本发明属于生物检测
技术领域：
，尤其涉及一种唾液酸测定试剂盒及其测定方法。
背景技术：
唾液酸(sialicacid，sa)又称为n-乙酰神经氨酸，是多种天然神经氨酸衍生物之一，其母体结构是九个碳原子组成的内环氨基酸，是一族化合物的总称。唾液酸是细胞膜糖蛋白的重要组成部分，广泛分布于动物体内，人体血清中的唾液酸包括游离唾液酸和结合唾液酸，游离唾液酸的含量较低，与脂蛋白和糖蛋白结合的结合唾液酸为血清中唾液酸的主要存在形式。唾液酸与生物体的许多生物学功能有关，且与细胞恶变、癌转移、浸润、失去接触性抑制、细胞粘附性降低以及肿瘤抗原性密切相关。大量研究表明，sa作为恶性肿瘤的一种标志物，对多种恶性肿瘤具有诊断意义。正常代谢时，血清的唾液酸含量稳定，当组织细胞恶变时，细胞表面糖蛋白在结构和功能上均发生明显改变，结合在糖蛋白上的唾液酸随异常表达的糖蛋白脱落入血，是血液中唾液酸升高的可能原因。唾液酸含量的异常升高与病情的严重程度呈正比关系，测定血清唾液酸浓度，可作为癌肿诊断辅助性指标和疗效观察指标。唾液酸含量的检测方法主要包括hplc法、酶法、化学比色法。hplc法具有灵敏度高、特异性好的优点，但是仪器昂贵且操作复杂，不适合临床批量检测。化学比色法虽然价格较低，但是特异性低，操作复杂繁琐，需要高温萃取，不适合自动化分析。酶法具有特异性高，操作简单快捷、准确安全、可自动化分析的优点。中国专利申请cn101469344公开了一种酶法测定唾液酸液体双试剂，由试剂1和试剂2组成，试剂1包括神经氨酸苷酶、乳酸脱氢酶、缓冲液；试剂2包括n-乙酰神经氨酸醛缩酶、nadh和缓冲液等；试剂1和试剂2还可以包括稳定剂、表面活性剂、防腐剂，稳定剂选自mg离子、nacl、kcl、血清白蛋白、抗生素、edta类、聚乙二醇、二糖类、多元醇等。中国专利申请cn102399851公开了一种酶法唾液酸检测试剂盒，由以下两种试剂构成，试剂1包括缓冲液、神经氨酸苷酶、乳酸脱氢酶、表面活性剂、稳定剂和防腐剂；试剂2包括缓冲液、还原性辅酶、神经氨酸醛缩酶、稳定剂和防腐剂；稳定剂为聚乙二醇、丙三醇、丙二醇、蔗糖、海藻糖、山梨醇、bsa中的一种或者几种。中国专利申请cn106092942公开了一种测定唾液酸的试剂盒，包括试剂r1和试剂r2双液体组分，试剂r1包括：amp缓冲液、神经氨酸苷酶、乳酸脱氢酶、吐温-20和苯甲酸钠；试剂r1包括：amp缓冲液、nadh、神经氨酸醛缩酶、聚乙二醇2000和苯甲酸钠；通过添加聚乙二醇-2000，加快了反应的反应速度，通过添加苯甲酸钠作为防腐剂提高了试剂的稳定性。现有的试剂盒使用的稳定剂种类较多，虽然可以提高稳定性，但抗干扰能力往往不够理想。因此，提供一种稳定性好且抗干扰能力好的唾液酸测定试剂盒具有重要意义。技术实现要素：为解决现有技术中存在的问题(抗干扰能力不够理想)，本发明提供一种唾液酸测定试剂盒，通过添加一定浓度的蔗糖和三乙醇胺，在提高试剂盒稳定性的同时显著增强了抗干扰能力，可显著降低胆红素、血红蛋白和甘油三酯等的干扰，用于唾液酸的测定准确性好。本发明的目的将通过下面的详细描述来进一步说明。本发明提供一种唾液酸测定试剂盒，包括试剂r1和试剂r2，所述试剂r1包括如下组分及其浓度：三羟甲基氨基甲烷8～20g/l、hcl5～15ml/l、神经氨酸苷酶0.5～5ku/l、乳酸脱氢酶0.5～5ku/l、nadh0.1～2mmol/l；所述试剂r2包括如下组分及其浓度：三羟甲基氨基甲烷8～20g/l、hcl5～15ml/l、n-乙酰神经氨酸醛缩酶0.5～5ku/l、蔗糖25～100g/l、三乙醇胺0.6～1.2ml/l。