一种黄烷醇类化合物及其制备方法和应用与流程

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种黄烷醇类化合物及其制备方法和应用。

背景技术：

黑面神为大戟科（euphorbiaceae）黑面神属植物黑面神（breyniafruticosa(linn.)hook.f.），主产于我国南方沿海省份，其叶具清热祛湿，活血解毒的功效，主要用于治疗皮炎，湿疹，漆疮，阴痒等皮肤病及腹痛吐泻，风湿痹痛，缠腰火丹、产后乳汁不通；其根具有散瘀，消肿，祛风，解毒的功效，主要用于治疗咽喉肿痛，热泻，乳蛾，杨梅疮，崩漏，鹤膝风，产后腹痛^[3]。此外，民间亦用黑面神治疗慢性支气管炎，为中国南部傣族习用药。现代药理实验已证实黑面神具有抗炎止痒、抑菌、免疫抑制、抗ⅰ型超敏反应及抗病毒作用。

经统计，国内外文献报道的黑面神中的化学成分共115个，包括三萜类、甾体类、倍半萜类、含硫螺缩酮苷类、黄酮类、木脂素类、有机酸酯、酚及小分子羧酸类化合物、脑苷及其他类别化合物。而近年国内外研究比较多的植物来源的酪氨酸酶抑制剂主要为黄酮类化合物、木脂素类等酚性成分，此外还有甾体、萜类成分的研究。

目前，黑面神多外用，用于治疗各种皮肤病。此外，有文献报道黑面神提取物正丁醇部分在浓度为0.8mg/ml时，对酪氨酸酶有50%的抑制率，且亦有报道黑面神制剂具有美白作用。酪氨酸酶（tyrosinase,tyr）是体内黑色素合成的关键酶，其表达和活性决定着黑色素生成的速度和产量，所以抑制酪氨酸酶的活性，黑色素合成量就可能得到有效控制。

黑面神这味具有民族特色的传统中药在治疗皮肤病的应用中疗效确切，目前关于其化学成分的研究报道较少，故而选其作为研究药对象，先分离出单体成分，然后通过蘑菇酪氨酸酶抑制试验进行活性筛选，以期发现具有抑制黑色素生成的天然药物，从而为治疗相关疾病的先导化合物的研究奠定基础。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明的首要目的在于提供一种新的黄烷醇类化合物。

本发明的另一目的在于提供上述黄烷醇类化合物的制备方法。

本发明是通过以下技术方案实现：

本发明提供的一种黄烷醇类化合物，具有如下通式：

其中，r代表异丙基或异丁基。

根据本发明的目的，本发明通过对黑面神化学成分的研究，从黑面神中分离出来了如上通式结构所示的黄烷醇类化合物，经分析鉴定，该类化合物是新的黄烷醇类化合物，该类化合物对酪氨酸酶单酚酶活性及二酚酶活性均具有较强的抑制作用。该新的化合物的具体结构如bf-1和bf-2所示：

本发明还提供了上述黄烷醇类化合物的制备方法，包括如下步骤：

a、将黑面神全株，粉碎，用乙醇回流提取，提取液减压浓缩，得浸膏；

b、将浸膏依次用超纯水、30%乙醇、60%乙醇、95%乙醇萃取，分别离心后的上清液依

次湿法上样于填有d101大孔树脂的色谱柱，再分别用超纯水、30%乙醇、60%乙醇、95%乙醇洗脱样品，得到各浓度乙醇洗脱部位；

c、取60%乙醇洗脱部位，浓缩后制成冻干粉，将冻干粉溶解于甲醇中，然后用60~100

目的正相硅胶拌样，烘干后上样于填有200~300目的正相硅胶的色谱柱中，依次用100:0、99:1、98:2、97:3、95:5、9:1、85:15及75:25的二氯甲烷-甲醇洗脱液系统梯度洗脱，得到的各部位洗脱液通过tlc薄层色谱监测后合并，然后经ods开放柱层析、tlc薄层色谱、sephadexlh-20柱色谱以及制备型高效液相纯化得到黄烷醇类化合物。

优选的，步骤a具体为：将黑面神全株，粉碎，用6-10倍量70%乙醇回流提取3次，温度控制在80-90℃，每次提取2-3小时，合并3次提取液，减压浓缩，得浸膏。

本发明所述的黑面神（breyniafruticosa(linn.)hook.f.），又名田中逵、鬼画符、庙公仔、猴写字、四眼叶、锅盖仔、钟馗草、青凡木等，为大戟科（euphorbiaceae）黑面神属植物。

