同时检测番茄Ty‑1、Ty‑3和Mi基因的多重PCR法的制作方法

本发明涉及一种植物抗病分子育种领域的检测方法，具体是一种利用多重pcr(聚合酶链式反应)技术进行番茄ty-1、ty-3和mi基因的同时检测，应用该方法可对番茄抗病种质资源进行筛选。
背景技术：
：番茄(solanumlycopersicum)是世界范围内广泛种植的蔬菜之一，被列为全世界总产量最高的30种农作物之一，在世界农业经济和农业市场中占有重要的地位。但长期以来，番茄的种植会受到多种病害的侵扰。据统计每年因病虫害可使番茄减产10％～20％，严重时可能绝收。番茄黄化曲叶病(tomatoyellowleafcurlvirus，tylcv)是造成番茄产量和品质下降的一项主要病害。该病害于二十世纪初在以色列首次发现，目前在全世界范围均有发生。该病害是造成番茄减产和品质降低的最主要因素之一，目前尚没有防治tylcv的特效药物，最好的办法就是选育抗番茄黄化曲叶病的优良品种，其中ty-1和ty-3基因是抗黄化曲叶病的主效基因，因此被广泛应用于抗病品种的选育。根结线虫病(root-knotnematode)是一种世界性病害，分布极其广泛，危害十分严重。根结线虫病严重危害作物生产，寄主范围达2000多种。国际上已有80多种根结线虫的相关报道，我国报道的根结线虫的有效种有39种。在番茄抗根结线虫育种中，mi基因是目前被鉴定和利用最多的有效抗性基因，该抗性基因具有广谱性，能有效抵抗除北方根结线虫以外的其它3种主要根结线虫。多重pcr技术是指在一个反应体系中同时扩增多个目的片段的pcr技术。这与单基因pcr相比具有高灵敏度、高效率、低成本的特点，一经提出便得到众多研究者的青睐，但多重pcr技术对引物浓度、taqdna聚合酶浓度、dntp浓度、反应的循环参数(包括退火温度、退火及延伸时间等)等实验条件要求及其严格。目前多重pcr技术在番茄抗病育种中已有一些研究，但能同时鉴定抗番茄黄化曲叶病基因ty-1、ty-3和抗根结线虫病基因mi的多重pcr技术体系目前未见报道。同时，现有技术体系中对抗番茄黄化曲叶病基因ty-1和抗根结线虫病基因mi的检测利用的多为caps分子标记，大都需要扩增后再进行酶切，所需时间长，耗费成本高。本方法采用的是pcr扩增反应后无需继续酶切的两对snp分子标记和两对scar分子标记，且四对分子标记经验证可以很好地对番茄材料的基因型进行区分，不会出现假阳性的情况，因此使用本方法不仅可大大缩短检测时间，还可节省分子检测的成本。技术实现要素：本发明的目的在于针对现有检测手段单一、耗时费力的不足，提供一种能同时、快速检测番茄ty-1、ty-3和mi基因的多重pcr方法，使其服务于番茄抗病分子育种工作，并能够利用该方法快速筛选出一批抗番茄黄化曲叶病和抗根结线虫病的番茄种质资源。本发明的目的是通过以下技术方案实现的：本发明涉及一种同时检测番茄ty-1、ty-3和mi基因的多重pcr方法，所述方法包括如下步骤：s1、提取番茄样品dna(脱氧核糖核酸)；s2、选用ty-1、ty-3和mi基因的特异性引物，对待测样品进行一步多重pcr反应，最后凝胶电泳检测，即可实现同时检测番茄ty-1、ty-3和mi基因型；其中，ty-1基因的特异性引物为序列如seqidno.1、2所示的ty-1-1引物对和序列如seqidno.3、4所示的ty-1-2引物对；ty-3基因的特异性引物为序列如seqidno.5、6所示的ty-3引物对；mi基因的特异性引物为序列如seqidno.7、8所示的mi引物对。ty-1-1(f)5’-aaacgctcttcttcccctcg-3’，seqidno.1，ty-1-1(r)5’-agttagattcaggctcctcgca-3’，seqidno.2，ty-1-2(f)5’-tgtatgcgtcgtgttagaaggtc-3’，seqidno.3，ty-1-2(r)5’-aatggtgacagaatcaagatccac-3’，seqidno.4，ty-3(f)5’-ggtagtggaaatgatgctgctc-3’，seqidno.5，ty-3(r)5’-gctctgcctattgtcccatatataacc-3’，seqidno.6，mi(f)5’-tggaaaaatgttgaatttcttttg-3’，seqidno.7，mi(r)5’-gcatactatatggcttgtttaccc-3’，seqidno.8。