优选地，所述试剂r1包括如下组分及其浓度：三羟甲基氨基甲烷10～15g/l、hcl6～10ml/l、神经氨酸苷酶0.5～2ku/l、乳酸脱氢酶1～3ku/l、nadh0.2～1mmol/l；所述试剂r2包括如下组分及其浓度：三羟甲基氨基甲烷10～15g/l、hcl6～10ml/l、n-乙酰神经氨酸醛缩酶1～3ku/l、蔗糖50～70g/l、三乙醇胺0.8～1.2ml/l。更优选地，所述试剂r1包括如下组分及其浓度：三羟甲基氨基甲烷12g/l、hcl8ml/l、神经氨酸苷酶1ku/l、乳酸脱氢酶2ku/l、nadh0.5mmol/l；所述试剂r2包括如下组分及其浓度：三羟甲基氨基甲烷12g/l、hcl8ml/l、n-乙酰神经氨酸醛缩酶2ku/l、蔗糖50g/l、三乙醇胺1ml/l。优选地，所述试剂r1还包括如下组分及其浓度：山梨酸钾0.8～1.2g/l；所述试剂r2还包括如下组分及其浓度：山梨酸钾0.8～1.2g/l。更优选地，所述试剂r1还包括如下组分及其浓度：山梨酸钾1g/l；所述试剂r2还包括如下组分及其浓度：山梨酸钾1g/l。优选地，本发明还提供唾液酸测定试剂盒的测定方法，包括如下步骤：分离血清样品，向血清样品中加入试剂r1，混匀，孵育3～5min后，加入试剂r2，混匀，孵育1～2min后，在405nm处测定nadh吸光度下降的速度，测得唾液酸浓度。样品中的唾液酸受神经氨酸苷酶(nrh)的作用，形成n-乙酰神经氨酸，进而在n-乙酰神经氨酸醛缩酶(nal)的作用生成丙酮酸和n-乙酰甘露糖胺。丙酮酸在nadh存在下有乳酸脱氢酶(ldh)作用下生成乳酸和nad+，测定nadh吸光度下降的速度可求得样品中的唾液酸浓度。与现有技术相比，本发明的有益效果包括：本发明通过在唾液酸测定试剂中添加一定浓度的蔗糖和三乙醇胺，可通过提高试剂r2中n-乙酰神经氨酸醛缩酶的酶活稳定性而增强唾液酸测定试剂盒的稳定性，测定试剂盒于2～8度条件的保质期长达12个月以上，同时显著增强了抗干扰能力，用于唾液酸的测定准确性好。具体实施方式下面结合实施例对本发明做进一步详细说明。本发明中，所涉及的组分均为常规市售产品，或可通过本领域的常规技术手段获得。实施例一唾液酸测定试剂盒(配方二)唾液酸测定试剂盒包括试剂r1和试剂r2，所述试剂r1包括如下组分及其浓度：三羟甲基氨基甲烷12g/l、hcl8ml/l、神经氨酸苷酶1ku/l、乳酸脱氢酶2ku/l、nadh0.5mmol/l、山梨酸钾1g/l；所述试剂r2包括如下组分及其浓度：三羟甲基氨基甲烷12g/l、hcl8ml/l、n-乙酰神经氨酸醛缩酶2ku/l、蔗糖50g/l、三乙醇胺1ml/l、山梨酸钾1g/l。实施例二唾液酸测定试剂盒唾液酸测定试剂盒包括试剂r1和试剂r2，所述试剂r1包括如下组分及其浓度：三羟甲基氨基甲烷10g/l、hcl6ml/l、神经氨酸苷酶1ku/l、乳酸脱氢酶1ku/l、nadh0.5mmol/l、山梨酸钾0.8g/l；所述试剂r2包括如下组分及其浓度：三羟甲基氨基甲烷10g/l、hcl6ml/l、n-乙酰神经氨酸醛缩酶3ku/l、蔗糖70g/l、三乙醇胺1.2ml/l、山梨酸钾0.8g/l。实施例三唾液酸测定试剂盒唾液酸测定试剂盒包括试剂r1和试剂r2，所述试剂r1包括如下组分及其浓度：三羟甲基氨基甲烷15g/l、hcl10ml/l、神经氨酸苷酶2ku/l、乳酸脱氢酶2ku/l、nadh1mmol/l、山梨酸钾1.2g/l；所述试剂r2包括如下组分及其浓度：三羟甲基氨基甲烷15g/l、hcl10ml/l、n-乙酰神经氨酸醛缩酶2ku/l、蔗糖40g/l、三乙醇胺1ml/l、山梨酸钾1.2g/l。