的技术是本领域已知的。
调控序列可以是合适的启动子序列。启动子序列通常与待表达蛋白的编码序列操作性连接。启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。调控序列也可以是合适的转录终止子序列，由宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列与编码该多肽的核苷酸序列的3’末端操作性连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明。调控序列也可以是合适的前导序列，对宿主细胞翻译重要的mrna的非翻译区。前导序列与编码该多肽的核苷酸序列的5′末端可操作连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明。
在某些实施方案中，所述核酸构建物是载体。通常通过可操作地连接本发明的多核苷酸序列至启动子，并将构建体并入表达载体，实现本发明多核苷酸序列的表达。该载体对于复制和整合真核细胞可为合适的。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。
本发明的多核苷酸序列可被克隆入许多类型的载体。例如，可被克隆入质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。进一步地，载体是表达载体。表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如sambrook等(2001，molecularcloning:alaboratorymanual，coldspringharborlaboratory，newyork)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。
通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，wo01/96584；wo01/29058；和美国专利号6,326,193)。
例如，在某些实施方案中，本发明使用逆转录病毒载体，该逆转录病毒载体含有复制起始位点，3’ltr，5’ltr，pis包装信号，酶切位点，土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件，本文所述的多核苷酸序列，以及任选的可选择的标记。所述土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件可增强病毒转录物的稳定性。
合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(cmv)启动子序列。该启动子序列是能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(ef-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(sv40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(mmtv)、人免疫缺陷病毒(hiv)长末端重复(ltr)启动子、momulv启动子、鸟类白血病病毒启动子、eb病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，也可考虑使用诱导型启动子。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够在期限表达时打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，而在当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
为了评估car多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段dna上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。
报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。在dna已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白基因的基因。合适的表达系统是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。
将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。
将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用dna和rna载体。将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。