本发明还提供了上述黄烷醇类化合物在制备酪氨酸酶抑制剂药物中的应用。

本发明还提供了一种酪氨酸酶抑制剂药物组合物，包含上述黄烷醇类化合物和药学上可接受的载体。其是以黄烷醇类化合物为主要活性成分，加入药学可接受的载体，通过本领域公知的常用的生产方法制成药学可接受的剂型。

所述的药学可接受载体包括微晶纤维素、羟丙甲基纤维素、明胶、淀粉、糊精、硬脂酸镁、乳糖、葡萄糖、滑石粉、氯化钠、磷酸缓冲盐水、甘油、乙醇等；所述的剂型可以是软膏、片剂、胶囊、颗粒剂、散剂等。本发明药物的给药量可根据用药途径、患者的年龄、体重、所治疗的疾病的类型和严重程度等变化。

本发明进一步对如上通式所示的黄烷醇类化合物对酪氨酸酶的抑制机理作了研究，试验表明，新的黄烷醇类化合物bf-1、bf-2对酪氨酸酶的抑制率甚至超过作为阳性药的曲酸，且对酪氨酸酶单酚酶活性及二酚酶活性均具有较强的抑制作用，可用于制备酪氨酸酶抑制剂药物，为色素积聚引起的疾病的药物治疗研究奠定基础。

附图说明：

图1为化合物bf-1和bf-2对酪氨酸酶单酚酶活性的影响的柱形图；

图2为化合物bf-1和bf-2对酪氨酸酶二酚酶活性的影响的柱形图；

图3为化合物bf-1对酪氨酸酶的抑制曲线图；

图4为化合物bf-2对酪氨酸酶的抑制曲线图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明，以下实施例为本发明具体的实施方式，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

实施例1

取黑面神全株50kg，粉碎，用8倍量70%乙醇回流提取3次，温度控制在80-90℃，每次提取2-3个小时，合并3次提取液，减压浓缩，得浸膏12.6kg；

取10kg浸膏依次用超纯水、30%乙醇、60%乙醇、95%乙醇萃取，分别离心后的上清液依次湿法上样于填有d101大孔树脂的色谱柱，分别用超纯水、30%乙醇、60%乙醇、95%乙醇洗脱样品，得各浓度乙醇洗脱部位；

取60%乙醇洗脱部位，浓缩后制成冻干粉，最后得600g冻干粉，再取其中500g冻干粉溶解于甲醇中，然后用1kg的60~100目的正相硅胶拌样，烘干后上样于填有200~300目的正相硅胶的色谱柱中，依次用100:0、99:1、98:2、97:3、95:5、9:1、85:15及75:25的二氯甲烷-甲醇洗脱液系统梯度洗脱，得到的各部位洗脱液通过tlc薄层色谱监测后合并，然后经ods开放柱层析、tlc薄层色谱、sephadexlh-20柱色谱以及制备型高效液相纯化得到化合物bf-1（29.4mg）和bf-2（39mg）。

化合物的结构鉴定：

绿色无定型粉末，[α]21d−55.8(c0.33,ch3oh)，hr-esi-msm/z:579.2085[m+h]⁺(calcd.forc28h35o13,579.2072)，推断分子式为c28h34o13。不饱和度ω=12。bf-1通过糖水解，衍生化后用hplc分析并与糖标准品的衍生物对照，证明其糖单元为d-葡萄糖。

ir谱显示羟基吸收（3424cm^-1），羰基吸收（1724cm^-1）以及芳环吸收（1623，1591，1496，1447cm^-1）。

¹hnmr谱中显示有2个呈双峰的甲基信号δh1.12（3h,d,j=7hz），δh1.15（3h,d,j=7hz）和1个单峰甲基信号δh1.88（3h,s）。甲氧基氢质子δh3.73（3h,s）提示化合物母核上连有甲氧基。此外，¹hnmr谱中低场δh6.93（1h,s），6.76（2h）提示苯环上连着三个氢质子，分别为h-2'、h-5'、h-6'的氢质子信号，它们共同形成abx体系。δh6.34（1h,d,j=2hz），δh6.22（1h,d,j=2hz）表示苯环上间位偶合的两个氢，提示其为5,7-二取代。一个葡萄糖的端基氢质子信号（δh4.86,δc102.5），其偶合常数为7，提示d-葡萄糖为β-构型。故化合物母核上连有1个β-d-葡萄糖基。