优选的，步骤s1中，所述提取番茄样品dna包括选取各供试番茄材料单株幼叶，利用ctab(溴代十六烷基三甲基铵)法提取dna，提取的dna稀释到50-250ng·μl-1，备用。优选的，所述利用ctab法提取dna，具体包括：s1-1、清洗、研磨：选取番茄幼叶，清洗；冷冻，加入液氮，研磨；s1-2、ctab液提取：每2g番茄叶粉加入预热的ctab提取液500μl，温浴30～60分钟，每5～10分钟混匀一次；s1-3、去蛋白：加冰浴的酚、氯仿和异戊醇混合液500μl混匀，4℃条件下离心10～15分钟，取上清液；s1-4、沉淀、去rna：加冰浴的异丙醇进行沉淀；沉淀物中加rna酶进行消化去rna；s1-5、二次去蛋白、去离子：加冰浴的氯仿异戊醇混合液混匀、离心，取上清液；加冰浴的7.5mol·l-1醋酸铵混匀，冰浴、离心，取上清液；s1-6、dna沉淀、洗涤：加冰浴的无水乙醇，冰浴、离心，获得dna沉淀；用乙醇洗涤；s1-7、加te溶解和稀释，dna浓度稀释至50-250ng·μl-1，冷藏保存。更优选的，步骤s1-2中，所述ctab提取液为：称取ctab20g和氯化钠81.9g溶解于100ml蒸馏水中，加入0.5mol·l-1的edta40ml和1mol·l-1的tris-hcl100ml，最后用蒸馏水定容至1000ml，使用前按体积100比1加入巯基乙醇。更优选的，步骤s1-3中，所述酚、氯仿和异戊醇混合液为：先吸取体积比为24份的氯仿和1份的异戊醇，制成氯仿异戊醇混合液，再与25份的酚混合待用。更优选的，步骤s1-4中，所述rna酶为：先配制te缓冲液，吸取0.5mol·l-1的edta0.2ml和1mol·l-1的tris-hcl1ml，用蒸馏水定容至100ml，再按体积比为993比7加入10g·l-1的rna酶。优选的，步骤s2中，所述多重pcr反应包括：采用20μl反应体系进行ty-1、ty-3和mi基因的同时扩增；所述反应体系为：2μldna模板，0.4μl5u·μl-1taq聚合酶，2μl10×pcrbuffer(缓冲液)，2μl2.5mmdntp(脱氧核糖核苷三磷酸)，100μmol-l-1的ty-1-1引物对各0.4μl，100μmol·l-1的ty-1-2引物对各0.2μl，100μmol·l-1的ty-3引物对各0.4μl，100μmol·l-1的mi引物对各0.4μl，加ddh2o补足至20μl。优选的，步骤s2中，所述多重pcr反应的pcr扩增程序采用94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，56℃复性1分钟，72℃延伸2.5分钟，共35个循环；随后72℃延伸10分钟，pcr产物于4℃保存。优选的，步骤s2中，所述凝胶电泳检测为：多重pcr反应的pcr产物用加有eb的2％琼脂糖在100-120v电压条件下电泳40分钟，最终结果在凝胶成像系统上显示。本发明具有的有益效果为：本发明以番茄为材料，对同时检测ty-1、ty-3和mi基因的多重pcr反应体系的参数进行了摸索，不仅包括反应体系大小、引物浓度、引物间配比、taqdna聚合酶浓度、dntp浓度、反应的循环参数(包括退火温度、退火及延伸时间等)，同时对电泳时琼脂糖凝胶的浓度和时间进行了反复试验，使其能适用对番茄三种基因的同时快速检测，为番茄抗病分子育种研究及生产应用提供理论依据，简化育种流程，缩短育种年限。附图说明通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：图1为本发明实施例10份番茄纯合自交系材料单组引物pcr的电泳图；图2为本发明实施例10份番茄纯合自交系材料多重引物pcr的电泳图；图3为本发明实施例5份番茄品种单组引物pcr的电泳图；图4为本发明实施例5份番茄品种多重引物pcr的电泳图；图5为本发明实施例4份番茄f1杂交种材料单组引物pcr的电泳图；图6为本发明实施例4份番茄f1杂交种材料多重引物pcr的电泳图。具体实施方式下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。实施例1材料的选择与培养：以来自上海交通大学农业与生物学院园艺种质创新实验室保存的10份已知基因型的番茄纯合自交系为试验材料(表1)，挑选饱满的种子，播到由草炭、蛭石及有机肥(体积比4∶4∶1)混合的基质中，浇透水后打0.5厘米深的孔，将种子播到孔中，然后覆0.5厘米厚的草炭。