一种用于同时检测NDV、IBV和H9N2亚型AIV的多重RPA引物和探针及其检测方法与流程

本发明属于分子生物学检测领域，具体涉及一种用于同时检测新城疫病毒(newcastlediseasevirus，ndv)、传染性支气管炎病毒(infectiousbronchitisvirus，ibv)和h9n2亚型禽流感病毒(avianinfluenzavirus，aiv)的多重rpa引物和探针及检测方法。

背景技术：

随着我国养禽业的快速发展，禽类疫病的流行也发生了新的变化，多种疫病同时感染一种家禽的混合感染越来越普遍，给疫病的诊断和防控带来很大困难。对复杂的疫病进行快速的现场诊断，能够为疫病的有效防控争取宝贵时间，最大限度地减少损失和疫病扩散的风险。

常规的聚合酶链反应(polymerasechainreaction，pcr)技术以其能够检测痕量的病原dna而一直被作为诊断多种疫病的金标方法。但pcr需要特殊的热循环设备、低温保存的试剂和避免交叉污染的技术操作要求，从而限制了pcr在现场诊断中的应用。重组酶聚合酶扩增(recombinasepolymeraseamplification，rpa)技术是由英国公司twistdxinc开发的一种可以替代传统pcr的新型核酸检测技术。rpa技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶(recombinase)、单链结合蛋白(ssb)和链置换dna聚合酶(polymerase)。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在37℃-42℃左右。重组酶与引物结合形成的蛋白-dna复合物，能在双链dna中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动dna合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的dna链与ssb结合，防止进一步替换。在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件。整个过程进行得非常快，一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。该技术对硬件设备的要求很低，特别适合用于现场诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域。rpa技术具有不同于常规pcr的诸多优点：1)rpa反应在常温下即可进行；2)rpa检测的灵敏度很高；3)既可用于dna，也可用于rna的扩增；4)可以进行多重扩增。

免疫胶体金技术(immunecolloidalgoldtechnique)是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术，英文缩写为：gict。胶体金是由氯金酸(haucl4)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如spa、pha、cona等。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。胶体金免疫层析法是将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金标记试剂(抗体或单克隆抗体)吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，再移动至固定有特定抗原或抗体的区域时，待检物和金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。该法现已发展成为诊断试纸条，使用十分方便。

新城疫病毒(ndv)、传染性支气管炎病毒(ibv)和h9n2亚型禽流感病毒(h9n2亚型aiv)常常以混合感染的形式造成鸡的呼吸系统疾病，临床诊断难以鉴别，实验室进行病毒分离鉴定需要耗费相当长的时间，无法给临床控制这些疫病提供及时的指导，因此，迫切需要寻找一种ndv、ibv和aivh9n2亚型现场快速检测诊断技术。

技术实现要素：

本发明针对现有技术中存在的问题，提供一种用于同时检测新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和h9n2亚型禽流感病毒的多重rpa引物和探针及检测方法。本发明的多重rpa引物和探针特异性强，灵敏度高，结合胶体金免疫层析试纸条检测技术，能够实现同时检测ndv、ndv、ibv和h9n2亚型aiv三种病毒，为有效检测和鉴别常见禽呼吸道疾病的混合感染提供一种成本低、快速、特异，不需要特殊设备的现场诊断新方法，有利于禽呼吸系统疫病的鉴别诊断。

本发明采用的技术方案如下：

本发明首先提供了一种用于同时检测新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和h9n2亚型禽流感病毒的多重rpa引物和探针，所述多重rpa引物和探针是由用于检测新城疫病毒的引物和探针、用于检测传染性支气管炎病毒的引物和探针、用于检测h9n2亚型禽流感病毒的引物和探针组成，其中，

所述用于检测新城疫病毒的引物和探针的核苷酸序列为：

上游引物p1：5’-gcagagatcactcacactcacatcagtatttagcac-3’(seqidno.1)，

下游引物p2：5’-gcagagatcactcacactcacatcagtatttagcac-3’(seqidno.2)，

探针probe1：

5’-488-cggacatctgcaacagggagggtattctttt-thf-tactctgcgttccatc-spacerc3-3’(seqidno.3)；

