本发明涉及酿酒的酯化剂的技术领域。具体涉及一种酿造酒的酯化红曲制备方法。
背景技术：
红曲在我国民间的酿造历史上就有着广泛的应用,在酿造酒发酵过程中起到糖化、发酵、酯化作用。在中国固态白酒的大曲微生物的研究中,发现含红曲霉的大曲,对生产大曲酒更有特殊的增香功能,尤其是浓香型大曲酒增加己酸乙酯含量功能显著。不少专家对红曲在大曲中的增香功能做出肯定。吴衍庸先生在烟色红曲霉酯酶特性及在中国酒上的应用做出开拓性工作；庄名扬等将红曲霉加入自然曲中,制成酯化曲与传统大曲相比亦收到良好效果。任鹿海,等.高活性红曲酯化菌的分离及在黄浆水酯化技术中的应用研究。
酯化红曲霉菌种具有耐高温、耐高酒精度、耐高酸度的特性，它以乳酸为碳源，可有效降解乳酸及其乳酸乙酯的生成。酯化红曲在酿造酒生产中的应用可有效提高酯化红曲的酯化力，促进有机酸转化成相应的酯，且其对己酸和乙酸转化成己酸乙酯和乙酸乙酯具有很强的选择性；同时，因其耐酸性较强，使有机酸转化成相应的酯，解除了酸对微生物细胞的毒害作用；其产生的蛋白酶也可丰富了酒的香味成分。
但是，单一的红曲霉菌株制备的酯化红曲，在酿造酒生产实践中，有时出现增香效果不显著，为此，为了提高酯化红曲的酯化能力,采用多菌种酯化性能好的红曲霉菌种，配合产酯生香的酿酒酵母，采用创新工艺制成酿造用的酯化率高的酯化红曲，应用于酿造酒的生产过程进行酯化产生酯类，具有特殊的增香功能，特别是酿造大曲酒增加己酸乙酯、乙酸乙酯含量功效显著。对于改善酿造酒的风味，提高产品质量有现实意义。
技术实现要素：
本发明选用酯化活性高烟色红曲霉、丛毛红曲霉和生香酿酒酵母菌，以现代生物发酵技术，将烟色红曲霉液态发酵制成液态种子、丛毛红曲霉固态通风培养制成固态种子，烟色红曲霉液态种子与丛毛红曲霉固态种子合并为混合红曲霉种子液，制曲过程喷淋酵母菌进行培养及保湿，以固态通风培养成酯化红曲。本发明技术提高酯化红曲的酯化力,缩短制曲周期，提高酯化红曲优质品率。在酿造黄酒、固态白酒过程添加酯化红曲，具有特殊的增香功能。
为实现本发明的目的采用的技术方案如下：
(1)浸米:取籼米淘净，加水浸米。根据气候变化，控制浸米水温18～25℃，浸米1.5～2.5小时。浸米完成时，两手指间搓米能散开。
(2)蒸熟、摊饭：米沥干，放入蒸饭机蒸熟，将饭在摊床上用降温至37～42℃。
(3)拌种:按饭定量拌入10～15％重量份混合红曲霉接种液，混匀后再集中装消毒麻袋内,放到曲房。
(4)堆曲、通风培养:入曲房后经过18小时，消毒麻袋内曲饭中心品温上升46～50℃，此时将曲饭从消毒麻袋倒出，平铺曲床上。曲饭倒在曲床上后降温至35～37℃，集中堆积成曲堆，盖上干净麻袋保温；自动升温到48～50℃时，把曲饭堆散开,平铺于在曲床上，又堆曲成堆。堆曲发酵经过30～38小时，曲饭中红曲霉己大量繁殖,曲饭粒表面出现白点，逐渐增多转为部分红点,这现象俗称“出铺”。
出铺后，平铺于在曲床上曲饭进行间歇通风降温培养28～34小时，间歇通风降温期间曲饭温度控制在38～40℃，曲饭粒表面均匀被白点覆盖，开始转红时转入下一工序。
(5)喷淋酿酒酵母悬浮液：翻动曲床上曲饭，按曲饭重量的10～20％进行第1次喷淋酿酒酵母悬浮液。曲饭升温至42℃时，翻动曲床上曲饭，按曲饭重量的8～12％进行第2次喷淋酿酒酵母悬浮液，曲饭温度调节控制38～40℃。曲饭再次升温至42℃时，翻动曲床上曲饭，按曲饭重量的4～6％进行第3次喷淋酿酒酵母悬浮液，以后还可以视酯化红曲培养的状况，适量喷淋酿酒酵母悬浮液。曲房控制湿度75％～85％，经过46～50小时，曲饭转红。
(6)后发酵：曲饭转红后，通风次数减少，控制品温在32～37℃，第6天上、下午各翻曲通风1次,曲粒中心红而带白芯,至第7天上、下午各翻曲通风1次，曲饭粒中心红色。出曲,将酯化红曲热风45～50℃干燥或置阳光下晒干,得到本发明所制备的酯化红曲成品。
