本发明属于生物工程技术领域，具体地说，涉及一种用于化妆品防腐剂的水母抗菌肽及其制备方法。
背景技术：
化妆品是指以涂抹、喷洒或者其他类似方法，散布于人体表面的任何部位，以达到清洁、保养、美容、修饰和改变外观，或者修正人体气味，保持良好状态为目的的化学工业品或精细化工产品。近年来，世界各国化妆品行业发展迅速，人类使用化妆品越来越普遍，化妆品已成为人类增香添美的生活必需品。化妆品美白抗氧、保湿补水、祛痘除印、紧肤抗皱、淡斑祛疤、洁面卸妆、控油排毒、敏感肌肤、美白补水、收缩毛孔、美容养颜、防容颜衰老、排毒养颜、保湿隔离的功效，因而备受大众的喜爱。随着科技的进步化妆品的营养成分也越来越多，如：蛋白质、氨基酸、海洋多糖、珍珠粉、胚胎提取液、维生素，甚至微量元素及稀有矿物质等，能给大多数微生物提供了生长所需的养分，环境中的微生物一旦进入，即可迅速繁殖，破坏产品的感官品质，损害消费者的健康。
防腐剂是指天然或合成的化学成分，用于加入食品、药品、颜料、生物标本等，以延迟微生物生长或化学变化引起的腐败。目前大多数化妆品公司所使用的都是化学合成防腐剂，而化学合成防腐剂均存在刺激性大、毒性大的缺陷，安全性方面不是非常令人满意。现在消费者对化妆品安全性特别关注，倾向于使用天然、无刺激、无皮肤过敏等问题的产品。近年来，随着人们对防腐剂抑制微生物机理的不断认识，加之化学合成防腐剂存在的安全性问题，从天然产物中寻找安全高效的抑菌活性物质已成为化妆品研究的热点，具有很好的发展前景，已经成为化妆品防腐剂研究的新发展方向。
抗菌肽是一类由基因编码或蛋白酶解而成的两亲性多肽，具有广谱抗菌活性和免疫调节活性，是机体免疫防御的重要组成部分，普遍存在于生物体中。抗菌肽具有广谱抗菌活性，可以快速查杀靶标，并且其中很多是纯天然的肽，抗菌肽的广谱查杀范围为：革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌、真菌、寄生虫、肿瘤细胞等。抗菌肽具有抗菌效果好，对环境友好，绿色无污染等特点，将抗菌肽应用于化妆品防腐，是一种绿色环保的项目。目前抗菌肽应用于化妆品防腐还没有实现规模化和产业化。
技术实现要素：
本发明提供了一种用于用于化妆品防腐剂的水母抗菌肽及其制备方法，可以解决现有化妆品在抗菌防腐存在抗菌能力不足，抗菌谱不够广，不环保，不安全等诸多问题。
本发明根据水母抗菌肽的杀菌特点，设计了一种新型抗菌肽氨基酸序列。在此基础上，选用毕赤酵母偏爱密码子，人工合成新型抗菌肽基因，克隆于毕赤酵母中表达，获得新型抗菌肽重组酵母菌株，并将发酵规模放大到发酵罐水平，实现抗菌肽产品的高密度发酵和高效表达。发酵液进一步纯化后制成粉剂、液体等抗菌肽制剂。抗菌肽制剂可作为化妆品防腐剂。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案予以实现：水母抗菌肽，所述抗菌肽具有如下氨基酸序列：aacsdrahghicesfksfckdsgrngvklranckktcglc。
进一步地，上述水母抗菌肽的制备方法，包括如下步骤：
（1）抗菌肽基因的合成
根据水母抗菌肽氨基酸序列，选用毕赤酵母偏好密码子，合成抗菌肽基因序列，并在其n端引入kex2酶切位点，两端引入xhoi和xbai酶切位点，以便于克隆入毕赤酵母表达载体中，另设计合成一对引物p1和p2，用于重组载体及重组酵母菌的鉴定，上游引物位于抗菌肽基因区，下游引物位于毕赤酵母3’aox基因区；
引物序列为：p1：5'—tcgtcgggaatgcccaaatc—3'，p2：5'—gcagattacat'tcaagtcatgc—3'；
（2）抗菌肽表达载体的构建与鉴定
将含抗菌肽基因的载体和表达载体均用xhoi和xbai双酶切，酶切产物回收并连接，进行pcr测序鉴定；
（3）重组阳性质粒转化酵母菌株与筛选
阳性质粒经saci单酶切线性化后加入毕赤酵母感受态细胞悬液中，电转化后均匀涂布于含100μg/mlzeocin的ypds选择平板上，28~30℃培养3~5天，待ypds平板上的阳性转化子生长较大，将各转化子依次点种至含zeocin200μg/ml，500μg/ml，1000μg/ml的ypds选择平板，以在高浓度zeocin平板上正常生长的菌落为可能高拷贝重组菌株；