所述用于检测传染性支气管炎病毒的引物和探针的核苷酸序列为：

上游引物p3：

5’-cttaacaaaacggacttaaatacctacagctggtcc-3’(seqidno.4)，

下游引物p4：

5’-ctaggtagcccaagcaacggatgtataaagtgagacac-3’(seqidno.5)，

探针probe2：

5’-fluorescein

amidite-cataggtgttccattgcagtgcactttagtgccctg-thf-atggcacctggccacctgtcagg-spacerc3-3’(seqidno.6)；

所述用于检测h9n2亚型禽流感病毒的引物和探针的核苷酸序列为：

上游引物p5：

5’-cacgctcaccgtgcccagtgagcgaggactgcagcgtag-3’(seqidno.7)，

下游引物p6：

5’-catgcctgattagtgggttggtggtagtcgccatctg-3’(seqidno.8)，

探针probe3：

5’-digoxigenin-gttgcactcagttactcaactggtgcgcttgccagttg-thf-atgggtctcatatacaaccg-spacerc3-3’(seqidno.9)。

根据上述的多重rpa引物和探针，所述用于检测新城疫病毒的下游引物p2、用于检测传染性支气管炎病毒的下游引物p4和用于检测h9n2亚型禽流感病毒的下游引物p6的5’端均用biotin进行标记。

一种含有上述多重rpa引物和探针的试剂盒，该试剂盒能够用于检测新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和h9n2亚型禽流感病毒。

本发明还提供了一种多重rpa同时检测新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和h9n2亚型禽流感病毒的方法，包括以下步骤：

(1)引物合成：合成上述的用于同时检测新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和h9n2亚型禽流感病毒的多重rpa引物和探针；

(2)rna模板提取：分别提取新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和h9n2亚型禽流感病毒的rna；

(3)反转录：分别以提取的新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和h9n2亚型禽流感病毒的rna为模板，反转录成为cdna；所述反转录体系为20μl，其具体反应操作为：在反应体系中加入模板rna2μg，10mmdntps、oligodt引物(20μm)0.5μl、随机引物(20μm)0.5μl；70℃加热5min，迅速放置冰上2min；然后再向反应体系中加入10×buffer2μ、rnase抑制剂1μl、反转录酶(200unit/μl)0.5μl，混匀后置于42℃，60分钟，然后置80℃，5分钟。

(4)多重pcr扩增反应：以步骤(3)所得到的新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和h9n2亚型禽流感病毒的总cdna为模板，采用权利要求1或2所述的引物和探针，在rpa反应管中进行多重rpa扩增反应；

(5)分析多重rpa扩增产物。

根据上述的方法，优选地，采用英国twistdxinc公司的nfo试剂盒进行rpa扩增反应，所述多重rpa扩增反应体系以50μl计为：水化缓冲液29.5μl，醋酸镁(初始浓度为280mm)2.5μl，以及总体积为18μl的引物、探针和模板cdna混合物。所述18μl的引物、探针和模板cdna混合物具体为：上游引物p1和下游引物p2(初始浓度均为20μm)各0.7μl、探针1(初始浓度20μm)0.3μl、上游引物p3和下游引物p4(初始浓度均为20μm)各0.8μl、探针2(初始浓度20μm)0.4μl、上游引物p5和下游引物p6(初始浓度均为20μm)各0.5μl、探针3(初始浓度20μm)0.3μl、模板cdna2-6μl(检测单一一种病毒时加入2μl该病毒的模板cdna，同时检测2病毒时，2种病毒的模板cdna各加入2μl，同时检测3种病毒时，3种病毒的模板cdna各加入2μl)、用无核酸酶纯水补足体积为18μl。

根据上述的方法，所述rpa扩增反应的加样顺序和反应条件为：首先将多重rpa反应体系中除了醋酸镁之外的成分加入到twistnfo试剂盒提供的冻干酶复合物反应管中，然后将醋酸镁加入到冻干酶复合物反应管的盖子内表面，然后盖上盖子，瞬时离心，使醋酸镁进入反应体系中启动反应；将冻干酶复合物反应管放入t8反应器或恒温水浴锅或其他形式的恒温装置中，40℃恒温孵育40分钟(其中，在恒温孵育开始后的5-7分钟，取出冻干酶复合物反应管，颠倒震荡8-10次，瞬时离心，然后再放回t8反应器或恒温水浴锅或其他形式的恒温装置中继续孵育至40分钟)。

