一种水稻叶绿素含量相关蛋白OsWSL4及其编码基因与应用的制作方法

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及水稻叶绿素含量相关蛋白及其编码基因与应用。

背景技术：

水稻作为重要的粮食作物之一，解决了世界上大约一半人口的吃饭问题。正常的光合作用是保证生产的前提，水稻叶绿素含量相关突变体是研究光合作用，探究光合利用率以提高产量的理想材料。叶绿体是半自主性细胞器，拥有自身的基因组，它不仅是光合作用的场所，也是各种代谢活动和调控的中心，与细胞核以及其他细胞器存在复杂的信号交流。

ppr家族是植物中发现的最大家族之一，在水稻中有477个成员，是一种以35个简并氨基酸为重复单位连续排列组成的蛋白质，这些重复出现的简并氨基酸简称为ppr基序。这个家族大部分定位在线粒体或者叶绿体中，影响质体rna的剪接，编辑，加工以及稳定性等。尽管编码ppr家族在植物中大量存在，但是目前发现的影响水稻叶绿体基因rna剪接的ppr蛋白却很有限。在水稻中发现的定位于叶绿体的ppr蛋白有osppr1、(gothandametal.,2005)、ysa(suetal.,2012)、osv4(gongetal.,2014)、wsl(tanetal.,2014)、asl3(linetal.,2015a)和osptac2(wangetal.,2016)，其中只有wsl被报道参与到了叶绿体基因的rna剪接过程，wsl是一个psl亚家族的蛋白，影响叶绿体基因rpl2的剪接（tanetal.,2014）。我们的wsl4蛋白影响到叶绿体ii类内含子基因atpf,ndha,rpl2和rps12的rna剪接过程，这是第一次报导核编码的p亚家族的ppr蛋白在水稻叶绿体中参与多位点的rna剪接。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种水稻叶绿素含量相关蛋白oswsl4及其编码基因与应用。

本发明所提供的水稻叶绿素含量相关蛋白，名称为oswsl4，来源于稻属水稻（oryzasativa）品种rx69的氨基酸序列，是如下a）或b）：

a）如seqidno.1所示的氨基酸残基序列组成的蛋白质；

b）将seqidno.1中的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物叶绿素含量相关由a）衍生的蛋白质。

上述b）中的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述b）中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述序列表中的seqidno.1由554个氨基酸残基组成。

编码所述wsl4蛋白的dna分子也属于本发明的保护范围。

所述dna分子是如下（1）或（2）或（3）的dna分子。

1）如seqidno.2所示的dna分子；

2）在严格条件下与1）限定的dna序列杂交且与植物叶绿素含量相关的dna分子；

3）与1）或2）限定的dna序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且与植物叶绿素含量相关的dna分子。

所述严格条件可为在0.1×sspe(或0.1×ssc)，0.1%sds的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

上述序列表中的seqidno.2由1665个核苷酸组成。

本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法，为抑制目的植物中wsl4蛋白编码基因的表达，得到叶绿素含量缺陷的转基因植物。

上述所述叶绿素含量缺陷的转基因植物具体体现在形成白条纹表型的叶片，叶绿素含量异常。

上述所述植物具体为双子叶或单子叶植物，所述单子叶植物进一步具体为水稻。

上述抑制是通过在所述目的植物中转入干扰载体实现的。含有所述编码基因的重组载体、重组菌或转基因细胞系均属于本发明的保护范围。

所述干扰载体是将特异dna片段1和特异dna片段2均插入双元表达载体中，所述dna片段1如seqidno.2自5’末端第1162至1493位核苷酸所示；所述dna片段2和所述dna片段1反向互补。