用黑色膜封严后置于30℃左右的苗床上3-4天，待发芽出土后，转到日温25℃，夜温18℃的人工气候室内培养2周，剪取幼嫩叶片用于dna提取。表1供试10份已知基因型的番茄纯合自交系材料注：本实施例材料来源可参考文献：苏永涛，刘杨，庄天明，等.栽培番茄品种指纹图谱的aflp分析[j].中国蔬菜，2010，1(18)：34-39.dna的提取：采用ctab方法提取dna，具体操作步骤如下：1、叶片清洗：选取幼叶3-5片，2g(克)左右，纯净水洗干净；2、叶片研磨：冷冻，加入液氮，研磨，转入1.5或2ml(毫升)离心管；3、预先配备ctab提取液：称取ctab20g和氯化钠81.9g溶解于100ml蒸馏水中，加入0.5mol·l-1(摩尔每升)的edta(乙二胺四乙酸)40ml和1mol·l-1的tris-hcl100ml，最后用蒸馏水定容至1000ml，4℃保存备用。使用前按体积100比1加入巯基乙醇；4、ctab液提取：加入60℃预热的ctab提取液500μl，60℃水浴30-60分钟，每10分钟混匀一次；5、去蛋白：加-20℃冰浴的酚∶氯仿∶异戊醇(体积比25∶24∶1)500μl混匀，4℃条件下12000转离心10分钟，取上清液；6、沉淀：加-20℃冰浴的异丙醇500μl，混匀沉淀30分钟以上，4℃条件下8000转离心10分钟，去上清液，晾干；7、预先配制rna(核糖核酸)酶液：吸取0.5mol·l-1的edta0.2ml和1mol-l-1的tris-hcl1ml，用蒸馏水定容至100ml，制备te缓冲液，再按体积比为993比7加入10g·l-1(克每升)的rna酶；8、去rna：加rna酶液300μl，37℃消化30分钟；9、二次去蛋白：加-20℃冰浴的氯仿∶异戊醇(体积比24∶1)300μl混匀，4℃条件下12000转离心10分钟，取上清液；10、去离子：加-20℃冰浴的7.5mol·l-1醋酸铵100μl混匀，0℃冰浴20分钟，4℃条件下10000转离心20分钟，取上清液；11、dna沉淀：加-20℃冰浴的无水乙醇900μl，0℃冰浴20分钟，4℃条件下8000转离心20分钟，去上清液，获得dna沉淀；12、dna洗涤：对dna沉淀用70％乙醇洗两遍，晾干；13、溶解：加te溶解和稀释，dna浓度稀释至50-250ng·μl-1，放4℃冰箱保存。为了确保本实施例所用材料可用，并与本发明多重pcr反应结果进行比对，本实施例首先进行单基因pcr反应及凝胶电泳检测：对ty-1基因利用两对引物分别进行扩增，采用20μl反应体系，分别加入2μldna模板，0.2μl5u·μl-1taq聚合酶，2μl10×pcrbuffer，2μl2.5mmdntp，上下游引物(100μmol·l-1)各0.5μl，加ddh2o补足至20μl。pcr扩增程序为94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，57℃复性1分钟，72℃延伸2分钟，共35个循环；随后72℃延伸10分钟，pcr产物于4℃保存。pcr产物用加有eb的2％琼脂糖在100-120v电压条件下电泳40分钟，最终结果在凝胶成像系统上显示，结果如图1所示。扩增ty-1所用引物为两对，其序列分别为：ty-1-1(f)5’-aaacgctcttcttcccctcg-3’，seqidno.1，ty-1-1(r)5’-agttagattcaggctcctcgca-3’，seqidno.2，ty-1-2(f)5’-tgtatgcgtcgtgttagaaggtc-3’，seqidno.3，ty-1-2(r)5’-aatggtgacagaatcaagatccac-3’，seqidno.4。对ty-3基因采用20μl反应体系进行扩增，加入2μldna模板，0.2μl5u·μl-1taq聚合酶，2μl10×pcrbuffer，2μl2.5mmdntp，上下游引物(100μmol·l-1)各0.5μl，加ddh2o补足至20μl。pcr扩增程序为94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，55℃复性45秒，72℃延伸1分钟，共35个循环；随后72℃延伸10分钟，pcr产物于4℃保存。