所述的混合红曲霉接种液，其制备过程如下：
取3重量份烟色红曲霉液态种子液和1重量份丛毛红曲霉固态种子粉混合均匀，添加少量清水调成浓稠的混合红曲霉接种液。并用三年酿造的,酸度为≥60g/L的红曲醋调成pH值4.5。
红曲菌种的制备关键技术是为了使红曲霉快速繁殖，在培养过程为优势菌，抑制杂菌的繁殖为目的。所以我们创新地采用红曲霉的液态与固态种子混合接种的新技术，新技术使得可以获取红曲霉液态种子的菌丝和红曲霉固态种子的孢子，接种后“出铺”快，保证红曲霉生长速率，制备优级品酯化红曲。
所述的烟色红曲霉液态种子液，其制备过程如下：
(1)试管斜面种子：将烟色红曲霉Monascus fuliginosus编号3.1098菌株接种在试管的红曲霉斜面培养基中，于32℃生物培养箱中培养7天，得到试管斜面种子，取出放置4℃冰箱中保藏备用。
(2)茄子瓶种子制备：将步骤(1)得到的试管斜面种子接种于茄子瓶的红曲霉斜面培养基中，置于30℃生化培养箱中培养7天，移到室内放置3天后。将无菌水倒入茄子瓶中，用灭菌的玻棒，刮下瓶内斜面上烟色红曲霉种子，再加适量水摇动，倾入接种瓶，得到烟色红曲霉种子供种子罐接种用。
(3)将接种瓶的烟色红曲霉种子接入预先配置有红曲霉种子罐培养基的种子罐内进行50～55小时发酵培养，得到成熟的烟色红曲霉液态种子液。其中前8小时发酵培养温度33～34℃，通气比：0.8L/(L·min)；8小时后发酵培养温度31～32℃，通气比1.0L/(L·min)。
种子罐内成熟的烟色红曲霉液态种子液移种前镜检：菌丝健壮，无杂菌，培养正常。
所述的丛毛红曲霉种子固态固态种子粉制备过程如下：
(1)试管斜面种子：将筛选得到的丛毛红曲霉Monascus pilosus菌株接种于试管内的红曲霉斜面培养基上，于32℃生物培养箱中培养7天得到丛毛红曲霉种子，取出放置4℃冰箱中保藏备用。
(2)丛毛红曲霉种子液制备：将丛毛红曲霉种子接种于茄子瓶的红曲霉斜面培养基中，置于30℃生化培养箱中，培养7天后，移到室内放置3天后，将无菌水倒入茄子瓶中，用灭菌的玻棒，刮下瓶内斜面上丛毛红曲霉种子，加适量水摇动，再加入陈酿三年、酸度为≥60g/L的红曲醋调成pH值3.5～3.8，得到丛毛红曲霉种子液。
(3)在无菌操作下，将2～4毫升丛毛红曲霉种子液接入到三角瓶内米饭上并拌匀进行固态扩培。
所述的三角瓶内米饭，米饭平铺厚度3cm，旋转三角瓶使米饭层中间略薄。固态扩培温度控制在33～34℃。
经过15～17小时固态扩培,大部分米饭上可看到菌丝生长时，扣瓶一次。扣瓶后应将饭料摊平,温度控30～32℃。
再经8～10小时,饭粒上长满菌丝体。看到菌丝转为微红色时,加入无菌水2毫升。以后每天扣瓶2～3次并视瓶中曲料的干湿程度,酌情加人无菌水进行调湿，从接种到成熟，固态扩培周期是8～9天，得到成熟曲种。
将成熟曲种在40～45℃下进行热风烘干，使水分降到12％以下，粉碎得到丛毛红曲霉固态种子粉备用。
曲种检验：首先外观应是色泽鲜红，发酵均匀，无杂菌污染，固有曲香，成熟率达98％以上，其次进行镜检，在600倍的显微镜下观察，成熟的曲种应有较多成熟闭囊壳。
所述的筛选得到的丛毛红曲霉，通过如下方式得到：原始菌株购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，的丛毛红曲霉(Monascus pilosus)试管菌株；将原始菌株进行接种平板分离到菌落特征好的10株丛毛红曲霉菌株，将其进行酯化酶的酶活测试筛选，筛选1株酯化酶的活性高、产酯能力强的丛毛红曲霉菌株，其编号为CICC 41445。