上述表达载体具体为pcubi1390-△fad2载体。

扩增所述基因全长或者其任意片段的引物对也属于本发明保护的范围。

所述蛋白在调节叶绿素含量方面的应用也是本发明的保护范围。

本发明具有以下有益效果：

本发明的实验证明，本发明克隆得到wsl4基因，缺失wsl4基因的植株出现白条纹表型，叶绿素含量降低。转基因互补验证了此基因的功能，亚细胞定位也定位在了叶绿体中，证明wsl4蛋白在早期叶绿素含量过程中发挥重要作用。因此，可以基于本申请的基因，创制不同性状的植物品种材料，作为作物育种的素材，同时也为进一步研究叶绿素合成过程的机理并加以利用提供了基础。

附图说明

图1为pcubi1390-△fad2载体图谱。

图2为oswsl4干扰植株的表型。

图3为干扰植株基因转录水平检测和叶绿素含量测量。

图4为转基因互补植株表型和叶绿素含量测量，其中a，野生型（wt），wsl4突变体，互补植株（wsl4/wsl4）3叶期时的表型；b，野生型（wt），wsl4突变体，互补植株（wsl4/wsl4）的叶绿素含量测定，平均值来自三次独立的实验数据。chla，叶绿素a；chlb，叶绿素b；fw，鲜重。

图5为wsl4蛋白和突变后的蛋白wsl4的亚细胞定位，其中a，wsl4–gfp和wsl4–gfp在水稻原生质体中的瞬时表达；b，wsl4和wsl4(gfp)与叶绿体拟核markerpend（cfp）共定位。gfp，wsl4和wsl4的gfp荧光信号，cfp，叶绿体拟核markerpend的cfp荧光信号，auto，叶绿素自体荧光，merged，gfp，cfp和auto的荧光合并图像。bars，5μm。

图6为wsl4蛋白参与叶绿体ii型内含子基因的剪接，左侧是基因名称，右侧是剪接的（s）和没有剪接的（u）转录本；rna提取于l30/d25条件下的野生型和突变体（白色部分）的l3-3，l3-3代表3叶期的第三叶。。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了更好的阐明本发明，而不限定本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、生化试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的水稻（oryzasativassp.japonica）rx69(也称为野生型水稻，简称wt)公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

农杆菌为根癌农杆菌eha105(agrobacteriumtumefacienseha105)记载于newagrobacteriumhelperplasmidsforgenetransfertoplants.hood,elizabethe;gelvin,stantonb;melchers,leos;hoekema,andre.transgenicresearch,2(4):p.208-218(1993)。公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。

实施例1、oswsl4基因的获得

根据ncbi数据库，设计引物ppr-cds-f和ppr-cds-r

ppr-cds-f:atggccgcgcccgcgcccac

ppr-cds-r:tcaatcaagcagtctaatgg

用rnapreppure植物总提取试剂盒（天根生化科技有限公司），提取水稻rx69的10天左右的水稻幼苗总rna,反转得到cdna。以此为模板，用引物ppr-cds-f和ppr-cds-r进行扩增，得到的pcr产物对应的基因命名为oswsl4，该基因的编码区为seqidno.2所示的核苷酸；该基因编码的蛋白命名为oswsl4，氨基酸序列为seqidno.1所示序列。

实施例2、oswsl4的rna干扰载体的构建

1、oswsl4基因干扰片段的获得

（1）以实例1中cdna为模板，用wsl4-rnai-saci-inf和wsl4-rnai-saci-inr引物进行扩增，得到片段1。

wsl4-rnai-saci-inf：ctaggtaccaggcctgagctcgttgaattgcttcatcaa

wsl4-rnai-saci-inr：gacgtaggggcgatagagcttaagcgaaaagatcaatg

（2）以实例1中cdna为模板，用wsl4-rnai-bamhi-inf和wsl4-rnai-bamhi-inr引物进行扩增，得到片段2。

wsl4-rnai-bamhi-inf：tcttagaattcccggggatccgttgaattgcttcatcaa

wsl4-rnai-bamhi-inr：cgttacgtagtcgacggatcctaagcgaaaagatcaat

2、oswsl4基因rna干扰载体（重组载体pcubi1390-△fad2-oswsl4）的构建

(1)用限制性内切酶saci酶切表达载体pcubi1390-△fad2，得到线性表达载体，回收该线性片段。将片段1采用同源重组定向克隆的方法重组到该线性表达载体上（具体方法参考clontechinfusionkit说明书），得到重组载体pcubi1390-△fad2-sense-oswsl4。