pcr产物用加有eb的2％琼脂糖在100-120v电压条件下电泳40分钟，最终结果在凝胶成像系统上显示，结果如图1所示。扩增ty-3所用引物为一对，其序列为：ty-3(f)5’-ggtagtggaaatgatgctgctc-3’，seqidno.5，ty-3(r)5’-gctctgcctattgtcccatatataacc-3’，seqidno.6。对mi基因采用20μl反应体系进行扩增，加入2μldna模板，0.2μl5u·μl-1taq聚合酶，2μl10×pcrbuffer，2μl2.5mmdntp，上下游引物(100μmol·l-1)各0.5μl，加ddh2o补足至20μl。pcr扩增程序采用94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，53℃复性45秒，72℃延伸1分钟，共35个循环；随后72℃延伸10分钟，pcr产物于4℃保存。pcr产物用加有eb的2％琼脂糖在100-120v电压条件下电泳40分钟，最终结果在凝胶成像系统上显示，结果如图1所示。扩增mi所用引物为一对，其序列为：mi(f)5’-tggaaaaatgttgaatttcttttg-3’，seqidno.7，mi(r)5’-gcatactatatggcttgtttaccc-3’，seqidno.8。多重pcr反应及凝胶电泳检测：对ty-1、ty-3和mi基因采用20μl体系同时进行扩增，分别加入2μldna模板，0.4μl5u·μl-1taq聚合酶，2μl10×pcrbuffer，2μl2.5mmdntp，ty-1-1上下游引物(100μmol·l-1)各0.4μl，ty-1-2上下游引物(100μmol·l-1)各0.2μl，ty-3上下游引物(100μmol·l-1)各0.4μl，mi上下游引物(100μmol·l-1)各0.4μl，加ddh2o补足至20μl。pcr扩增程序采用94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，56℃复性1分钟，72℃延伸2.5分钟，共35个循环；随后72℃延伸10分钟，pcr产物于4℃保存。pcr产物用加有eb的2％琼脂糖在100-120v电压条件下电泳40分钟，最终结果在凝胶成像系统上显示，结果如图2所示。对ty-1、ty-3和mi基因同时扩增所用引物为四对，其序列为：ty-1-1(f)5’-aaacgctcttcttcccctcg-3’，seqidno.1，ty-1-1(r)5’-agttagattcaggctcctcgca-3’，seqidno.2，ty-1-2(f)5’-tgtatgcgtcgtgttagaaggtc-3’，seqidno.3，ty-1-2(r)5’-aatggtgacagaatcaagatccac-3’，seqidno.4，ty-3(f)5’-ggtagtggaaatgatgctgctc-3’，seqidno.5，ty-3(r)5’-gctctgcctattgtcccatatataacc-3’，seqidno.6，mi(f)5’-tggaaaaatgttgaatttcttttg-3’，seqidno.7，mi(r)5’-gcatactatatggcttgtttaccc-3’，seqidno.8。结果：对供试的10份番茄材料通过四对引物的单基因pcr扩增后，结果如图1所示。由图1可知番茄材料j42、j17、浦03-2-3和浦08-1-1扩增后均产生了984bp、650bp和430bp的条带，说明四份材料的基因型为ty-1纯合抗病，ty-3纯合抗病，mi感病；番茄材料atm004、atm099和金有扩增后均产生了1434bp、320bp和380bp的条带，说明三份材料的基因型为ty-1感病，ty-3感病，mi纯合抗病；番茄材料77-7、玉1和玉8扩增后均产生了1434bp、320bp和430bp的条带，说明三份材料的基因型为ty-1感病，ty-3感病，mi感病。这与实验室之前鉴定过的基因型完全吻合。对供试的10份番茄材料通过四对引物的多重pcr扩增后，结果如图2所示。由图2可以看出，10份材料经多重pcr反应扩增出条带的结果与单基因pcr扩增后的结果完全一致。这验证了本发明提出的多重pcr方法之可行性，而且利用这一方法可以通过一次pcr反应将供试番茄材料的基因型完全区分开，结果清晰可靠，可以为番茄抗病分子育种提供有利的帮助。