对比例1唾液酸测定试剂盒(配方一)唾液酸测定试剂盒包括试剂r1和试剂r2，所述试剂r1包括如下组分及其浓度：三羟甲基氨基甲烷12g/l、hcl8ml/l、神经氨酸苷酶1ku/l、乳酸脱氢酶2ku/l、nadh0.5mmol/l、山梨酸钾1g/l；所述试剂r2包括如下组分及其浓度：三羟甲基氨基甲烷12g/l、hcl8ml/l、n-乙酰神经氨酸醛缩酶2ku/l、山梨酸钾1g/l。配方一与配方二的区别在于：不含蔗糖和三乙醇胺。对比例2唾液酸测定试剂盒唾液酸测定试剂盒包括试剂r1和试剂r2，所述试剂r1包括如下组分及其浓度：三羟甲基氨基甲烷12g/l、hcl8ml/l、神经氨酸苷酶1ku/l、乳酸脱氢酶2ku/l、nadh0.5mmol/l、山梨酸钾1g/l；所述试剂r2包括如下组分及其浓度：三羟甲基氨基甲烷12g/l、hcl8ml/l、n-乙酰神经氨酸醛缩酶2ku/l、蔗糖50g/l、山梨酸钾1g/l。对比例2与实施例一的区别在于：不含三乙醇胺。试验例一不同测定试剂盒的样品检测对比实验试剂：上述配方一和配方二，以及上海聚创医药科技有限公司生产的sa测定试剂盒(包括试剂r1和r2，但成分与本发明不同，以下简称为市售组)。分别将上述实验试剂用于唾液酸的检测，用au400生化分析仪同时定标同时测定40例血清样品，结果如表1所示。表1不同试剂盒测定40例血清样品的结果(单位：mmol/l)经统计，市售组测定结果与配方一测定结果的相关系数r＝0.9991、市售组测定结果与配方二测定结果相关系数r＝0.9995，配方一测定结果与配方二测定结果相关系数r＝0.9992，说明相关性良好，试剂r2中加入一定量的蔗糖和三乙醇胺不会对检测结果造成干扰，配方二与经国家食品药品监督管理局批准上市的产品无明显差异，结果准确可靠。试验例二不同测定试剂盒的加速稳定性考察对配方一和配方二分别进行37度加速破坏性实验，以考察其组分的稳定性，结果如表2所示。表2配方一和配方二经加速破坏性实验1周后的样品检测结果(单位：mmol/l)37度加速破坏性实验：指把试剂装在瓶子里并密封保存，放在37度水浴箱里面，进行加速破坏性实验，37度破坏性实验1周的时间相当于一般储存温度(2～8度)保存1年。从表2可知，未加速时，配方一的40例样品检测结果平均值为65.6，配方二的检测结果平均值为65.2，与配方一基本相当；经37度加速破坏性实验1周后，配方一的检测结果平均值为38.9，配方二的检测结果平均值为63.7。配方一经破坏性实验1周后的样品检测结果均显著下降，平均下降幅度达到了40.7％，而配方二由于含有一定量的蔗糖和三乙醇胺，经破坏性实验1周后的样品检测结果并未发生明显变化，平均下降幅度仅为2.3％，属于合理范围。平均下降幅度＝(未加速时的均值－加速1周的均值)/未加速时的均值。为考察配方一经37度加速1周后的检测结果显著下降的具体原因，进行以下实验：分别在配方一经过37度加速1周后的r1和r2中分别补加其主要组分神经氨酸苷酶nrh或n-乙酰神经氨酸醛缩酶nal，加入量分别为相应初始浓度的50％，然后分别检测试剂1至试剂4的结果如表3所示。表3试剂1至试剂4的样品检测结果(单位：mmol/l)样品序号12345678910试剂194.564.223.182.119.472.6101.958.538.8118.7试剂263.245.611.441.410.244.349.748.218.671.2试剂367.843.911.345.212.145.040.643.412.165.1试剂490.563.822.880.11979.5106.955.235.1112.8样品序号11121314151617181920试剂164.1104.957.823.537.585.792.810.396.270.5试剂241.369.741.610.817.644.473.15.670.740.1试剂348.163.243.110