（2）对重组载体pcubi1390-△fad2-sense-oswsl4进行测序，得到正确地质粒，再用限制性内切酶bamhi酶切测序正确地重组载体pcubi1390-△fad2-sense-oswsl4，得到了线性载体，回收该线性载体。将片段2采用同源重组定向克隆的方法重组到该线性载体上（具体方法参考clontechinfusionkit说明书），得到重组载体pcubi1390-△fad2-oswsl4。

（3）对重组载体pcubi1390-△fad2-oswsl4进行测序，结果表明该重组载体pcubi1390-△fad2-oswsl4是在saci酶切位点正向插入了片段1，bamhi酶切位点插入了片段2，即构建成功，命名为pcubi1390-△fad2-oswsl4。

实施例3、rna干扰植株的获得与鉴定

一、rna干扰植株的获得

1、将重组载体pcubi1390-△fad2-oswsl4用热激法转入根癌农杆菌eha105中得到含有重组载体的根癌农杆菌eha105，命名为eha105/pcubi1390-△fad2-oswsl4。

2、将含有重组载体eha105/pcubi1390-△fad2-oswsl4的农杆菌侵染野生型水稻rx69的胚性愈伤组织。经过共培养，继代，分化的一系列过程，待植株地上高度约为15cm时，开瓶口历练1天，然后清洗掉培养基，移栽至温室栽培，即为t0代植株。t0代植株自交收获种子并种植，得到稳定的t1代植株。

二、rnai干扰转基因植株的pcr鉴定

将上述获得的t1代幼苗和受体亲本水稻rx69植株的幼苗（简称为wt）的基因组dna，并采用引物1390-f（5’-tgccttcatacgctatttatttgc-3’）和引物fad2-r（5’-tgccttcatacgctatttatttgc-3’）进行pcr分子检测鉴定阳性苗，得到含有片段1pcr产物的植株为阳性苗，取三株阳性苗，分别命名为rnai-1，rnai-2，rnai-3植株。

三、rnai干扰转基因植株的oswsl4基因表达水平的鉴定

分别提取rnai-1植株、rnai-2植株、rnai-3植株和受体亲本水稻rx69植株（简称为wt）叶片的rna，设定内参为ubiquitin，利用内参引物ubi-f和ubi-r，以及oswsl4基因特异性定量引物wsl4-rt-f和wsl4-rt-r进行荧光定量pcr反应。结果表明（图1），与野生型对照相比，rnai干扰转基因植株中oswsl4基因表达水平显著下降。上述引物如下：

ubi-f：5’-gctccgtggcggtatcat-3’

ubi-r：5’-cggcagttgacagccctag-3’

wsl4-rt-f：5’-gccctccaaatgtggtaact-3’

wsl4-rt-r:5’-gccatcgctttatccatctt-3’

四、rnai干扰转基因植株的表型鉴定

分别将rnai-1植株、rnai-2植株、rnai-3植株和受体亲本水稻rx69植株（简称为wt）种植在培养箱中（30°c光照12h，25°c黑暗12h循环，湿度60%），待长到三叶期，观察叶色表型是否有差异。观察结果如图2，与受体亲本水稻rx69植株相比，rnai-1植株，rnai-2植株和rnai-3植株均出现白条纹的表型，oswsl4基因表达水平和叶绿素含量明显降低（图3），从而证明了oswsl4影响叶绿素的含量，干扰其基因，叶片出现了白条纹的表型且叶片色素明显降低。