实施例2材料的选择：以来自上海富农种业有限公司的5份经过田间抗病鉴定的番茄品种为试验材料(表2)，于2016年10月18日取样，选取番茄幼嫩叶片用于dna提取。表2供试5份经过田间鉴定的番茄品种注：tylcv番茄黄化曲叶病，n根结线虫病，r抗病，s感病。dna的提取：采用ctab方法提取dna，具体操作步骤如下：1、叶片清洗：选取幼叶3-5片，2g左右，纯净水洗干净；2、叶片研磨：冷冻，加入液氮，研磨，转入1.5或2ml离心管；3、ctab液提取：加入60℃预热的ctab提取液500μl，60℃水浴30-60分钟，每10分钟混匀一次；4、去蛋白：加-20℃冰浴的酚∶氯仿∶异戊醇(体积比25∶24∶1)500μl混匀，4℃条件下12000转离心10分钟，取上清液；5、沉淀：加-20℃冰浴的异丙醇500μl，混匀沉淀30分钟以上，4℃条件下8000转离心10分钟，去上清液，晾干；6、去rna：加rna酶液300μl，37℃消化30分钟；7、二次去蛋白：加-20℃冰浴的氯仿∶异戊醇(体积比24∶1)300μl混匀，4℃条件下12000转离心10分钟，取上清液；8、去离子：加-20℃冰浴的7.5mol·l-1醋酸铵100μl混匀，0℃冰浴20分钟，4℃条件下10000转离心20分钟，取上清液；9、dna沉淀：加-20℃冰浴的无水乙醇900μl，0℃冰浴20分钟，4℃条件下8000转离心20分钟，去上清液，获得dna沉淀；10、dna洗涤：对dna沉淀用70％乙醇洗两遍，晾干；11、溶解：加te溶解和稀释，dna浓度稀释至50-250ng·μl-1，放4℃冰箱保存。为了确保本实施例所用材料可用，并与本发明多重pcr反应结果进行比对，本实施例首先进行单基因pcr反应及凝胶电泳检测：对ty-1基因利用两对引物分别进行扩增，采用20μl反应体系，分别加入2μldna模板，0.2μl5u·μl-1taq聚合酶，2μl10×pcrbuffer，2μl2.5mmdntp，上下游引物(100μmol·l-1)各0.5μl，加ddh2o补足至20μl。pcr扩增程序为94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，57℃复性1分钟，72℃延伸2分钟，共35个循环；随后72℃延伸10分钟，pcr产物于4℃保存。pcr产物用加有eb的2％琼脂糖在100-120v电压条件下电泳40分钟，最终结果在凝胶成像系统上显示，结果如图3所示。扩增ty-1所用引物为两对，其序列分别为：ty-1-1(f)5’-aaacgctcttcttcccctcg-3’，ty-1-1(r)5’-agttagattcaggctcctcgca-3’，ty-1-2(f)5’-tgtatgcgtcgtgttagaaggtc-3’，ty-1-2(r)5’-aatggtgacagaatcaagatccac-3’。对ty-3基因采用20μl反应体系进行扩增，加入2μldna模板，0.2μl5u·μl-1taq聚合酶，2μl10×pcrbuffer，2μl2.5mmdntp，上下游引物(100μmol·l-1)各0.5μl，加ddh2o补足至20μl。pcr扩增程序为94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，55℃复性45秒，72℃延伸1分钟，共35个循环；随后72℃延伸10分钟，pcr产物于4℃保存。pcr产物用加有eb的2％琼脂糖在100-120v电压条件下电泳40分钟，最终结果在凝胶成像系统上显示，结果如图3所示。扩增ty-3所用引物为一对，其序列为：ty-3(f)5’-ggtagtggaaatgatgctgctc-3’，ty-3(r)5’-gctctgcctattgtcccatatataacc-3’。对mi基因采用20μl反应体系进行扩增，加入2μldna模板，0.2μl5u·μl-1taq聚合酶，2μl10×pcrbuffer，2μl2.5mmdntp，上下游引物(100μmol·l-1)各0.5μl，加ddh2o补足至20μl。pcr扩增程序采用94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，53℃复性45秒，72℃延伸1分钟，共35个循环；随后72℃延伸10分钟，pcr产物于4℃保存。