将多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用病毒载体，特别是逆转录病毒载体，这已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒i、腺病毒和腺伴随病毒等等。已经开发了许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多反转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施方案中，使用慢病毒载体。
因此，在某些实施方案中，本发明还提供用于活化t细胞的逆转录病毒，该病毒含有本文所述的逆转录病毒载体以及相应的包装基因，如gag、pol和vsvg。
适用于本发明的t细胞可以是各种来源的各种类型的t细胞。例如，t细胞可来源于b细胞恶性肿瘤患者的pbmc。
在某些实施方案中，获得t细胞后，可先用适量的(例如30～80ng/ml，如50ng/ml)的cd3抗体刺激活化，然后在含有适量的(例如30～80iu/ml，如50iu/ml)的il2培养基进行培养备用。
因此，在某些实施方案中，本发明提供一种基因修饰的t细胞，该基因修饰的t细胞含有本文所述的多核苷酸序列，或含有本文所述的逆转录病毒载体，或感染了本文所述的逆转录病毒，或采用本文所述的方法制备得到，或稳定表达本文所述的融合蛋白和任选的tegfr。
本发明的car-t细胞可经历稳固的体内t细胞扩展并在血液和骨髓中以高水平持续延长的时间量，并形成特异性记忆t细胞。不希望被任何具体的理论所束缚，在遇到并随后消除表达替代抗原的靶细胞后，本发明的car-t细胞可体内分化成中心记忆样状态。
本发明还包括一类细胞疗法，其中t细胞被基因修饰以表达本文所述的car和任选的tegfr，和car-t细胞被注入需要其的接受者中。注入的细胞能够杀死接受者的肿瘤细胞。不像抗体疗法，car-t细胞能够体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。
由car-t细胞引起的抗肿瘤免疫应答可为主动或被动免疫应答。另外，car介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中car-t细胞诱导对car中的抗原结合部分特异性的免疫应答。
因此，可采用本发明的car、其编码序列、核酸构建物、表达载体、病毒以及car-t细胞治疗的疾病优选为间皮素介导的疾病。
具体而言，本文中，“间皮素介导的疾病”尤其包括各种类型的卵巢癌、胸膜间皮瘤(如上皮性间皮瘤)、胰腺癌，以及宫颈、头、颈、阴道、肺及食管的鳞癌。在某些实施方案中，所述间皮素介导的疾病为恶性胸膜间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌及肺癌。
本发明的car-修饰的t细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如相关的细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的car-t细胞，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如edta或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。
本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度。
当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的t细胞的药物组合物可以以104至109个细胞/kg体重的剂量，优选105至106个细胞/kg体重的剂量。t细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如rosenberg等，neweng.j.ofmed.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。
对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方案中，本发明的t细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方案中，本发明的t细胞组合物优选通过静脉注射施用。t细胞的组合物可被直接注入肿瘤、淋巴结或感染位置。
在本发明的一些实施方案中，本发明的car-t细胞或其组合物可与本领域已知的其它疗法结合。所述疗法包括但不限于化疗、放疗和免疫抑制剂。例如，可结合本领域周知的治疗间皮素介导的疾病的放疗或化疗制剂进行治疗。
本文中，“抗肿瘤效应”指一种生物学效应，其可由肿瘤体积的减少、肿瘤细胞数的减少、转移数的减少、预期寿命的增加或与癌相关的各种生理症状的改善表示。
“患者”、“对象”、“个体”等等在本文中可交换使用，指可引起免疫应答的活有机体，如哺乳动物。例子包括但不限于人、狗、猫、小鼠、大鼠和其转基因物种。