.618.742.763.45.464.642.6试剂462.3102.155.422.936.482.391.210.190.273.5样品序号21222324252627282930试剂181.523.033.155.294.764.5116.471.341.921.9试剂243.110.912.645.568.241.371.049.620.210.8试剂346.712.611.449.263.446.566.241.821.711.3试剂485.521.830.354.693.960.2111.878.639.620.1样品序号31323334353637383940试剂163.555.697.178.319.846.9102.489.232.8115.4试剂244.646.960.442.110.927.468.141.816.562.3试剂346.743.874.540.911.428.665.440.413.271.1试剂458.954.194.676.219.745.6100.288.631.0113.2试剂1：r1和r2都未经加速；试剂2：r1和r2均经37度加速1周；试剂3：r1和r2均经37度加速1周，并在r1中补加入nrh0.5ku/l；试剂4：r1和r2均经37度加速1周，并在r2中补加入nal1ku/l。从表3可知：1.试剂2(不补加nrh和nal)经加速实验后测值与试剂1有明显差异；2.试剂3(单独补加入nrh)经加速实验后测值与试剂1有明显差异，与试剂2测值基本一致，说明试剂r1中nrh没有失活；3.试剂4(单独补加入nal)经加速实验后测值与试剂1无明显差异，与试剂2的测值相比有明显增加，说明试剂r2中nal有明显失活。进一步，通过活性测定法分别检测配方一的r2试剂和配方二的r2试剂在未加速和37度加速1周时的nal的活力，各检测20次，结果如表4和表5所示。表4配方一的r2试剂检测的nal活力(单位：ku/l)表5配方二的r2试剂检测的nal活力(单位：ku/l)从表4和表5可以看出，配方一经加速1周，nal失活严重，失活比例达到了47.5％，而配方二由于加入一定量的蔗糖和三乙醇胺，nal失活仅为4.0％，说明蔗糖和三乙醇胺对nal有较好的保护作用。试验例三蔗糖和三乙醇胺在试剂r2中的用量考察配方一如下：r1:三羟甲基氨基甲烷12g/l、hcl8ml/l、神经氨酸苷酶1ku/l、乳酸脱氢酶2ku/l、nadh0.5mmol/l、山梨酸钾1g/l；r2:三羟甲基氨基甲烷12g/l、hcl8ml/l、n-乙酰神经氨酸醛缩酶2ku/l、山梨酸钾1g/l。配方二如下：r1:三羟甲基氨基甲烷12g/l、hcl8ml/l、神经氨酸苷酶1ku/l、乳酸脱氢酶2ku/l、nadh0.5mmol/l、山梨酸钾1g/l；r2:三羟甲基氨基甲烷12g/l、hcl8ml/l、n-乙酰神经氨酸醛缩酶2ku/l、蔗糖50g/l、三乙醇胺1ml/l、山梨酸钾1g/l。配方三如下：r1:三羟甲基氨基甲烷12g/l、hcl8ml/l、神经氨酸苷酶1ku/l、乳酸脱氢酶2ku/l、nadh0.5mmol/l、山梨酸钾1g/l；r2:三羟甲基氨基甲烷12g/l、hcl8ml/l、n-乙酰神经氨酸醛缩酶2ku/l、蔗糖10g/l、三乙醇胺1ml/l、山梨酸钾1g/l。配方四如下：r1:三羟甲基氨基甲烷12g/l、hcl8ml/l、神经氨酸苷酶1ku/l、乳酸脱氢酶2ku/l、nadh0.5mmol/l、山梨酸钾1g/l；r2:三羟甲基氨基甲烷12g/l、hcl8ml/l、n-乙酰神经氨酸醛缩酶2ku/l、蔗糖25g/l、三乙醇胺1ml/l、山梨酸钾1g/l。