一种硫酸软骨素的制备方法及其在血管保护中的应用与流程

本发明涉及药品开发领域，更具体涉及一种硫酸软骨素的制备方法及其在血管保护中的应用。

背景技术：

20世纪30年代，carbdal发表了硫酸软骨素对于偏头疼的疗效，自此之后硫酸软骨素的临床应用范围不断被开发，硫酸软骨素在骨关节炎治疗、干眼病和眼科炎症治疗、抗动脉粥样硬化症、抗心脑血管疾病、提高免疫功能等方面具有重要的临床应用价值。

硫酸软骨素在治疗心脑血管疾病方面的研究应用主要集中在抗凝血和血栓、调节血脂和降脂、抗动脉粥样硬化方面。一定量的硫酸软骨素能降低小鼠在高脂肪饮食中对脂肪含量吸收，主要利用硫酸软骨素抑制胰脂肪酶的活性和降低棕榈酸进入空肠绒毛膜囊内，从而引起体重的减轻和脂肪组织重量的减少，到达预防高血脂和脂肪肝。岩藻糖基化硫酸软骨素在血管平滑肌细胞的增生有强烈抑制作用，其能增强纤维母细胞生长因子诱导的血管内皮细胞增生诱导组织因子路径抑制剂释放，产生抗血栓活性。在小鼠氯化亚铁诱导动脉受伤模型中，发现硫酸软骨素有抗血栓形成活性。硫酸软骨素是结缔组织中的重要组成部分，可有效去除或减少脂质物质在静脉及动脉壁上沉积，因其能与脂蛋白分子相互作用,发生空间排斥并与离子结合，可以显著降低血栓中胆固醇的含量，进而减少动脉粥样硬化的发生。

传统的硫酸软骨素生产工艺采用碱提醇沉法，存在生产周期长，产品质量不稳定，环境污染严重等缺点，严重制约着硫酸软骨素产业的可持续发展。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种硫酸软骨素的制备方法及其在血管保护中的应用。本发明采用软骨为原料，通过蛋白酶水解-膜分离法组合技术制备，制得的硫酸软骨素的有效成分含量大于85wt%，分子量大于50kda占比90%以上。本发明与传统碱提取醇沉工艺相比，工艺简单，分子量保持完整，生物活性不受破坏；且避免了有机溶剂的使用和水煮浓缩的能耗，成本大幅降低，具有较大推广性。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种硫酸软骨素的制备方法，采用软骨原料，经骨肉分离、清洗和粉碎预处理，得到软骨粉；进一步通过蛋白酶酶解提取工序、膜分离除杂浓缩工序和喷雾干燥工序，制成硫酸软骨素；具体包括以下步骤：

（1）原料预处理：取软骨原料，去除碎肉，再经清洗和粉碎预处理，得到软骨粉，备用；

（2）调节ph：往步骤（1）得到的软骨粉中加入水，软骨粉与加入的水的质量体积比为1:(2-100)，用酸溶液调节ph值至2-6.5；

（3）二步蛋白酶酶解：第一步酶解采用酸性蛋白酶，往步骤（2）得到的混合液中加入酸性蛋白酶，酶的添加量为0.001-0.5wt.%，调节ph值2-6.5，反应温度为10-80℃，酶解时间1-24小时；第二步酶解采用中性或碱性蛋白酶，酶的添加量为0.001-0.5wt.%，调节ph值至5.5-10，反应温度为10-80℃，酶解时间1-12小时；

（4）除杂浓缩、干燥：将步骤（3）所得酶解产物固液分离后收集上清液，采用超滤膜进行脱除小分子杂质和浓缩处理，膜浓缩液经喷雾干燥，制成硫酸软骨素。

步骤（2）中所述的酸溶液为盐酸溶液、磷酸溶液、硫酸溶液、乙酸溶液、乳酸溶液、柠檬酸溶液的一种或几种混合。

制得的硫酸软骨素中有效成分含量大于85wt%，硫酸软骨素分子量大于50kda占比90%以上。

该硫酸软骨素产品能有效抑制同型半胱氨酸诱导的血管内皮细胞损伤，使细胞抗氧化活性得到恢复，减少细胞的死亡，有利于预防和修复血管损伤，且有利于机体免疫功能的恢复，更好地促进患者康复。该硫酸软骨素可用于保护血管的特殊医学用途食品、功能性食品和药品的制备，扩展了硫酸软骨素的应用范围。

本发明的有益效果在于：

（1）本发明制得的硫酸软骨素分子量大于50kda占比90%以上，能有效抑制同型半胱氨酸诱导的血管内皮细胞损伤，使细胞抗氧化活性得到恢复，减少细胞的死亡，有利于预防和修复血管损伤，且有利于机体免疫功能的恢复，更好地促进患者康复；