¹³cnmr谱中共显示出28个碳信号，结合dept谱提示有4个甲基、2个亚甲基、13个次甲基及9个季碳。其中1个信号可能是一组葡萄糖碳信号包括（δc102.5、74.9、78.1、71.9、75.7、64.9）；低场区δc172.2、178.8为羰基信号；高场区δc19.5（2个）和δc21.0为3个甲基信号；δc56.0为甲氧基信号。将剩下碳信号与黄烷醇类化合物比对，提示可能是黄烷醇类化合物的衍生物。

hmbc谱显示，葡萄糖氢质子glc-h2-6（δh4.21，4.25）及两个甲基氢质子h-3'''（δh1.12），h-4'''（δh1.15）均与c-1'''（δc178.8）有远程相关，此外，黄烷醇母核上质子h-3（δh5.38）及甲基质子h-2''（δh1.88）均与c-1''（δc172.2）有远程相关，提示葡萄糖c-6位及黄烷醇母核c-3位上连接的羟基均被酯化，且与c-1'''相连的碳上连着两个甲基，而c-1''连有另一个甲基。葡萄糖氢质子glc-h2-1（δh4.86）与c-5（δc158.1）有远程相关，提示葡萄糖连接在c-5位上。甲氧基上氢质子（δh3.73）与c-7（δc161.0）有远程相关，提示甲氧基连接在c-7位上。

根据¹hnmr、¹³cnmr、dept、¹h-¹hcosy、hmbc和hsqc谱的信息，对bf-1的碳氢信号进行全归属。

将bf-1水解后的母核与标准品(-)-表儿茶素的cd谱信号比对，二者信号吻合，可确定bf-1母核的绝对构型为2r，3r。

综合以上解析，确定了bf-1化合物的结构为(2r,3r)-3-acetyl-7-methoxyl-(-)-epicatechin5-o-(6-isobutanoyloxyl)-β-d-glucopyranoside，中文名为：(2r,3r)-3-乙酰基-7-甲氧基-(-)-表儿茶素5-o-(6-异丁酰基)-β-d-葡萄糖苷，经过scifinder检索发现该化合物为未见文献报道的新化合物。

bf-2化合物的结构鉴定：

绿色无定型粉末，[α]22d−53.3(c0.46,ch3oh)，hr-esi-msm/z:593.2252[m+h]⁺（calcd.forc29h37o13，593.2229），推断分子式为c29h36o13。不饱和度ω=12。bf-2通过糖水解，衍生化后用hplc分析并与糖标准品的衍生物对照，证明其糖单元为d-葡萄糖。

ir谱显示羟基吸收（3422cm^-1），羰基吸收（1722cm^-1）以及芳环吸收（1623，1597，1501，1441cm^-1）。

¹hnmr谱中显示有1个呈三重峰的甲基信号δh0.85（3h,t,j=7.5hz），1个呈双峰的甲基信号δh1.13（3h,d,j=5.5hz）和1个单峰甲基信号δh1.88（3h,s）。甲氧基氢质子δh3.74（3h,s）提示化合物母核上连有甲氧基。此外，¹hnmr谱中低场δh6.93（1h,s），6.76（2h）提示苯环上连着三个氢质子，分别为h-2'、h-5'、h-6'的氢质子信号，它们共同形成abx体系。δh6.35（1h,d,j=2hz），δh6.22（1h,d,j=2hz）表示苯环上间位偶合的两个氢，提示其为5,7-二取代。一个葡萄糖的端基氢质子信号（δh4.86,δc102.6），其偶合常数为7，提示d-葡萄糖为β-构型。故化合物母核上连有1个β-d-葡萄糖基。

¹³cnmr谱中共显示出29个碳信号，结合dept谱提示有4个甲基、3个亚甲基、13个次甲基及9个季碳。其中1个信号可能是一组葡萄糖碳信号包括（δc102.6、74.9、78.1、71.9、75.7、64.8）；低场区δc172.2、178.4为羰基信号；高场区δc12.0、17.0、21.0为甲基信号，δc56.0为甲氧基信号。将剩下碳信号与黄烷醇类化合物比对，提示可能是黄烷醇类化合物的衍生物。将bf-2与化合物bf-1相比，他们的化学位移值相似，主要区别在于bf-2多了一个亚甲基，结合碳谱信号（δc178.4、42.4、27.9、12.0、17.0）及其各自相连的氢质子信号推测出2-甲基丁酸酯基团的存在。

hmbc谱显示，葡萄糖氢质子glc-h2-6（δh4.19，4.47与c-1'''（δc178.8）有远程相关，故2-甲基丁酸酯基团连接在glc-c-6位上。bf-2其余核磁数据均与bf-1一致。根据¹hnmr、¹³cnmr、dept、¹h-¹hcosy、hmbc和hsqc谱的信息，对bf-2的碳氢信号进行全归属。