实施例4、转基因互补载体的构建和鉴定

1、互补载体的构建

根据ncbi数据库，设计引物ppr-g-f和ppr-g-r

ppr-g-f:ccatgattacgaattcatggcgtatcctcctatcgttgc

ppr-g-r:taccgagctcgaattcgccgacttccgaccgaacat

提取水稻rx69的dna。以此为模板，用引物ppr-g-f和ppr-g-f使用primestar®hsdna聚合酶（takara）进行扩增，获得一个5.7kb大小的片段，包括2.2kb的上游启动子区序列，wsl4完整的编码区以及下游2kb的终止区序列。产物跑胶回收后，in-fusion(clontech)同源重组连入pcambia1305载体中，获得互补载体pcambia1305-gwsl4。

2、转基因互补载体的鉴定

互补载体pcambia1305-gwsl4转入wsl4突变体愈伤中，经过共培养，继代，分化的一系列过程，待植株地上高度约为15cm时，开瓶口历练1天，然后清洗掉培养基，移栽至温室栽培，即为t0代植株。t0代植株自交收获种子并种植，得到稳定的t1代植株。将上述获得的t1代幼苗，突变体wsl4植株的幼苗的基因组dna（阴性对照），互补载体pcambia1305-gwsl4质粒（阳性对照）并采用引物gwsl4-f（5'taggcaccccaggctttacact3'）和引物gwsl4-r（5'gtaacgtaggacaaaacc3'）进行pcr分子检测鉴定阳性苗，能够扩增出692bp片段的为阳性苗，命名为wsl4/wsl4植株。共获得了6个转基因阳性株系，转基因阳性株系恢复了野生型的表型，同时叶绿素a和叶绿素b都恢复了野生型的水平，wsl4基因的表达也与野生型几乎持平（图4）。以上结果表明wsl4突变体白条纹的表型是由于oswsl4（loc_os02g35750）突变造成的。

实施例5、wsl4蛋白的亚细胞定位

为了了解wsl4蛋白的亚细胞定位情况，我们首先用chlorop(http://www.cbs.dtu.dk/services/chlorop/)和targetp（http://www.cbs.dtu.dk/services/targetp/）对wsl4蛋白进行预测，发现wsl4蛋白的n端的存在着叶绿体转运肽（ctp），加上wsl4叶绿素缺陷的表型，我们猜测wsl4可能定位在叶绿体中。为了确定wsl4的真实定位和突变后的蛋白是否改变定位，我们分别以野生型和突变体cdna为模板，扩增出编码wsl4全长序列和wsl4突变后的序列（除去终止子），连接到载体pan580上，分别命名为pan580-wsl4-gfp和pan580-wsl4-gfp并转化到水稻原生质体中，28℃黑暗培养16小时以后用激光共聚焦显微镜拍照，结果显示，wsl4-gfp和wsl4-gfp都和叶绿素自发荧光（用于叶绿体marker）共定位（图5a），进一步发现wsl4和wsl4与叶绿体拟核markerpend（cfp）共定位（图5b），综合上述结果说明wsl4蛋白定位于叶绿体中并且与叶绿体拟核共定位，而且突变后的蛋白并没有改变定位，也定位于叶绿体拟核内。

实施例6、rna剪接分析

水稻叶绿体内含子有两种类型，分别为i型和ii型。i型仅包括基因trnl，ii型包括atpf、ndha、ndhb、petb、petd、rpl2、rpl16、rps12、rps16、trna、trng、trnk、trni、trnv和ycf3，其中rps12、ycf3有两个内含子(micheletal.,1989;delongevialle.,2010)。我们检测了17个ii型内含子的叶绿体基因（atpf、ndha、ndhb、petb、petd、rpl2、rpl16、rps12-1、rps16、trna、trng、trnk、trni、trnv、ycf3-1、ycf3-2）和一个i型内含子的叶绿体基因trnl，用pcr的方法扩增出野生型和突变体中所有剪接位点基因的cds，用琼脂糖凝胶电泳检测转录本的情况并拍照，发现ii型内含子的atpf、ndha、rpl2、rps12-1基因中野生型和突变体转录本存在差异（图6）。所以oswsl4可能在atpf、ndha、rpl2、rps12-1等四个叶绿体ii类内含子基因的剪接中起重要作用。