（2）本发明制得的硫酸软骨素可用于保护血管的特殊医学用途食品、功能性食品和药品的制备，扩展了硫酸软骨素的应用范围。

附图说明

图1为硫酸软骨素制备工艺流程图；

图2为硫酸软骨素hplc谱图；

图3为不同浓度硫酸软骨素对同型半胱氨酸（hcy）诱导人血管内皮细胞haec损伤修复（*p<0.05，**p<0.01，与模型组比较）；

图4为硫酸软骨素对同型半胱氨酸（hcy）诱导人血管内皮细胞haec抗氧化活性的影响（*p<0.05，**p<0.01，与模型组比较）；

图5为硫酸软骨素对同型半胱氨酸（hcy）诱导人血管内皮细胞周期的影响。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不仅仅限于这些实施例。

实施例1

取软骨100公斤，经骨肉分离、清洗，用绞肉机进行绞碎，加入500l水，用10wt.%的醋酸溶液调节ph，使最终ph达到3.5。采用二步酶解工艺：第一步酶解采用酸性蛋白酶，酶的添加量为0.5wt.%，调节ph值至3.5，反应温度为40℃，酶解时间6小时；第二步酶解采用中性蛋白酶，酶的添加量为0.3wt.%，调节ph值至7.0，反应温度为40℃，酶解时间8小时。酶解产物经高速连续离心机离心分离，收集上清液，采用膜分离装置（60kda膜）处理上述物料，ro水水洗800l，硫酸软骨素溶液最终浓缩至50l用于喷雾干燥。收集的硫酸软骨素粉进行hplc分析，硫酸软骨素分子量分布采用sec-hplc法检测，蛋白质分子量大于50kda占比达95.6%（表1）；硫酸软骨素含量参照国家标准gb/t20365-2006检测，含量92.93g/100g（图2）。

表1硫酸软骨素产品分子量分布数据

实施例2

37℃、5%co2条件下常规培养人血管内皮细胞haec。人血管内皮细胞接种于96孔板中，细胞浓度为15000个/孔，模型组和药物组分别加入同型半胱氨酸（hcy）诱导人血管内皮细胞haec损伤（终浓度0.5mg/ml），药物组的硫酸软骨素浓度分别为0.025、0.05、0.1mg/ml，培养24h后采用mtt法检测细胞的增值情况，结果如图3所示，同型半胱氨酸（hcy）诱导haec细胞损伤，硫酸软骨素组细胞存活率提高，随着硫酸软骨素浓度的增加，对haec细胞的保护作用增强，呈现剂量依赖性。实验结果提示，硫酸软骨素可用于血管内皮细胞损伤的修复。

37℃、5%co2条件下常规培养人血管内皮细胞haec。人血管内皮细胞接种于24孔板中，细胞浓度为15000个/孔，模型组和药物组分别加入同型半胱氨酸（hcy）诱导人血管内皮细胞haec损伤（终浓度0.5mg/ml），药物组的硫酸软骨素浓度分别为0.025、0.05、0.1mg/ml，培养24h后采用试剂盒检测细胞的mda含量、sod活力和ldh活力。结果如图4所示，同型半胱氨酸（hcy）诱导haec细胞损伤模型组与空白组相比，mda水平升高，sod活性下降，ldh活性升高，差异具有极显著性（p<0.01），同型半胱氨酸（hcy）诱导haec细胞损伤引起了细胞抗氧化活性的显著下降。当加入不同浓度的硫酸软骨素作用于同型半胱氨酸（hcy）诱导的haec细胞，mda水平下降，sod活性升高，ldh活性下降；硫酸软骨素作用的细胞抗氧化活性得到恢复，并呈剂量依赖性。实验结果表明，硫酸软骨素具有抑制同型半胱氨酸（hcy）所致血管内皮细胞自由基氧化损伤，预防和修复血管损伤的作用。

37℃、5%co2条件下常规培养人血管内皮细胞haec。人血管内皮细胞接种于6孔板中，细胞浓度为15000个/孔，模型组和药物组分别加入同型半胱氨酸（hcy）诱导人血管内皮细胞haec损伤（终浓度0.5mg/ml），药物组的硫酸软骨素浓度分别为0.05、0.1mg/ml，培养24h后采用v-egfp/pi试剂盒检测细胞的周期分布。结果如图5所示，同型半胱氨酸（hcy）诱导haec细胞损伤，引起细胞凋亡或死亡，硫酸软骨素对同型半胱氨酸（hcy）诱导血管内皮细胞损伤起保护作用。随药物浓度的增加，抗凋亡作用显著增强。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。