根据上述的方法，步骤(5)中分析多重rpa扩增产物的方法为：将多重rpa扩增产物稀释，然后用胶体金侧向流免疫层析试纸条对稀释后的多重rpa扩增产物进行检测。优选地，所述胶体金侧向流免疫层析试纸条中的有色颗粒是纳米金颗粒，所述纳米金颗粒采用链霉亲和素包被。所述胶体金侧向流免疫层析试纸条中的纤维膜为硝酸纤维素膜。

根据上述的方法，利用胶体金侧向流免疫层析试纸条分析多重rpa扩增产物的方法具体为：将5μl多重rpa扩增物加入盛有95μltris盐缓冲液(25mmtris、150mmnacl和0.05％tween-20)的试管中，进行稀释，将胶体金侧向流免疫层析试纸条的偶联垫末端垂直插入试管中，使偶联垫末端接触溶液。10分钟后，取出试纸条进行观察或用合适平板扫描仪进行扫描。

根据上述的方法，所述胶体金侧向流免疫层析试纸条上设有抗alexafluor^@488抗体检测线、抗荧光素酰胺抗体检测线、抗地高辛抗体检测线和生物素化抗体质控线。

此外，也可以用琼脂糖凝胶电泳来分析多重rpa扩增产物，在靶基因存在情况下，rpa反应产生两个产物，一个是由上、下游物产生的长片段，另一个是由标记的下游引物和标记的探针产生的双标记的较短片段。合适的引物和带有标准荧光素的探针均通过凝胶电泳的方式进行筛选，以确保能够检测到目的产物。

本发明的原理为：本发明分别设计扩增ndv、ibv和h9n2亚型aiv的特异性引物，通过三重rpa检测方法，能够同时检测ndv、ibv和h9n2亚型aiv三种病毒。利用不同的标记物对特异性扩增ndv、ibv和aivh9n2亚型片段的引物和探针进行标记，经过rpa扩增反应后，最终产生一端带有生物素，另一端带有alexafluor^@488、荧光素酰胺(fluoresceinamidite)或地高辛(digoxigenin)其中的任何一种的双标记产物，该双标记产物被包被有链霉亲和素的红色纳米金微球吸附，纳米金微球在液体的侧向流动力带动下移动到事先固定在试纸条上的抗alexafluor^@488抗体、抗荧光素酰胺抗体或抗地高辛抗体，以及生物素化的抗体所在位置，逐渐沉积形成肉眼可见的沉淀线，借此可以利用试纸条上不同位置出现的检测线而达到检测ndv、ibv和h9n2亚型aiv的目的。

本发明取得的积极有益效果：

(1)本发明设计的多重rpa引物和探针特异性强，灵敏度高，检测结果准确。

(2)本发明的检测方法将同时检测ndv、ibv和h9n2亚型aiv的常温三重rpa扩增技术与胶体金免疫层析试纸条连用，能同时检测ndv、ibv和h9n2亚型aiv三种病毒，能最少检测150拷贝的ndv、180拷贝的ibv和200拷贝的h9n2亚型aiv。本发明的检测方法特异性试验结果良好，重复性试验具有很好的稳定性，为有效检测和鉴别常见禽呼吸道疾病的混合感染提供一种成本低、快速、特异，不需要特殊设备的现场诊断新方法，有利于禽呼吸系统疫病的鉴别诊断，同时也可以免除高昂的仪器投入，便于基层推广使用。

(3)本发明可以作为规模化养禽场和散养场ndv、ibv和h9n2亚型aiv三种病毒的快速现场检测方法，可以作为这三种疫病的净化检测方法，建立无ndv、ibv和h9n2亚型aiv三种病原的种鸡群，同时也为ndv、ibv和h9n2亚型aiv三种病毒感染的分子流行病学调查，ndv、ibv和h9n2亚型aiv诊断试纸条的研制与开发提供了试验依据和技术参考。