将bf-2水解后的母核与标准品(-)-表儿茶素的cd谱信号比对，二者信号吻合，可确定bf-2母核的绝对构型亦为2r，3r。

综合以上解析，确定了化合物的结构为(2r,3r)-3-acetyl-7-methoxyl-(-)-epicatechin5-o-[6-(2-methylbutanoyloxyl)]-β-d-glucopyranoside，中文名为：(2r,3r)-3-乙酰基-7-甲氧基-(-)-表儿茶素5-o-[(6-(2-甲基异丁酰基)]-β-d-葡萄糖苷，经过scifinder检索发现该化合物为未见文献报道的新化合物。

实施例2：黄烷醇类化合物bf-1和bf-2对酪氨酸酶的抑制机理研究

试剂配制

（1）1mol/l氢氧化钾溶液配制：将5.6g的氢氧化钾溶于dd水中，然后定容至100ml。

（2）ph6.8的磷酸盐缓冲溶液配制：将3.4g的磷酸二氢钾溶于500mldd水中，用（1）中1mol/l氢氧化钾溶液调ph至6.8。

（3）0.5mmol/l单酚底物配制：将9.10mg的l-酪氨酸溶于ph6.8的磷酸盐缓冲溶液中，然后定容至100ml，4℃保存，待用。

（4）2mmol/l二酚底物配制：将39.44mg的l-dopa溶于ph6.8的磷酸盐缓冲溶液中，然后定容至100ml，4℃保存，待用。

（5）酪氨酸酶的配制：将9.31mg(25ku)的蘑菇酪氨酸酶溶于9.31ml的磷酸盐缓冲溶液中，再用磷酸盐缓冲溶液稀释2倍，得到1342.65u/ml的酶溶液（酶在体系中终浓度为191.8u/ml），稀释4倍后，酶在体系中终浓度为95.9u/ml。

（6）化合物bf-1、bf-2溶液配制：精确称取足量的单体，分别用含10%dmso的磷酸盐缓冲溶液溶解配成不同浓度（0.15、0.3、0.6、1.2、2mmol/l）溶液。

化合物bf-1、bf-2对酪氨酸酶活性抑制试验

化合物bf-1、bf-2的酪氨酸酶单酚酶活力测定是以0.5mmol/l的l-酪氨酸为底物，而二酚酶活力的测定则以1mmol/l的l-dopa为底物。测定单酚酶和二酚酶的活力，选配好的蘑菇酪氨酸酶母液，稀释4倍，酶在体系中终浓度为95.9u/ml。而各单体样品在体系终浓度为2mmol/l。按表1准确吸取1、2、3、4组反应液，每组反应体系为210μl，即在96孔板中，每孔有210μl的反应体系，每组设置3个复孔，充分混匀后再在37℃的摇床中孵育30min,迅速在490nm处测其吸光值，并按表1公式求抑制率（%ir）。

表1反应溶液系统

其中，a1、a2、a3、a4分别为第1组、第2组、第3组及第4组体系反应30min后测得的吸光度。

酪氨酸酶活力单位（u/min）规定：以每分钟反应液在490nm波长的光密度值增加0.001为一个酶活力单位。

以曲酸对酪氨酸酶的抑制率作为阳性对照，研究化合物bf-1、bf-2对酪氨酸活性的抑制率，结果见图1、2。图1、2表明化合物bf-1、bf-2对酪氨酸酶单酚酶活性及二酚酶活性均有较强的抑制作用，且化合物bf-1、bf-2对酪氨酸酶的抑制率甚至超过作为阳性药的曲酸，具有统计学意义。