pcr产物用加有eb的2％琼脂糖在100-120v电压条件下电泳40分钟，最终结果在凝胶成像系统上显示，结果如图3所示。扩增mi所用引物为一对，其序列为：mi(f)5’-tggaaaaatgttgaatttcttttg-3’，mi(r)5’-gcatactatatggcttgtttaccc-3’。多重pcr反应及凝胶电泳检测：对ty-1、ty-3和mi基因采用20μl体系同时进行扩增，分别加入2μldna模板，0.4μl5u·μl-1taq聚合酶，2μl10×pcrbuffer，2μl2.5mmdntp，ty-1-1上下游引物(100μmol·l-1)各0.4μl，ty-1-2上下游引物(100μmol·l-1)各0.2μl，ty-3上下游引物(100μmol·l-1)各0.4μl，mi上下游引物(100μmol·l-1)各0.4μl，加ddh2o补足至20μl。pcr扩增程序采用94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，56℃复性1分钟，72℃延伸2.5分钟，共35个循环；随后72℃延伸10分钟，pcr产物于4℃保存。pcr产物用加有eb的2％琼脂糖在100-120v电压条件下电泳40分钟，最终结果在凝胶成像系统上显示，结果如图4所示。对ty-1、ty-3和mi基因同时扩增所用引物为四对，其序列为：ty-1-1(f)5’-aaacgctcttcttcccctcg-3’，ty-1-1(r)5’-agttagattcaggctcctcgca-3’，ty-1-2(f)5’-tgtatgcgtcgtgttagaaggtc-3’，ty-1-2(r)5’-aatggtgacagaatcaagatccac-3’，ty-3(f)5’-ggtagtggaaatgatgctgctc-3’，ty-3(r)5’-gctctgcctattgtcccatatataacc-3’，mi(f)5’-tggaaaaatgttgaatttcttttg-3’，mi(r)5’-gcatactatatggcttgtttaccc-3’。结果：5份用于单基因pcr反应的番茄品种，其扩增结果(图3)显示，欣美番茄扩增产生1434bp、984bp、320bp和430bp四条带，说明欣美番茄为ty-1杂合抗病，ty-3感病，mi感病；浦粉珍美扩增产生1434bp、984bp、650bp、320bp和430bp五条带，说明浦粉珍美为ty-1杂合抗病，ty-3杂合抗病，mi感病；类似地，浦粉1301为ty-1杂合抗病，ty-3杂合抗病，mi杂合抗病；浦粉5号为ty-1杂合抗病，ty-3杂合抗病，mi感病；浦粉一号为ty-1感病，ty-3感病，mi纯合抗病。对5份材料进行多重pcr反应的结果(图4)显示，5份番茄品种的多重pcr扩增结果同单基因扩增结果完全一致，且与田间抗病鉴定结果一致，证明多重pcr方法能够一次性对番茄ty-1、ty-3和mi基因进行检测，检测方便快速，检测结果可以用于番茄抗病分子辅助育种，同时可以通过该方法筛选出可以加以利用的番茄抗病种质资源。实施例3材料的选择与培养：以来自上海交通大学农业与生物学院园艺种质创新实验室保存的4份已知基因型的番茄f1杂交种材料为试验材料(表3)，挑选饱满的种子，播到由草炭、蛭石及有机肥(体积比4∶4∶1)混合的基质中，浇透水后打0.5厘米深的孔，将种子播到孔中，然后覆0.5厘米厚的草炭。用黑色膜封严后置于30℃左右的苗床上3-4天，待发芽出土后，转到日温25℃，夜温18℃的人工气候室内培养2周，剪取幼嫩叶片用于dna提取。表3供试4份已知基因型的番茄f1杂交种材料序号材料名称ty-1基因型ty-3基因型mi基因型1c1ty-1/ty-1ty-3/ty-3mi/mi2c2ty-1/ty-1ty-3/ty-3mi/mi3c8ty-1/ty-1ty-3/ty-3mi/mi4c10ty-1/ty-1ty-3/ty-3mi/mi注：本实施例材料来源可参考文献：蒋青青，刘杨，陈火英.激素组合与水解蛋白对番茄花药愈伤增殖的影响[j].