附图说明

图1为本发明胶体金侧向流免疫层析试纸条组装原理示意图；

图2为本发明胶体金侧向流免疫层析试纸条工作原理示意图；

图3为本发明多重rpa引物和探针特异性检测的试纸条检测结果；其中，a为用于检测新城疫病毒(ndv)的引物和探针的特异性检测结果，b为用于检测传染性支气管炎病毒(ibv)的引物和探针的特异性检测结果，c为用于检测h9n2亚型禽流感病毒(h9n2亚型aiv)的引物和探针的特异性检测结果；

图4为本发明多重rpa引物和探针灵敏度检测的试纸条检测结果；其中，a为用于检测新城疫病毒(ndv)的引物和探针的灵敏度检测结果，b为用于检测传染性支气管炎病毒(ibv)的引物和探针的灵敏度检测结果，c为用于检测h9n2亚型禽流感病毒(h9n2亚型aiv)的引物和探针的灵敏度检测结果；

图5为本发明多重rpa引物和探针同时检测新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和h9n2亚型禽流感病毒的试纸条检测结果；其中，1为多重rpa扩增反应检测新城疫病毒的结果，2为多重rpa扩增反应检测传染性支气管炎病毒的结果，3为多重rpa扩增反应检测h9n2亚型禽流感病毒的结果，4多重rpa扩增反应同时检测新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和h9n2亚型禽流感病毒的实验结果，5为阴性对照。

具体实施方式

在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。若未特别指明，实施例中所用的原料、化学试剂均为常规市售商品，所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

以下实施例中使用rpa试剂盒nfokit购自英国twistdxinc公司；其中，能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链dna结合蛋白(ssb)和链置换dna聚合酶是以冻干粉状态存在于试剂盒所提供的rpa反应管中，使用时直接用试剂盒所带的反应缓冲液稀释。整个rpa反应时在rpa反应管中进行。

实施例1：用于检测新城疫病毒的引物和探针的合成

根据genbank中所公布的新城疫病毒血凝素神经氨酸酶(hn)基因序列对比结果，选择新城疫病毒hn基因核苷酸序列中587bp-621bp位置的序列(5’-gcagagatcactcacactcacatcagtatttagcac-3’)作为rpa扩增反应的上游引物；以新城疫病毒hn基因核苷酸序列中693bp-728bp位置序列的反向互补序列作为rpa扩增反应下游引物，合成引物时在下游引物的5’端标记生物素(biotin)：

5’-biotin-gttgcactcacactgcaagacttccgattttgggtg-3’。

以新城疫病毒hn基因核苷酸序列中634bp-681bp位置的序列作为探针，合成探针时，在探针序列的5’端标记488，将第7082位的碱基c替换为四氢呋喃(thf)，在探针的3’端添加3碳间隔臂(spacerc3)阻断序列：5’-488cggacatctgcaacagggagggtattctttt-[thf]-tactctgcgttccatc-spacerc3-3’。

引物和探针合成均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

实施例2：用于检测传染性支气管炎病毒的引物和探针的合成

由于鸡传染性支气管炎病毒毒株的血清型众多，本发明在比较各血清型鸡传染性支气管炎病毒毒株基因组序列的基础上，选择各血清型鸡传染性支气管炎病毒毒株基因组保守核苷酸序列，以该保守核苷酸序列进行引物和探针的设计。其中，以保守核苷酸序列中57bp-92bp位置的序列(5’-cttaacaaaacggacttaaatacctacagctggtcc-3’)作为上游引物；以保守核苷酸序列中204bp-242bp位置序列的反向互补序列作为下游引物，合成下游引物时，在下游引物的5’端标记生物素(biotin)：5’-biotin-ctaggtagcccaagcaacggatgtataaagtgagacac-3’。

以保守核苷酸序列中94bp-153bp位置的核苷酸序列作为探针，合成探针时，在探针序列的5’端标记fluoresceinamidite，将第130位的g替换为四氢呋喃(thf)，在探针的3’端添加3碳间隔臂(spacerc3)阻断序列：5’-fluoresceinamidite-cataggtgttccattgcagtgcactttagtgccctg-[thf]-atggcacctggccacctgtcagg-spacerc3-3’。