所述的烟色红曲霉，通过如下方式得到：取购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为3.1098的烟色红曲霉(Monascus fuliginosus)试管菌株，进行接种平板分离到菌落特征好的8株烟色红曲霉菌株，将其进行酯化酶的酶活测试筛选，挑选1株酯化酶的活性高、产酯能力强的烟色红曲霉菌株。
所述的红曲霉斜面培养基，其配方为：8°Bx米曲汁50毫升；10°Bx麦芽汁50毫升；可溶性淀粉3克；蛋白胨2克；营养盐0.05克；冰乙酸0.5毫升；琼脂3克；95％乙醇4毫升。营养盐0.05克的配比：硝酸钠0.02克；硫酸铵0.01克；磷酸二氢钾0.02克。
所述的红曲霉种子罐培养基，其配方为：大米粉4％，大豆饼粉2％，山药粉2％，麸皮2％，营养盐0.5克，水1000mL，添加三年酿造的,酸度为≥60g/L的红曲醋调pH值4.5。营养盐0.5克的配比：硝酸钠0.2克；硫酸铵0.1克；磷酸二氢钾0.2克。
所述的8°Bx米曲汁，其制备过程如下：
(1)蒸饭：糯米清洗后，清水浸泡6h至米粒呈乳白色，将水沥干，倒入蒸饭机连续蒸饭，得到熟透的糯米饭。
(2)淋饭搭窝：糯米饭经过输送带喷水淋饭，让饭粒吸水膨胀，糯米饭冷却温度控制在40℃。每个酒缸倒入50斤糯米的蒸饭量，加入甜酒药和红曲粉，拌匀，压平实，中间挖个井状窝，进行搭窝糖化。
(3)糖化：搭窝糖化48h后，井状窝中出现少量糖化液，冲入清水，停留24小时，可以通过压榨过滤得到浅黄色的浓甜味米曲汁。用时将滤液稀释至所需糖度。
所述的10°Bx麦芽汁，其制备过程如下：
称1500g麦芽粉,加水4500ml，置于55℃保温水浴糖化4小时，即可取出过滤。将滤液装瓶灭菌备用。用时将滤液稀释至所需糖度。
所述的酿酒酵母悬浮液，通过如下制备方式得到：
(1)试管斜面种子：将产脂生香酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株接种于试管内的酿酒酵母斜面培养基上，于30℃生物培养箱中培养5～7天，得到酿酒酵母试管斜面种子，取出放置4℃冰箱中保藏备用。
(2)产脂生香酿酒酵母液体培养：将酿酒酵母试管斜面种子接种到内装50mL10°Bx麦芽汁的液体大试管，在30℃下培养24小时备用；将液体大试管内酿酒酵母液接种到1000mL三角瓶中，内装有500mL10°Bx麦芽汁，在28℃培养36小时得到酿酒酵母扩大培养液备用；(3)酿酒酵母悬浮液：将酿酒酵母扩大培养液经过离心机，每分钟5000转离心，倒掉上清液，留下酵母泥状沉淀。加入10℃无菌水，按重量计比例无菌水：酵母泥＝2000：100，混合振荡制备成酿酒酵母悬浮液，现做现用。
酿酒酵母斜面培养基：5°Bé麦芽汁1.0L，琼脂15.0g，自然pH。
所述的产脂生香酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株编号：质粒保藏编号：CICC32235，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。
采用本发明所述的制曲方法制备的酯化红曲，与传统方法制备酯化红曲比较：
新旧(传统)制曲方法比较
注：1、表中己酸乙酯量是酿造大曲酒过程的100mL馏出液所含己酸乙酯的毫克数。
2、酯化红曲的糖化力、发酵力、酯化力测定按照QBT4257-2011标准。
以上说明：采用本发明所述的制曲方法可有效提高酯化红曲的酯化能力,缩短制曲周期，提高酯化红曲优质品率。添加酯化红曲酿造大曲酒增加己酸乙酯含量功效显著。
具体实施
实施例1
(1)浸米:取1000kg籼米淘净，加水浸米，水面高于米20公分。根据气候变化，控制浸米水温25℃，浸米1.5小时。浸米完成时，两手指间搓米能散开。