上海交通大学学报(农业科学版)，2012，30(2)：8-11.dna的提取：采用ctab方法提取dna，具体操作步骤如下：1、叶片清洗：选取幼叶3-5片，2g左右，纯净水洗干净；2、叶片研磨：冷冻，加入液氮，研磨，转入1.5或2ml离心管；3、ctab液提取：加入60℃预热的ctab提取液500μl，60℃水浴30-60分钟，每10分钟混匀一次；4、去蛋白：加-20℃冰浴的酚∶氯仿∶异戊醇(体积比25∶24∶1)500μl混匀，4℃条件下12000转离心10分钟，取上清液；5、沉淀：加-20℃冰浴的异丙醇500μl，混匀沉淀30分钟以上，4℃条件下8000转离心10分钟，去上清液，晾干；6、去rna：加rna酶液300μl，37℃消化30分钟；7、二次去蛋白：加-20℃冰浴的氯仿∶异戊醇(体积比24∶1)300μl混匀，4℃条件下12000转离心10分钟，取上清液；8、去离子：加-20℃冰浴的7.5mol·l-1醋酸铵100μl混匀，0℃冰浴20分钟，4℃条件下10000转离心20分钟，取上清液；9、dna沉淀：加-20℃冰浴的无水乙醇900μl，0℃冰浴20分钟，4℃条件下8000转离心20分钟，去上清液，获得dna沉淀；10、dna洗涤：对dna沉淀用70％乙醇洗两遍，晾干；11、溶解：加te溶解和稀释，dna浓度稀释至50-250ng·μl-1，放4℃冰箱保存。为了确保本实施例所用材料可用，并与本发明多重pcr反应结果进行比对，本实施例首先进行单基因pcr反应及凝胶电泳检测：对ty-1基因利用两对引物分别进行扩增，采用20μl反应体系，分别加入2μldna模板，0.2μl5u·μl-1taq聚合酶，2μl10×pcrbuffer，2μl2.5mmdntp，上下游引物(100μmol·l-1)各0.5μl，加ddh2o补足至20μl。pcr扩增程序为94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，57℃复性1分钟，72℃延伸2分钟，共35个循环；随后72℃延伸10分钟，pcr产物于4℃保存。pcr产物用加有eb的2％琼脂糖在100-120v电压条件下电泳40分钟，最终结果在凝胶成像系统上显示，结果如图5所示。扩增ty-1所用引物为两对，其序列分别为：ty-1-1(f)5’-aaacgctcttcttcccctcg-3’，ty-1-1(r)5’-agttagattcaggctcctcgca-3’，ty-1-2(f)5’-tgtatgcgtcgtgttagaaggtc-3’，ty-1-2(r)5’-aatggtgacagaatcaagatccac-3’。对ty-3基因采用20μl反应体系进行扩增，加入2μldna模板，0.2μl5u·μl-1taq聚合酶，2μl10×pcrbuffer，2μl2.5mmdntp，上下游引物(100μmol·l-1)各0.5μl，加ddh2o补足至20μl。pcr扩增程序为94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，55℃复性45秒，72℃延伸1分钟，共35个循环；随后72℃延伸10分钟，pcr产物于4℃保存。pcr产物用加有eb的2％琼脂糖在100-120v电压条件下电泳40分钟，最终结果在凝胶成像系统上显示，结果如图5所示。扩增ty-3所用引物为一对，其序列为：ty-3(f)5’-ggtagtggaaatgatgctgctc-3’，ty-3(r)5’-gctctgcctattgtcccatatataacc-3’。对mi基因采用20μl反应体系进行扩增，加入2μldna模板，0.2μl5u-μl-1taq聚合酶，2μl10×pcrbuffer，2μl2.5mmdntp，上下游引物(100μmol·l-1)各0.5μl，加ddh2o补足至20μl。pcr扩增程序采用94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，53℃复性45秒，72℃延伸1分钟，共35个循环；随后72℃延伸10分钟，pcr产物于4℃保存。pcr产物用加有eb的2％琼脂糖在100-120v电压条件下电泳40分钟，最终结果在凝胶成像系统上显示，结果如图5所示。扩增mi所用引物为一对，其序列为：mi(f)5’-tggaaaaatgttgaatttcttttg-3’，mi(r)5’-gcatactatatggcttgtttaccc-3’。多重pcr反应及凝胶电泳检测：对ty-1、ty-3和mi基因采用20μl体系同时进行扩增，分别加入2μldna模板，0.4μl5u·μl-1taq聚合酶，2μl10×pcrbuffer，2μl2.5mmdntp，ty-1-1上下游引物(100μmol·l-1)各0.4μl，ty-1-2上下游引物(100μmol·l-1)各0.2μl，ty-3上下游引物(100μmol·l-1)各0.4μl，mi上下游引物(100μmol·l-1)各0.4μl，加ddh2o补足至20μl。