提取可能的高拷贝重组酵母基因组dna，以p1、p2为引物进行pcr反应，pcr产物用1%琼脂糖凝胶电泳观察，扩增的条带重组子进行阳性转化子鉴定；
（4）阳性克隆的诱导表达
将筛选到的阳性重组菌单菌落接种于含100μg/mlzeocin的ypd培养液中，28~30℃振摇培养18~24个小时，取此菌液按3~5%体积比转接于10mlbmgy培养基中，28~30℃摇振培养12~20h左右，od600值为5~6，培养物直接转接于30~50mlbmmy培养基中，28~30℃继续摇振培养，为了维持诱导表达，每隔15~20h补加100%甲醇使终浓度达1~2%，40~50h后，在4℃条件下，4000~6000r/min离心10~15min，收集上清，进行抑菌活性测定。
进一步地，经上述制备方法得到的高产抗菌肽的阳性重组子（重组毕赤酵母菌株），为高密度、高效表达的发酵罐生产工艺。
所述的水母抗菌肽制剂具体制备工艺如下：将筛选得到的阳性重组子活化后按4~8%接种量接种于三角瓶，28~30℃，150~200r/min摇床培养18~24h后以4~8%接种量接入发酵罐，在28~30℃，150~200r/min，ph值5.0~6.0，通气量0.5~1.0vvm（1l发酵液1min通入的氧气量），溶氧>20%情况下进行发酵，在培养18~24h后，流加50%甘油，待溶氧突然升至100%时流加甲醇至发酵结束，整个发酵持续48~72h；
发酵结束后原罐蒸汽100℃灭菌10~15min，放料，5000~6000r/min离心10~20min，收集发酵上清即为抗菌肽半成品；
上述抗菌肽半成品喷雾干燥或冻干生产的粉剂和以生化方法精制、纯化后得到液体制剂，即为抗菌肽产品。
更进一步地，上述抗菌肽产品可作为化妆品防腐剂。
本发明设计的新型抗菌肽与国内外同类产品相比，生产工艺简单，生产成本低，抑菌能力强，且抗菌谱广，极具市场前景。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明做进一步的描述。在本发明中，若非特指，所有百分比均为重量单位，所有设备和原料均可从市场购得或是本行业常用的，下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域常规方法。
实施例1
一种用于试剂盒防腐剂的水母抗菌肽，所述抗菌肽具有如下氨基酸序列：aacsdrahghicesfksfckdsgrngvklranckktcglc。
水母抗菌肽的制备方法，包括如下步骤：
（1）抗菌肽基因的合成
根据水母抗菌肽氨基酸序列，选用毕赤酵母偏好密码子，合成抗菌肽基因序列，并在其n端引入kex2酶切位点，两端引入xhoi和xbai酶切位点，以便于克隆入毕赤酵母表达载体中，另设计合成一对引物p1和p2，用于重组载体及重组酵母菌的鉴定，上游引物位于抗菌肽基因区，下游引物位于毕赤酵母3’aox基因区；
引物序列为：p1：5'—tcgtcgggaatgcccaaatc—3'，p2：5'—gcagattacat'tcaagtcatgc—3'；
（2）抗菌肽表达载体的构建与鉴定
将含抗菌肽基因的载体和表达载体均用xhoi和xbai双酶切，酶切产物回收并连接，进行pcr测序鉴定；
（3）重组阳性质粒转化酵母菌株与筛选
阳性质粒经saci单酶切线性化后加入毕赤酵母感受态细胞悬液中，电转化后均匀涂布于含100μg/mlzeocin的ypds选择平板上，28℃培养4天，待ypds平板上的阳性转化子生长较大，将各转化子依次点种至含zeocin200μg/ml，500μg/ml，1000μg/ml的ypds选择平板，以在高浓度zeocin平板上正常生长的菌落为可能高拷贝重组菌株；
提取可能的高拷贝重组酵母基因组dna，以p1、p2为引物进行pcr反应，pcr产物用1%琼脂糖凝胶电泳观察，扩增的条带重组子进行阳性转化子鉴定；
（4）阳性克隆的诱导表达
将筛选到的阳性重组菌单菌落接种于含100μg/mlzeocin的ypd培养液中，28℃振摇培养20个小时，取此菌液按3%体积比转接于10mlbmgy培养基中，30℃摇振培养15h左右，od600值为6，培养物直接转接于30mlbmmy培养基中，28℃继续摇振培养，为了维持诱导表达，每隔15h补加100%甲醇使终浓度达1.0%，40h后，在4℃条件下，5000r/min离心15min，收集上清，进行抑菌活性测定。