本发明采用抗间皮素抗体(具体是衍生自ss1的scfv)的基因序列，本发明全基因合成嵌合抗原受体mesothelinscfv-cd8h&tm-cd28-41bb-cd3ζ-tegfr-il18的基因片段，插入到逆转录病毒载体mscv,空载体mscv，其可以用于重组引入目的核酸序列，即编码car的核酸序列。重组质粒在293t细胞中包装病毒，感染t细胞，使t细胞表达该嵌合抗原受体。在本发明的一个实施方案中，实现嵌合抗原受体基因修饰的t淋巴细胞的转化方法是基于逆转录病毒转化方法。该方法具有转化效率高，外源基因能够稳定表达，且可以缩短体外培养t淋巴细胞到达临床级数量的时间等优点。在该转基因t淋巴细胞表面，转化的核酸通过转录、翻译表达在其上。本发明所获得的表达car的逆转录病毒通过retronectin法制备car-t细胞，制备3天后的car-t细胞用流式检测car的感染效率，elisa检测cart细胞上清il18分泌，制备5天后car-t细胞在体外与mesothelin阳性的肿瘤细胞(k562-mesothelin)共培养5小时检测cd107a表达和inf-γ的分泌，制备5天后car-t细胞在体外与mesothelin阳性的肿瘤细胞(k562-meso)共培养16小时检测car-t细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤作用(细胞毒性)。因此本发明所述mesothelin-tegfrcart-il18可在间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌等治疗中得到应用。更进一步地，本发明的car还携带tegfr组件，该组件的空间构象可与药物级别的抗egfr单克隆抗体西妥昔单抗紧密结合，可以作为细胞表面的标记，同时也适合t细胞的体内追踪(可通过流式和免疫组化检测)；也可以在体内被妥西单抗(cetuximab)清除，即不希望本发明的car发挥作用时可加入妥西单抗，安全有效的控制该car-t细胞在体内发挥作用。因此，本发明的car还具有体内示踪和安全开关的作用。
本发明通过参考以下实验实施例进一步详细地进行描述。这些实施例仅出于说明性的目的提供，并不意欲为限制性的，除非另有规定。因此，本发明决不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为包括由于本文提供的教导变得显而易见的任何和全部的变化。实施例中所用的方法和试剂，除非另有说明，否则为本领域常规的方法和试剂。
实施例中所用的nt细胞为与实施例4相同来源的未转染的t细胞，用作对照细胞。k562细胞来源于atcc细胞库，为阴性表达间皮素的细胞，用作对照细胞。k562-mesothelin细胞(简称，k562-meso)是经遗传工程手段使其高表达间皮素的k562稳定细胞株。
实施例1：mesocar-tegfr-il18基因序列的确定
从ncbi网站数据库搜索到人的il18成熟肽序列信息，序列在网站http://sg.idtdna.com/site上进行密码子优化，保证在编码氨基酸序列不变的情况下更适合人类细胞表达。
各基因核苷酸和氨基酸序列信息见(sequnceidno.1-2)
将上述序列依次进行连接，在各序列连接处引入不同酶切位点，形成完整的mesothelincar-tegfr-il18基因序列信息，本专利中简称mesocar-tegfr-il18。
实施例2：包含car分子的核酸序列的病毒载体的构建
将实施例1中制备的car分子的核苷酸序列经noti(neb)和ecori(neb)双酶切、经t4连接酶(neb)连接插入逆转录病毒rv载体的noti-ecori位点，转化到感受态e.coli(dh5α)，将重组质粒送上海生工生物技术有限公司进行测序，将测序结果与拟合成的mesocar-tegfr-il18序列比对来验证序列是否正确。测序引物为：
正义序列:agcatcgttctgtgttgtctc(sequnceidno.3)
反义序列:tgtttgtcttgtggcaatacac(sequnceidno.4)
经测序正确后，使用qiagen公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，纯化质粒的质粒磷酸钙法转染293t细胞进行逆转录病毒包装实验。
本实施例所构建得到的质粒图谱如图1所示。图2显示该逆转录病毒表达质粒的部分测序结果峰值图。
实施例3：逆转录病毒包装
1.第1天293t细胞应是小于20代，不过分长满的。以0.6*10^6cells/ml铺板，10cm皿添加10ml的dmem培养基，充分混匀细胞，37度培养过夜。
2.第2天293t细胞融合度达到90％左右进行转染(通常是铺板14-18h左右)；准备质粒复合物，各种质粒的量为retrobackbone(mscv)为12.5ug，gag-pol为10ug，vsvg为6.25ug，cacl2250ul，h2o为1ml总体积为1.25ml；在另一个管里添加跟质粒复合物等体积的hbs，边加质粒复合物边涡旋震荡20s。温柔地将混合物沿着边加入到293t皿中，37度培养4h，去除培养基，pbs洗一遍，重新加入预热的新鲜培养基。
