本发明属于生物技术领域，涉及一种羰基还原酶突变体及其编码基因和应用。
背景技术：
阿托伐他汀钙商品名立普妥(lipitor)，是重要的降胆固醇类药物。其(3r,5r)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯(分子式为c(ch3)3ococh2ch(oh)ch2ch(oh)ch2cn)，带有两个具有手性结构的羟基，是合成阿托伐他汀钙的关键手性中间体，它具有能够强效抑制羟甲基戊二酰单酰辅酶a(hmg-coa)还原酶的活性，阻断hmg-coa还原成羟甲戊酸的关键结合部位，能够大幅度的降低胆固醇，可有效改善动脉粥样硬化。阿托伐他汀钙的关键手性中间体其合成方法有多种，常见的方法主要有化学法和酶法，与化学法相比，酶法具有反应条件温和、常温、常压、副反应少、成本低、设备要求低，且反应转化效率高等多种优点，获得了企业的广泛青睐，具有很好的工业应用前景。
技术实现要素：
本发明提供了一种解决酶催化效率低，反应后处理难的问题，提供一种具有催化效率高、后处理容易的重组羰基还原酶，以及含有该羰基还原酶基因的重组表达载体和基因工程菌，以及其重组酶的制备方法，以及利用该重组酶不对称催化制备光学活性手性醇，特别是催化合成阿托伐他汀钙药物重要手性中间体((3r,5r)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的方法。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
一种羰基还原酶突变体基因，核苷酸序列如seqidno.1所示。其野生型基因序列来自假丝酵母candidamagnoliaeadh3(genbank:abb91667.1)，经过致突变pcr方法对其进行突变得到。
本发明所述的羰基还原酶基因编码的羰基还原酶，氨基酸序列如seqidno.2所示。
含有本发明所述的羰基还原酶突变体基因的重组表达载体。其可通过dna重组技术将羰基还原酶基因的核苷酸序列连接于到各种表达载体(pet、pgex系列)上构建而成，更优选地选自pet系列。本发明的一个实施例中所使用的质粒为pet-24a。
一种生产权利要求2所述的羰基还原酶突变体的基因工程菌，所述基因工程菌中包含本发明所述的羰基还原酶突变体基因。
所述基因工程菌的宿主细胞优选大肠埃希氏菌(escherichiacoli)bl21(de3)。将前述重组表达质粒转化至大肠埃希氏菌(escherichiacoli)bl21(de3)中，即可得到本发明优选的基因工程菌。
本发明构建羰基还原酶突变体基因工程菌的方法包括羰基还原酶突变体文库的建立；将突变体文库进行酶切；将经酶切后的文库连接插入到载体中；构建表达载体；通过高通量筛选获得酶活较高的重组基因工程菌。
一种所述的羰基还原酶突变体的制备方法，包括如下步骤：培养本发明所述的基因工程菌，获得重组表达的羰基还原酶。
本发明所述的制备方法，其发酵罐培养的发酵条件优选：溶氧35-45％，空气流量1:1.5vvm。本发明所述的羰基还原酶突变体在催化制备手性醇中的应用，以所述的羰基还原酶为催化剂不对称还原羰基类化合物制备光学活性手性醇；优选以所述的羰基还原酶为催化剂催化还原2-氧代-4-苯基丁酸乙酯制备(r)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯。
有益效果：
本发明提供一种具有催化效率高、后处理容易的羰基还原酶突变体。利用该羰基还原酶突变体不对称催化制备光学活性手性醇，特别是催化合成阿托伐他汀钙药物重要手性中间体((3r,5r)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯活性明显提高了10-20倍。
具体实施方式
实施例1基因工程菌的建立
根据genebank公布的假丝酵母candidamagnoliaeadh3(genbank:dq288128.1)，人工合成该基因片段，以该基因片段为模板，通过聚合酶链式反应(pcr)扩增目的基因片段(片段两侧添加ndei和xhoi内切酶位点)其引物核苷酸序列如seqidno.3、seqidno.4所示。并利用ndei和xhoi内切酶位点将基因插入pet-24a质粒中，将连接后的载体转入大肠杆菌bl21(de3)中建立羰基还原酶基因工程菌。其中pcr扩增目的基因的引物为：
正向引物：gggaattccatatgacgactacttcaaatgcgctcg(seqidno.3)
反向引物：ccgctcgagcctcctgagccagcttaatggcgga(seqidno.4)
实施例2羰基还原酶突变体基因的获得
本研究利用易错pcr随机突变的方法，对羰基还原酶基因进行改造。易错pcr是在采用低保真的dna聚合酶进行目的基因扩增，通过调整反应条件，如提高镁离子浓度、加入锰离子、改变体系中四种的dntp浓度，来改变扩增过程中的突变频率，从而向目的基因中随机插入突变，获得不同蛋白质分子的随机突变体。
本研究采用的pcr体系如下。