引物和探针均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

实施例3：用于检测h9n2亚型禽流感病毒的引物和探针的合成

根据genbank中所公布的h9n2亚型禽流感病毒m基因核苷酸序列对比结果，选择h9n2亚型禽流感病毒m基因核苷酸序列中223bp-262bp位置的序列(5’-cacgctcaccgtgcccagtgagcgaggactgcagcgtag-3’)作为上游引物；以m基因核苷酸序列中552bp-558bp位置序列的反向互补序列作为下游引物，合成引物时在下游引物的5’端标记生物素(biotin)：5’-biotin-catgcctgattagtgggttggtggtagtcgccatctg-3’；以m基因核苷酸序列中375bp-433bp位置序列作为探针，合成探针时，在探针序列的5’端标记digoxigenin，将第7082位的碱基c替换为四氢呋喃(thf)，在探针的3’端添加3碳间隔臂(spacerc3)阻断序列：5’-digoxigenin-gttgcactcagttactcaactggtgcgcttgccagttg-[thf]-atgggtctcatatacaaccg-spacerc3-3’。

引物和探针合成均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

实施例4：胶体金免疫层析试纸条的制备

(1)链霉亲和素包被的纳米金颗粒的制备：取1ml金纳米颗粒溶液(0.15pmol/ml)，加入200mm的硼砂溶液，调整ph值到9.5。同时，在另一个试管中将2μl的链霉亲和素(2mg/ml)与398μl的硼砂溶液(2mm)混合；将稀释的链霉亲和素加入到前述的纳米金颗粒溶液中，以50μl的量递加，边加边搅拌。将混合物置室温放置45分钟，加入含有155.6μl含10％bsa的2mm硼砂溶液，继续将溶液在室温放置10分钟，4500g离心15分钟，吸弃液体，用1ml的洗涤液(含有10g/lbsa的2mm硼砂溶液)重悬沉淀，4500g离心15分钟，吸弃液体，将红色的沉淀重悬在250μl含有5％bsa、137mmnacl和0.025％吐温-20的缓冲液中。按照此比例制备足量的链霉亲和素包被的纳米金颗粒，取250μl上述包被的纳米金颗粒滴加到7mm×300mm激光切割的玻璃纤维垫上，使之扩散均匀，在实验台上干燥过夜。

(2)胶体金侧向流免疫层析试纸条的制备：用含有5％甲醇、2％蔗糖的100mm碳酸氢钠缓冲液将抗alexafluor^@488抗体、抗荧光素酰胺抗体、抗地高辛抗体和生物素化的抗鼠igg分别稀释到终浓度为0.5mg/ml、0.5mg/ml、2.5mg/ml和1.0mg/ml。所有抗体均用侧向流试剂分配器，分配器头的速度设定在1～3厘米/分钟，优选为2厘米/分钟，注射泵的流速设定在0.1～0.3ml/分钟，优选为0.1ml/分钟。当四种抗体在试纸条上点样完成后，将试纸条在37℃干燥1小时。然后按照图2和如下步骤进行试纸卡的装配：①将一个17毫米×300毫米的吸收垫放在塑料支撑的硝酸纤维素膜的右手下游端，二者重叠2毫米；②将一个7毫米×300毫米含有干燥金纳米颗粒的玻璃纤维垫放在硝酸纤维素膜的左手上游端，二者重叠2毫米；③将一个12毫米×300毫米的玻璃纤维样品垫放在金纳米颗粒垫的左手端，二者重叠2毫米。装配完成后，将试纸卡立即裁成3毫米宽的试纸条即得到胶体金侧向流免疫层析试纸条，密封、干燥保存。

实施例5：rna模板提取

(1)鸡新城疫病毒rna的提取：①在1.5ml的eppendorf管中加入病毒原液500ul，再加入trizol1ml，充分混匀，室温放置10min，保证病毒外壳充分裂解；②加入200ul的氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡离心管，室温放置10min；③12000g室温离心15min，取上层液相移入另一管(切忌吸动白色中间相)；④加入500ul异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室温放置10min；⑤4℃，10000g离心10min，离心完毕可见管底白色沉淀，即为rna，用枪小心吸去所有上清；⑥加入1ml75％乙醇，让rna沉淀悬起来，4℃，7500g离心5min，用枪小心吸去所有上清，在超净台中干燥5min；⑦加入适量depc处理水溶解所提rna。所提rna立即用于反转录。若要保存，可在步骤⑥处理后加入乙醇后冻存于-70℃，可保存一年；若加入depc水后则只能在-20℃保存1个月左右。