3.第4天：转染48h后收集上清并用0.45um滤器过滤后分装保存于-80度，继续添加预热的新鲜dmem培养基。
实施例4：逆转录病毒感染人的t细胞
1.用ficcol分离液(天津灏洋)分离获得较纯的cd3+t细胞，用含5％ab血清x-vivo(lonza)培养基调整细胞密度为1×106/ml。将细胞以1ml/孔接种到预先用抗人50ng/mlcd3抗体(北京同立海元)和50ng/mlcd28抗体(北京同立海元)，再加入100iu/ml的白细胞介素2(北京双鹭)，刺激培养48小时后病毒感染；
2.t细胞活化培养后隔天，pbs稀释至终浓度为15μg/ml的retronectin(takara)包被non-tissuetreated培养板，24孔板每孔250μl。避光，4℃过夜备用。
3.t细胞活化培养两天后，取出2块包被好的24孔板，吸弃包被液，加入含2％bsa的hbss室温封闭30min。封闭液体积为每孔500μl，吸弃封闭液，用含2.5％hepes的hbss洗板两次。
4.病毒液加入孔内，每孔加2ml病毒液，32℃，2000g，离心2h。
5.弃去上清液，24孔板每孔加入活化后的t细胞1×106个，体积1ml，培养基为t细胞培养基中添加il-2200iu/ml。30℃，1000g，离心10min。
6.离心完毕后，将培养板置于37℃，5％co2培养箱中培养。
7.感染后24h，将细胞悬液吸出，1200rpm，4℃，离心7min。
8.细胞感染后，每天观察细胞的密度，适时补加含il-2100iu/ml的t细胞培养液，使t细胞的密度维持在5×105/ml左右，使细胞扩增。
由此获得分别感染了实施例3所示逆转录病毒的cart细胞，分别命名为meso-tegfrcart细胞和meso-t-il18cart细胞。
实施例5：流式细胞仪检测感染后t淋巴细胞的比例及表面car蛋白的表达
分别离心收集感染后72小时的car-t细胞和nt细胞(对照组)，pbs洗涤1次后弃上清，加入相应的抗体避光30min后pbs洗涤，重悬，最后流式细胞仪检测。car+由anti-mouseiggf(ab')antibody(jacksonimmunoresearch)和apc-egfr抗体检测。
图3显示，使用实施例3制备得到的逆转录病毒感染t细胞72小时后，meso-t-il18car+的表达效率为40％。
实施例6：elisa检测car-t细胞上清中il18含量
取病毒上清和病毒感染后72小时的car-t细胞上清，按照humaninterleukin-18(huil-18)elisakit(invitrogen)的操作说明书检测各病毒上清(mesothelin-tegfr,mesothelin-tegfr-il18,mesothelin-tegfr-il15d)以及各cart细胞(mesothelin-tegfr,mesothelin-tegfr-il18,mesothelin-tegfr-il15d)上清液中il18的含量。
本实施例的结果在图4中显示，mesothelin-tegfr-il18病毒液上清il18的含量为13000pg/ml，mesothelin-tegfr-il18cart细胞上清il18的含量为3500pg/ml。
实施例7：car-t细胞与靶细胞共培养后cd107a表达检测
1.取一块v底96孔板，每孔加cart/nt细胞2*105个和靶细胞(k562-meso)/对照细胞(k562)2*105个，重悬于100ul不含il-2的x-vivo完全培养基，加入bdgolgistop(含monesin，每1ml培养基中加入1μlbdgolgistop)，每孔加入2ulcd107a抗体(1:50)，37℃孵育5小时，收集细胞。
2.将样品离心去除培养基，pbs洗细胞一次，400g，4℃离心5分钟。弃上清，每管加入适量特异性表面抗体(cd107a抗体，biolegend)，重悬体积100ul，冰上避光孵育30分钟。
3.每管用3ml的pbs清洗细胞1次，400g离心5分钟。仔细吸去上清。
4.适量pbs重悬，流式细胞仪检测cd107a。
结果显示在图6中。图6显示，meso-tegfr-il18cart细胞cd107a表达率为26.9％。
实施例8：car-t细胞与靶细胞共培养后inf-γ分泌检测
1.取制备好的car-t细胞，重悬于lonza培养基中，调整细胞浓度为1×106/ml。
2.实验组每孔含靶细胞(k562-meso)或阴性对照细胞(k562)2×105个，car-t细胞2×105个，200μl不含il-2的lonza培养基。充分混匀后加入96孔板中。同时加入bdgolgiplug(含bfa，每1ml细胞培养基中加入1μlbdgolgiplug)，充分混匀后，37℃孵育5-6小时。收集细胞，作为实验组。
3.每管用1ml的pbs清洗细胞1次，300g离心5分钟。弃上清，每管加入适量特异性表面抗体car、cd3、cd4、cd8，重悬体积100ul，冰上避光孵育30分钟。