水母抗菌肽具体制备工艺如下：将筛选得到的阳性重组子活化后按4%接种量接种于三角瓶，28℃，160r/min摇床培养20h后以6%接种量接入发酵罐，在30℃，180r/min，ph值6.0，通气量0.8vvm（1l发酵液1min通入的氧气量），溶氧>20%情况下进行发酵，在培养18h后，流加50%甘油，待溶氧突然升至100%时流加甲醇至发酵结束，整个发酵持续48h；发酵结束后原罐蒸汽100℃灭菌10min，放料，6000r/min离心12min，收集发酵上清即为抗菌肽半成品；
上述抗菌肽半成品喷雾干燥或冻干生产的粉剂和以生化方法精制、纯化后得到液体制剂，即为抗菌肽产品，可作为化妆品防腐剂。
实施例2
一种用于试剂盒防腐剂的水母抗菌肽，所述抗菌肽具有如下氨基酸序列：aacsdrahghicesfksfckdsgrngvklranckktcglc。
水母抗菌肽的制备方法，包括如下步骤：
（1）抗菌肽基因的合成
根据水母抗菌肽氨基酸序列，选用毕赤酵母偏好密码子，合成抗菌肽基因序列，并在其n端引入kex2酶切位点，两端引入xhoi和xbai酶切位点，以便于克隆入毕赤酵母表达载体中，另设计合成一对引物p1和p2，用于重组载体及重组酵母菌的鉴定，上游引物位于抗菌肽基因区，下游引物位于毕赤酵母3’aox基因区；引物序列为：p1：5'—tcgtcgggaatgcccaaatc—3'，p2：5'—gcagattacat'tcaagtcatgc—3'；
（2）抗菌肽表达载体的构建与鉴定
将含抗菌肽基因的载体和表达载体均用xhoi和xbai双酶切，酶切产物回收并连接，进行pcr测序鉴定；
（3）重组阳性质粒转化酵母菌株与筛选
阳性质粒经saci单酶切线性化后加入毕赤酵母感受态细胞悬液中，电转化后均匀涂布于含100μg/mlzeocin的ypds选择平板上，30℃培养5天，待ypds平板上的阳性转化子生长较大，将各转化子依次点种至含zeocin200μg/ml，500μg/ml，1000μg/ml的ypds选择平板，以在高浓度zeocin平板上正常生长的菌落为可能高拷贝重组菌株；
提取可能的高拷贝重组酵母基因组dna，以p1、p2为引物进行pcr反应，pcr产物用1%琼脂糖凝胶电泳观察，扩增的条带重组子进行阳性转化子鉴定；
（4）阳性克隆的诱导表达
将筛选到的阳性重组菌单菌落接种于含100μg/mlzeocin的ypd培养液中，28℃振摇培养24个小时，取此菌液按4%体积比转接于10mlbmgy培养基中，30℃摇振培养18h左右，od600值为6，培养物直接转接于40mlbmmy培养基中，30℃继续摇振培养，为了维持诱导表达，每隔20h补加100%甲醇使终浓度达1.5%，45h后，在4℃条件下，6000r/min离心10min，收集上清，进行抑菌活性测定。
水母抗菌肽具体制备工艺如下：将筛选得到的阳性重组子活化后按5%接种量接种于三角瓶30℃，180r/min摇床培养20h后以5%接种量接入发酵罐，在30℃，200r/min，ph值6，通气量0.6vvm（1l发酵液1min通入的氧气量），溶氧>20%情况下进行发酵，在培养20h后，流加50%甘油，待溶氧突然升至100%时流加甲醇至发酵结束，整个发酵持续60h；发酵结束后原罐蒸汽100℃灭菌10min，放料，5000r/min离心15min，收集发酵上清即为抗菌肽半成品；
上述抗菌肽半成品喷雾干燥或冻干生产的粉剂和以生化方法精制、纯化后得到液体制剂，即为抗菌肽产品，可作为化妆品防腐剂。
抗菌肽在试剂盒中的防腐性能试验
实验方案：分离鉴定试剂盒中常见菌，并分别进行复壮；在试剂盒中加入一定的菌量，添加实施例的抗菌肽制品，测定试剂盒的性能。同时添加化学防腐剂和不添加防腐剂作对比，测定本发明抗菌肽抗菌防腐性能。本发明抗菌肽作为防腐剂在试剂盒中的添加量为千分之一，化学防腐剂的在试剂盒中添加量为千分之五。
表1各实施例与对比例的试验统计结果
从表1可以明显看出，各实施例中抗污染天数明显多于化学防腐剂组和无防腐剂组，说明本发明的水母抗菌肽具有显著抗菌防腐性能，能显著延长试剂盒保质期限。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。