(2)蒸熟、摊饭：米沥干，放入蒸饭机蒸熟，将饭在摊床上用降温至42℃。
(3)拌种:按饭定量拌入15％重量份混合红曲霉接种液，混匀后再集中装消毒麻袋内,放到曲房。
(4)堆曲、通风培养:入曲房后经过18小时，消毒麻袋内曲饭中心品温上升48℃，此时将曲饭从消毒麻袋倒出，平铺曲床上。曲饭倒在曲床上后降温至35℃，集中堆积成曲堆，盖上干净麻袋保温；自动升温到50℃时，把曲饭堆散开,平铺于在曲床上，又堆曲成堆。堆曲发酵经过32小时，曲饭中红曲霉己大量繁殖,曲饭粒表面出现白点，逐渐增多转为部分红点,这现象俗称“出铺”。
出铺后，平铺于在曲床上曲饭进行间歇通风降温培养34小时，间歇通风降温期间曲饭温度控制在38℃，曲饭粒表面均匀被白点覆盖，开始转红时转入下一工序。
(5)喷淋酿酒酵母悬浮液：翻动曲床上曲饭，进行第1次喷淋按曲饭量15％酿酒酵母悬浮液。曲饭升温至42℃时，翻动曲床上曲饭，进行第2次喷淋按曲饭量10％酿酒酵母悬浮液，曲饭温度调节控制38～40℃。曲饭再次升温至42℃时，翻动曲床上曲饭，进行第3次喷淋按曲饭量6％酿酒酵母悬浮液，以后还可以视酯化红曲培养的状况，适量喷淋酿酒酵母悬浮液。曲房控制湿度75％～85％，经过50小时，曲饭转红。
(6)后发酵：曲饭转红后，通风次数减少，控制品温在32～35℃，第6天上、下午各翻曲通风1次,曲粒中心红而带白芯,至第7天上、下午各翻曲通风1次，曲饭粒中心红色。出曲,将酯化红曲热风45～50℃干燥或置阳光下晒干,得到本发明所制备的酯化红曲成品。
经检测本批次生产酯化红曲糖化力1093mg/g.h、酯化686mg/50g.7d、发酵力4.4g/0.5g.72h，属于内控标准的优级酯化红曲。
所述的混合红曲霉接种液、酿酒酵母悬浮液的制备按照上述技术方案。
实施例2
(1)浸米:取500kg籼米淘净，加水浸米，水面高于米20公分。根据气候变化，控制浸米水温20℃，浸米2.0小时。浸米完成时，两手指间搓米能散开。
(2)蒸熟、摊饭：米沥干，放入蒸饭机蒸熟，将饭在摊床上用降温至39℃。
(3)拌种:按饭定量拌入12％重量份混合红曲霉接种液，混匀后再集中装消毒麻袋内,放到曲房。
(4)堆曲、通风培养:入曲房后经过18小时，消毒麻袋内曲饭中心品温上升46℃，此时将曲饭从消毒麻袋倒出，平铺曲床上。曲饭倒在曲床上后降温至36℃，集中堆积成曲堆，盖上干净麻袋保温；自动升温到50℃时，把曲饭堆散开,平铺于在曲床上，又堆曲成堆。堆曲发酵经过36小时，曲饭中红曲霉己大量繁殖,曲饭粒表面出现白点，逐渐增多转为部分红点,这现象俗称“出铺”。
出铺后，平铺于在曲床上曲饭进行间歇通风降温培养30小时，间歇通风降温期间曲饭温度控制在38～40℃，曲饭粒表面均匀被白点覆盖，开始转红时转入下一工序。
(5)喷淋酿酒酵母悬浮液：翻动曲床上曲饭，进行第1次喷淋按曲饭量20％酿酒酵母悬浮液。曲饭升温至42℃时，翻动曲床上曲饭，进行第2次喷淋按曲饭量8％酿酒酵母悬浮液，曲饭温度调节控制38～40℃。曲饭再次升温至42℃时，翻动曲床上曲饭，进行第3次喷淋按曲饭量5％酿酒酵母悬浮液，以后还可以视酯化红曲培养的状况，适量喷淋酿酒酵母悬浮液。曲房控制湿度75％～85％，经过48小时，曲饭转红。
(6)后发酵：曲饭转红后，通风次数减少，控制品温在32～34℃，第6天上、下午各翻曲通风1次,曲粒中心红而带白芯,至第7天上、下午各翻曲通风1次，曲饭粒中心红色。出曲,将酯化红曲热风45～50℃干燥或置阳光下晒干,得到本发明所制备的酯化红曲成品。
经检测本批次生产酯化红曲糖化力1106mg/g.h、酯化691mg/50g.7d、发酵力4.1g/0.5g.72h，属于内控标准的优级酯化红曲。
所述的混合红曲霉接种液、酿酒酵母悬浮液的制备按照上述技术方案。