pcr扩增程序采用94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，56℃复性1分钟，72℃延伸2.5分钟，共35个循环；随后72℃延伸10分钟，pcr产物于4℃保存。pcr产物用加有eb的2％琼脂糖在100-120v电压条件下电泳40分钟，最终结果在凝胶成像系统上显示，结果如图6所示。对ty-1、ty-3和mi基因同时扩增所用引物为四对，其序列为：ty-1-1(f)5’-aaacgctcttcttcccctcg-3’，ty-1-1(r)5’-agttagattcaggctcctcgca-3’，ty-1-2(f)5’-tgtatgcgtcgtgttagaaggtc-3’，ty-1-2(r)5’-aatggtgacagaatcaagatccac-3’，ty-3(f)5’-ggtagtggaaatgatgctgctc-3’，ty-3(r)5’-gctctgcctattgtcccatatataacc-3’，mi(f)5’-tggaaaaatgttgaatttcttttg-3’，mi(r)5’-gcatactatatggcttgtttaccc-3’。结果：对供试的4份番茄材料通过四对引物的单基因pcr反应后，结果如图5所示。由图5可知，番茄材料c1、c8和c10均扩增产生1434bp、984bp、650bp、320bp和430bp五条带，说明这5份番茄材料均为ty-1杂合抗病，ty-3杂合抗病，mi感病。番茄材料c2扩增产生1434bp、984bp、650bp、320bp、430bp和380bp六条带，说明该材料为三种抗病基因的杂合抗病类型。对供试的4份番茄材料通过四对引物的多重pcr反应后，结果如图6所示。试验结果同单基因pcr反应结果完全一致，同时pcr分子鉴定结果同实验室之前已经鉴定出的基因型完全吻合，说明该方法能够帮助快速检测番茄ty-1、ty-3和mi基因的基因型，所得材料可以被利用在抗病种质资源的进一步选育中。以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。sequencelisting<110>上海交通大学<120>同时检测番茄ty-1、ty-3和mi基因的多重pcr法<130>dag28964<160>8<170>patentinversion3.5<210>1<211>20<212>dna<213>artificialsequence<220><223>ty-1-1（f）<400>1aaacgctcttcttcccctcg20<210>2<211>22<212>dna<213>artificialsequence<220><223>ty-1-1（r）<400>2agttagattcaggctcctcgca22<210>3<211>23<212>dna<213>artificialsequence<220><223>ty-1-2（f）<400>3tgtatgcgtcgtgttagaaggtc23<210>4<211>24<212>dna<213>artificialsequence<220><223>ty-1-2（r）<400>4aatggtgacagaatcaagatccac24<210>5<211>22<212>dna<213>artificialsequence<220><223>ty-3（f）<400>5ggtagtggaaatgatgctgctc22<210>6<211>27<212>dna<213>artificialsequence<220><223>ty-3（r）<400>6gctctgcctattgtcccatatataacc27<210>7<211>24<212>dna<213>artificialsequence<220><223>mi（f）<400>7tggaaaaatgttgaatttcttttg24<210>8<211>24<212>dna<213>artificialsequence<220><223>mi（r）<400>8gcatactatatggcttgtttaccc24当前第1页12