化合物bf-1、bf-2对酪氨酸酶的ic50的测定

将不同浓度（0.15、0.3、0.6、1.2、2mmol/l）的化合物bf-1、bf-2溶液，分别以0.5mmol/l的l-酪氨酸和1mmol/l的l-dopa为底物，且酶在体系中终浓度为95.9u/ml，按上述2.方法分别测这各个浓度bf-1、bf-2对酪氨酸酶单酚酶和二酚酶活力的抑制率（%ir），求ic50值。

化合物bf-1和bf-2对酪氨酸酶的抑制曲线分别见图3和4。化合物bf-1和bf-2对酪氨酸酶的抑制率随着浓度的增大而增大。

由图3可知化合物bf-1浓度在0.6mmol/l以下时，样品对酪氨酸酶的抑制率随着样品浓度的增加而显著增加；但当浓度在0.6mmol/l以上时，抑制率的增加幅度趋缓。化合物bf-1对酪氨酸酶的单酚酶活性及二酚酶活性的抑制达到50%时所对应的抑制剂浓度分别为0.89mmol/l和0.77mmol/l。

由图4可知化合物bf-2浓度在0.3mmol/l以下时，样品对酪氨酸酶的抑制率随着样品浓度的增加幅度较缓；但当浓度在0.3-0.6mmol/l时，抑制率的增加幅度较大，而当浓度在0.6mmol/l以上时，抑制率的增加幅度又趋缓。化合物bf-2对酪氨酸酶的单酚酶活性及二酚酶活性的抑制达到50%时所对应的抑制剂浓度分别为0.82mmol/l和0.75mmol/l。

酶动力学研究

4.1米氏方程

对于简单的酶促反应，底物浓度与酶反应初速度间的定量关系可以用数学表达式(3-2)表示，即米氏方程来表示:

式中，ν0表示酶促反应初速度；vm表示酶的最大反应初速度；［s］表示底物浓度；km表示米氏常数。

通常用lineweaver-burk双倒数方程可以求出米氏方程中的km和vm值，即:

也就是说，在不同的底物浓度测定酶促反应的初速度，并以1/[s」为横坐标、1/ν0为纵坐标作图，可以获得一条直线，直线在横坐标轴上的截距为l/km的绝对值，在纵坐标上的截距即为1/vm。

4.2化合物bf-2对酪氨酸酶二酚催化活性抑制的类型

配好0.2、0.6、0.8、1、2mmol/l这四种浓度的底物l-dopa，用体系终浓度为95.9u/ml的酪氨酸酶来催化其反应，分别研究0、0.3、0.6mmol/l三种浓度的抑制剂bf-2对以上反应的影响，并通过lineweaver-burk双倒数方程获得km和vm，确定其抑制类型，解离常数可通过km/vm或1/vm与抑制剂浓度进行二次作图得到。

在不同浓度化合物bf-2下，酪氨酸酶催化l-dopa氧化成多巴醌的线性拟合方程如表2所示。由表2可以看出，bf-2浓度对km和vm的影响规律表明，随着bf-2浓度增大，米氏常数km值增大而最大反应初速度vm值随之下降，双倒数曲线交于第二象限，其抑制机理表现为混合型抑制，求得动力学参数列于表3中。再以直线的斜率km/vm和截距1/vm分别对bf-2浓度进行二次作图，由横轴截距可分别求出复合物［ei］和［esi］的解离常数ki，kis，计算结果分别为0.657mmol/l和4.896mmol/l(表3)。由解离常数的定义可知，解离常数越小，复合物越不容易解离，结构就越稳定，由ki<kis可知，[esi]的稳定性较［ei］差，因此，在此体系中的bf-2分子更容易与游离酶结合形成［ei］复合物，从而影响了酶对底物的催化。

表2化合物bf-2对酪氨酸酶催化二酚底物抑制作用的lineweaver-burk方程

表3化合物bf-2对酪氨酸酶催化二酚底物抑制作用的动力学参数

讨论与总结

由上述研究结果表明，化合物bf-1和bf-2对酪氨酸酶单酚酶活性及二酚酶活性均有较强的抑制作用，化合物bf-1和bf-2对酪氨酸酶的抑制率甚至超过作为阳性药的曲酸，具有统计学意义，而这两个新的黄烷醇类化合物bf-1、bf-2的特征性官能团是两个酯羰基，结合badria等的研究成果分析，具有酯羰基的黄烷醇类化合物显示较强的活性与两种底物l-酪氨酸及l-dopa同样具有酯羰基有关，它们的结构更相似。

此外，黄烷醇类化合物bf-2对酪氨酸酶的抑制类型属于混合型抑制。