50μlpcr体系如下:5×pcrbuffer10μl，dntp混合物浓度2.5mmol/l1μl，mgcl2(2.5mmol/l)2μl，mncl2(2.5mmol/l)2μl，羰基还原酶模板基因3μl，taqdna聚合酶1μl(2.5u/μl)，其余加入灭菌双蒸水到50μl。
pcr程序为：95℃预变性5min；94℃变性45s，55℃变性45s及72℃延伸45s进行30个循环；72℃继续延伸10min，4℃保存。
实验流程
按照实施例1的方法pcr扩增羰基还原酶基因并利用ndei和xhoi内切酶位点将基因插入至pet-24a中，作为基因突变模板；易错pcr扩增羰基还原酶的基因，扩增后基因片段链接至pet-24a载体中，将连接后的载体转入大肠杆菌bl21(de3)中建立羰基还原酶基因突变体dna文库；利用大肠杆菌bl21(de3)为宿主，pet-24a质粒为载体，表达羰基还原酶，高通量筛选高活性的突变菌株。筛选出的高活性羰基还原酶突变体基因的核酸序列如seqidno.1所示。
pcr扩增引物为
正向引物：gggaattccatatgacgactacttcaaatgcgctcg(seqidno.3)
反向引物：ccgctcgagcctcctgagccagcttaatggcgga(seqidno.4)
按实施例1所述方法构建表达该羰基还原酶突变体的基因工程菌。
在获得突变体序列后，也可以通过化学合成方式合成该基因序列后利用ndei和xhoi内切酶位点将基因插入至pet-24a质粒中，再转化大肠杆菌构建基因工程菌。
实施例3重组大肠杆菌的摇瓶培养
将实施例1和2所得的重组大肠杆菌接种至装有100ml含卡那霉素(50μg/ml)的lb培养基(蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，nacl10g/l，ph7.0)中，于37℃，250rpm的摇床中振荡培养5小时。转接按1:200菌体培养液至装有lb培养基(含卡那霉素50μg/ml)的200ml摇瓶中，置于同样条件下振荡培养。当菌液的od600值达到0.6-0.8时，加入终浓度为0.4mmol/l的诱导剂iptg，将培养液25℃诱导表达12-16小时，离心(13000rpm，30min，4℃)收集菌体，并用磷酸缓冲液(ph7.0)清洗两次，然后用3倍体积的缓冲液重悬，于冰浴中进行超声破碎，离心(13000rpm，,10min，4℃)，然后用sds-page检测表达是上清还是沉淀，最后得到羰基还原酶的粗酶液。
实施例4羰基还原酶活力的测定
由于nadph在340nm处有吸收峰，nadp没有，那么可以检测nadph在反应过程中340nm处的吸光度变化，从而计算羰基还原酶的活性。羰基还原酶活力测定体系为：2.5ml的磷酸缓冲液pbs(ph7.2)、加入400μl的3mmol/l的nadph、加入50μl的3mol/l的2-氧代-4-苯基丁酸乙酯，加水至2.95ml，30℃水浴5min。将实施实例3的粗酶液按适当的比例稀释后，取50μl加入反应体系，混匀30℃水浴5min。检测340nm处的吸光度变化，参照nadph的标准曲线计算酶活。
酶活力单位(u)定义：在上述反应条件下，毎分钟催化还原1μmolnadph生成nadp所需的酶量。
根据检测结果显示羰基还原酶突变体在催化制备手性醇中的活性明显提高了10-20倍。
实施例5羰基还原酶突变体催化合成(r)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯
在1000ml反应瓶中，加入400ml磷酸盐缓冲液(ph＝6.0-6.5)、220g葡萄糖，搅拌升温至25-28℃，加入100g2-氧代-4-苯基丁酸乙酯，搅拌15分钟，加入0.36g羰基还原酶突变体酶液和2.0g葡萄糖脱氢酶酶液，保温反应15小时左右，至底物含量低于1％时，反应终止。反应终止后经脱色、离心、萃取、脱溶等操作，得到96.9g产物(r)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯。(1hnmr(cdcl3,500mhz)：δ1.27(t,3h,j＝7.1hz,och2ch3),1.95-2.05(m,1h,arch2chh),2.12-2.15(m,1h,arch2chh),2.75-2.80(m,2h,arch2),2.93(s,1h,oh),4.17-4.26(m,3h,och2ch3,choh),7.19-7.28(m,5h,ar-h)；13cnmr(cdcl3,125mhz)：δ15,32,36,63,71,125,127,128,140,176)。经hplc分析确定底物转化率为98.5％，产物的ee：99.5％。
产物ee值的具体分析条件为：waterssymmetryc18色谱柱(150×3.9mm，5um)，流动相为0.1％磷酸水溶液：乙腈＝60:40；检测波长210nm，流速1.0ml/min，柱温25℃。
序列表
<110>宿迁阿尔法科技有限公司
<120>一种羰基还原酶突变体及其编码基因和应用
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