<110>中国农业科学院作物科学研究所

<120>一种水稻叶绿素含量相关蛋白oswsl4及其编码基因与应用

<130>1

<160>2

<210>1

<211>554

<212>氨基酸

<400>1

maapaptaspppppamsgllsfassrpypplpaprpaaaaprprlriagsaaaapnavshrasssfssgdrlrslvrrgeldealrlvgsarrpdagtcaalikklsasgrtaearrvlaacgpdvmaynamvagycgagqldaarrlvaempvepdaytyntlirglcgrgrtanalavldemlrrrcvpdvvtytilleatckrsgykqamklldemrdkgctpdivtynvvvngicqegrvddaieflknlpsygcepntvsynivlkglctaerwedaeelmgemgqkgcppnvvtfnmlisflcrkglvepalevleqipkygctpnslsynpllhafckqkkmdkamafldlmvsrgcypdivsyntlltalcrsgevdvavellhqlkdkgcapvlisyntvidgltkagktkealellnemvskglqpdiitystiaaglcredriedairafgkvqdmgirpntvlynaiilglckrrethsaidlfaymigngcmpnestytilieglayeglikeardlldelcsrgvvrkslinkgairlld

<210>2

<211>1665

<212>dna

<400>2

atggccgcgcccgcgcccacagcttcgccgccgccgccgcccgccatgtccggcctcctc60

tccttcgcctcgtcccgcccctaccctcccctccccgcgcccagacccgccgccgccgcc120

cccaggccgcgcctccgcatagcgggttccgccgccgcggcccccaacgccgtgtcccac180

cgggcatcctcctccttctcctccggagaccgcctccgctcgctcgtccgccgcggggag240

ctcgacgaggcgctccgcctcgtcgggtccgcgcggaggcccgacgcgggcacctgcgcc300

gcgctcatcaagaagctcagcgcgtcggggcgcaccgcggaggcccgccgcgtgctggcc360

gcgtgcggccccgacgtcatggcgtacaacgccatggtggccgggtactgcggcgcgggg420

cagctcgacgccgcgcggcggctcgtcgcggagatgcccgtggagcccgacgcctacacc480

tacaacacgctcatccgaggcctctgcggacgcggccggaccgcgaacgcgctggcggtg540

ctcgacgaaatgctccgccggcgatgtgtgccggacgtggtcacctacaccatcctcctc600

gaggccacgtgcaagaggagcgggtacaagcaggccatgaagcttctcgacgagatgcga660

gataaggggtgcaccccggacattgtcacctacaacgtcgttgtcaatggaatctgccaa720

gaaggacgggttgacgatgccattgagttcttgaagaacctcccgtcatatggctgtgaa780

ccaaacacagttagctataacattgtgttgaagggcctgtgtaccgcggagcgatgggag840

gatgccgaggagctcatgggcgagatgggccagaagggttgccctccaaatgtggtaact900

tttaacatgctcatcagtttcttatgccggaaaggattggttgagccagcactggaagtc960

cttgagcagatccccaagtacggttgcacacctaattcgttgagttacaacccgcttctc1020

cacgcattctgcaagcaaaaaaagatggataaagcgatggcgtttttggatttgatggtg1080

tccagaggctgttatccagacatcgtttcatacaacactctacttactgcactctgccgc1140

agtggtgaggttgacgtcgctgttgaattgcttcatcaactcaaggacaagggctgcgct1200

cctgtcttgataagttataacacggtcattgatgggcttacgaaggctgggaagacaaag1260

gaagcactagagctgctcaatgagatggtcagcaaagggctccaaccagatattatcaca1320

tactcgacaatagctgctggtctttgtagagaagatagaattgaagatgcaattagggca1380

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gggaatggctgcatgccgaatgaatcaacttacaccatattgattgaaggcttggcttat1560

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