(2)鸡传染性支气管炎病毒rna的提取：其提取方法同新城疫病毒rna的提取。

(3)h9n2亚型禽流感病毒rna的提取：其提取方法同新城疫病毒rna的提取。

实施例6：cdna的合成

分别以提取的新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和h9n2亚型禽流感病毒的rna为模板，反转录成为cdna。所述反转录体系为20μl，其具体反应操作为：在反应体系中加入模板rna2μg，10mmdntps、oligodt引物(20μm)0.5μl、随机引物(20μm)0.5μl；70℃加热5min，迅速放置冰上2min；然后再向反应体系中加入10×buffer2μ、rnase抑制剂1μl、反转录酶(200unit/μl)0.5μl，混匀后置于42℃，60分钟，然后置80℃，5分钟。

实施例7：引物和探针特异性试验

分别以h9n2亚型禽流感病毒rna、鸡传染性支气管炎病毒rna和鸡新城疫病毒rna的cdna为模板，采用英国twistdxinc公司的twistnfo试剂盒进行单一rpa扩增反应，对每一对引物和相应的探针进行特异性验证。所述单一rpa扩增反应体系以50μl计为：29.5μl水化缓冲液、模板cdna2μl、上游和下游引物(初始浓度均为20μm)各1μl、探针(初始浓度为20μm)0.3μl、无核酸酶纯水13.7μl和醋酸镁(浓度为280mm)2.5μl。

所述rpa扩增反应的加样顺序和反应条件为：首先将多重rpa反应体系中除了醋酸镁之外的成分加入到twistnfo试剂盒提供的冻干酶复合物反应管中，然后将醋酸镁加入到冻干酶复合物反应管的盖子内表面，然后盖上盖子，瞬时离心，使醋酸镁进入反应体系中启动反应；将冻干酶复合物反应管放入t8反应器或恒温水浴锅或其他形式的恒温装置中，40℃恒温孵育40分钟(其中，在恒温孵育开始后的5-7分钟，取出冻干酶复合物反应管，颠倒震荡8-10次，瞬时离心，然后再放回t8反应器或恒温水浴锅或其他形式的恒温装置中继续孵育至40分钟)。

孵育结束后，取5μlrpa扩增物，在含有95μltris盐缓冲液(25mmtris、150mmnacl和0.05％tween-20)的试管中稀释，将胶体金侧向流免疫层析试纸条的偶联垫末端垂直插入试管中，使偶联垫末端接触溶液。10分钟后，取出试纸条进行观察或用合适平板扫描仪进行扫描。结果显示(图3)，本发明所设计的分别针对鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒和h9n2亚型禽流感病毒的引物和探针均是特异的。

实施例8：引物和探针灵敏度分析试验

将上述方法提取的rna按照前述方法反转录成cdna，采用英国twistdxinc公司的twistnfo试剂盒进行单一rpa扩增反应，以检测上述引物和探针的灵敏度。具体试验操作为：分别将h9n2亚型禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒和鸡新城疫病毒的cdna进行10倍连续倍比稀释，分别以稀释后的不同浓度的cdna为模板进行rpa扩增反应，以确定引物和探针的灵敏度。所述rpa扩增反应体系、加样顺序和反应条件同实施例7。其中，cdna拷贝数计算为：利用紫外分光光度计测定od260nm吸光度，按照公式cdna浓度＝od260nm值×20μg/ml计算cdna浓度，按照公式(6.02×10²³拷贝数/摩尔)×(ng/ul×10^-9)/(cdna长度×330)＝copies/ul计算cdna的拷贝数。

rpa扩增反应结束后，取5μlrpa扩增物，在含有95μltris盐缓冲液(25mmtris、150mmnacl和0.05％tween-20)的试管中稀释，将胶体金侧向流免疫层析试纸条的偶联垫末端垂直插入试管中，使偶联垫末端接触溶液。10分钟后，取出试纸条进行观察或用合适平板扫描仪进行扫描。结果显示(图4)，本发明所设计的引物和探针以及所建立检测方法能最少检测150拷贝的ndv、180拷贝的ibv和200拷贝的h9n2亚型aiv。