配方五如下：r1:三羟甲基氨基甲烷12g/l、hcl8ml/l、神经氨酸苷酶1ku/l、乳酸脱氢酶2ku/l、nadh0.5mmol/l、山梨酸钾1g/l；r2:三羟甲基氨基甲烷12g/l、hcl8ml/l、n-乙酰神经氨酸醛缩酶2ku/l、蔗糖100g/l、三乙醇胺1ml/l、山梨酸钾1g/l。为考察蔗糖在试剂r2中的用量，通过活性测定法分别检测配方一至配方五在未加速和37度加速1周时nal的活力，结果如表6所示。表6配方一至配方五在未加速和37度加速1周时nal的活力(单位：ku/l)从表6可以看出，配方一的nal失活严重，失活比例达到了46.9％，加入一定量的蔗糖和三乙醇胺后的配方二至配方五分别为：3.5％，23.4％，11.6％，4.1％。说明蔗糖在试剂r2中的加入量25～100g/l且三乙醇胺的加入量1ml/l时均能起到较好的保护作用。此外，分别对配方一至配方五的配方反应曲线进行检测，配方一至配方五的反应迅速，说明加样量即使100g/l也不会抑制反应的快速进行。因此，配方二(蔗糖的加入量为50g/l、三乙醇胺的加入量为1ml/l)的综合效果最佳。试验例四测定试剂盒的抗干扰能力测试人血清成份复杂，其中的胆红素和血红蛋白等可引起试剂盒测定的干扰，造成检测结果的差异。检测临床样品胆红素、血红蛋白浓度，筛选合适浓度样品。取一份无溶血血清样品，分成若干份，依次加入不同浓度的干扰物(胆红素或血红蛋白)，分别使用配方一、配方二以及对比例2的试剂盒对添加胆红素或血红蛋白的血清样品进行检测唾液酸，剩余2份未加干扰物，进行抗干扰能力测试。相对偏差(％)＝(加入干扰物质-未加)/未加。配方一如下：r1:三羟甲基氨基甲烷12g/l、hcl8ml/l、神经氨酸苷酶1ku/l、乳酸脱氢酶2ku/l、nadh0.5mmol/l、山梨酸钾1g/l；r2:三羟甲基氨基甲烷12g/l、hcl8ml/l、n-乙酰神经氨酸醛缩酶2ku/l、山梨酸钾1g/l。配方二如下：r1:三羟甲基氨基甲烷12g/l、hcl8ml/l、神经氨酸苷酶1ku/l、乳酸脱氢酶2ku/l、nadh0.5mmol/l、山梨酸钾1g/l；r2:三羟甲基氨基甲烷12g/l、hcl8ml/l、n-乙酰神经氨酸醛缩酶2ku/l、蔗糖50g/l、三乙醇胺1ml/l、山梨酸钾1g/l。对比例2如下：r1:三羟甲基氨基甲烷12g/l、hcl8ml/l、神经氨酸苷酶1ku/l、乳酸脱氢酶2ku/l、nadh0.5mmol/l、山梨酸钾1g/l；r2:三羟甲基氨基甲烷12g/l、hcl8ml/l、n-乙酰神经氨酸醛缩酶2ku/l、蔗糖50g/l、山梨酸钾1g/l。检测结果如表7和表8所示。表7试剂盒的抗胆红素干扰能力测试结果注：胆红素0指胆红素的浓度为0μmol/l，胆红素50指胆红素的浓度为50μmol/l。表8试剂盒的抗血红蛋白干扰能力测试结果注：血红蛋白0指血红蛋白的浓度为0g/l，血红蛋白1.0指血红蛋白的浓度为1.0g/l。由表7和表8可知，随着血清中含有的干扰物胆红素或血红蛋白浓度增大，检测结果的相对偏差上升。其中，以配方二的相对偏差最小，干扰物胆红素的浓度为200μmol/l时的相对偏差为7.4％，远低于配方一和对比例2的相对偏差，配方一和对比例2相对偏差均超过12％；干扰物血红蛋白的浓度为2.0g/l时的相对偏差为6.9％，远低于配方一和对比例2的相对偏差，配方一和对比例2相对偏差均超过15％。可见，本发明提供的配方二可显著降低胆红素和血红蛋白的干扰，抗干扰能力较强。综上所述，本发明提供给的唾液酸测定试剂盒在提高稳定性的同时，显著增强了抗干扰能力，反应速度快，检测准确性好。以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。当前第1页12