4.pbs洗细胞后，加入250μl/ep管fixation/permeabilizationsolution，4℃孵育20分钟以固定细胞及破膜。用1×bdperm/washtmbuffer清洗细胞2次，1ml/次。
5.进行胞内因子染色，取适量ifn-γ细胞因子荧光抗体或阴性对照，用bdperm/washtmbuffer稀释至50μl。用此抗体稀释液充分重悬已固定破膜的细胞，4℃避光孵育30min，1×bdperm/washtmbuffer1ml/次清洗细胞2次，然后用pbs重悬。
6.流式细胞仪检测。
结果显示在图7中。图7显示，meso-tegfr-il18cart细胞inf-γ表达率为47.3％。
实施例9：car-t细胞与靶细胞共培养后检测肿瘤特异性细胞杀伤作用
1.k562细胞(阴性对照细胞)重悬在无血清培养基(1640)中，调整细胞浓度为1×106/ml，加入荧光染料bmqc(2,3,6,7-tetrahydro-9-bromomethyl-1h,5hquinolizino(9,1-gh)coumarin)至终浓度为5μm。
2.混匀，37℃孵育30min。
3.室温，1500rpm离心5min，弃上清，并重悬细胞于细胞毒性培养基(无酚红1640+5％ab血清)中，37℃孵育60min。
4.新鲜细胞毒性培养基清洗细胞两遍，并重悬在新鲜细胞毒性培养基中，密度1×106/ml。
5.靶细胞(k562-meso)悬浮在含有0.1％bsa的pbs中，调整浓度为1×106/ml。
6.加入荧光染料cfse(carboxyfluoresceindiacetatesuccinimidylester)至终浓度为1μm。
7.混匀，37℃孵育10min。
8.孵育结束后，加入与细胞悬液等体积的fbs，室温孵育2min以终止标记反应。
9.清洗细胞并重悬在新鲜细胞毒性培养基中，密度1×106/ml。
10.清洗效应t细胞并悬浮在细胞毒性培养基中，调整浓度为5×106/ml。
11.在所有的实验中，car-t细胞的细胞毒性和未感染的阴性对照效应t细胞(nt)的细胞毒性做比较。
12.car-t和nt，按照效应细胞：靶细胞＝5:1，1:1，的比例，于5ml无菌试验管(bdbiosciences)进行培养，每组设置两复孔。每一个共培养组中，靶细胞50,000个(50μl)，阴性对照细胞为50,000个(50μl)。同时设置一组只包含靶细胞和阴性对照细胞。
13.将共培养细胞置于37℃孵育16h。
14.孵育完成后，pbs清洗细胞，然后立即按照说明书推荐的浓度快速加入7-aad(7-aminoactinomycind)，冰上孵育30min。
15.不需清洗，直接进行流式上机检测，数据用flowjo进行分析。
16.分析使用7aad阴性的活细胞设门，测定t细胞和靶细胞共培养后活的u266靶细胞和活的k562阴性对照细胞的比例。
17.对于每一组共培养的t细胞和靶细胞
18.细胞毒性杀伤细胞％＝100-校准的靶细胞存活％，即(无效应细胞时靶细胞活细胞数-含效应细胞时靶细胞活细胞数)/对照细胞活细胞数的比例。
结果显示在图8中。结果显示，在效靶比为5:1情况下，meso-tegfr-il18cart细胞对k562-meso细胞的杀伤率为45％。
序列表
<110>上海恒润达生生物科技有限公司
<120>靶向mesothelin的嵌合抗原受体并对其双重修饰的方法和用途
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>3339
<212>dna
<213>人工序列
<400>1
atggacttccaggtgcagatttttagttttcttttgatctccgccagcgtgataatgtca60
cgaggagatatagagctcacccagagtcccgcaatcatgtcagcctctcccggcgaaaaa120
gtgaccatgacctgtagtgcttccagttctgttagttatatgcactggtatcaacagaag180
tccgggacaagtcctaaacgctggatttatgacacttccaaactggcttctggagtgcct240
gggcggttcagcgggagcggttccggtaactcttacagcctgaccatctcttcagtcgaa300
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ggccacgacggactgtaccaggggctgagtacagcaacaaaagacacctatgacgctctg1560
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aatggcataggcattggcgagtttaaagattctctgagcataaatgctacgaatattaag1800
catttcaagaattgtacttctattagtggcgacctccatattcttccggttgccttcagg1860
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