实施例9：单一rpa扩增反应检测鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒和h9n2亚型禽流感病毒反应条件的优化

分别以h9n2亚型禽流感病毒rna、鸡传染性支气管炎病毒rna和鸡新城疫病毒rna的cdna为模板，采用英国twistdxinc公司的twistnfo试剂盒进行单一rpa扩增反应，对单一rpa扩增反应的引物浓度、探针浓度、醋酸镁浓度、模板浓度、反应温度(37-42℃)和反应时间(30-60min)进行优化。所述单一rpa反应体系为50μl，主要成分包括29.5μl水化缓冲液、0.5-2μl模板cdna、上游和下游引物(上、下游引物的初始浓度均为20μm)各0.5-1.0μl、0.1-0.4μl探针(初始浓度为20μm)和1.0-2.5μl醋酸镁(初始浓度为280mm)，用无核酸酶纯水补足反应体积至50μl。

所述单一rpa扩增反应的加样顺序和反应条件为：将单一rpa反应体系中除了醋酸镁之外的成分加入到twistnfo试剂盒提供的冻干酶复合物反应管中，然后将醋酸镁加入到冻干酶复合物反应管的盖子内表面，然后盖上盖子，瞬时离心，使醋酸镁进入反应体系中启动反应；将冻干酶复合物反应管放入t8反应器或恒温水浴锅或其他形式的恒温装置中，37-42℃恒温孵育30-60分钟。

孵育结束后，取5μl单一rpa扩增物，在含有95μltris盐缓冲液(25mmtris、150mmnacl和0.05％tween-20)的试管中稀释，将胶体金侧向流免疫层析试纸条的偶联垫末端垂直插入试管中，使偶联垫末端接触溶液。10分钟后，取出试纸条进行观察或用合适平板扫描仪进行扫描。

通过对单一rpa扩增反应条件的优化，最终得到分别检测新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和h9n2亚型禽流感病毒的单一rpa扩增反应的优化条件，其中，

检测鸡新城疫病毒的优化条件为：上游引物p1、下游引物p2各0.7μl，探针10.3μl，模板cdna2μl，醋酸镁2.5μl，反应温度为40℃，反应时间为40min；

检测传染性支气管炎病毒的优化条件为：上游引物p3、下游引物p4各0.8μl，探针20.4μl，模板cdna2μl，醋酸镁2.5μl，反应温度为40℃，反应时间为40min；

检测h9n2亚型禽流感病毒的优化条件为：上游引物p5、下游引物p6各0.5μl，探针30.3μl，模板cdna2μl，醋酸镁2.5μl，反应温度为40℃，反应时间为40min。

实施例10：多重rpa同时检测新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和h9n2亚型禽流感病毒

提取新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和h9n2亚型禽流感病毒的rna(提取方法同实施例5)；分别以提取的rna为模板，反转录合成相应的cdna(反转录的操作方法同实施例6)；以新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和h9n2亚型禽流感病毒的总cdna为模板，采用英国twistdxinc公司的twistnfo试剂盒进行多重rpa扩增反应；反应结束后，取5μl多重rpa扩增物，在含有95μltris盐缓冲液(25mmtris、150mmnacl和0.05％tween-20)的试管中稀释，将胶体金侧向流免疫层析试纸条的偶联垫末端垂直插入试管中，使偶联垫末端接触溶液，10分钟后，取出试纸条进行观察，判断本发明建立的多重rpa扩增反应体系对新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和h9n2亚型禽流感病毒同时检测的效果。

多重rpa扩增反应的反应体系为：利用实施例9所优化的单一rpa扩增反应条件，将分别检测新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和h9n2亚型禽流感病毒的单一rpa扩增反应整合为同时能检测新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和h9n2亚型禽流感病毒的多重rpa反应，其具体反应体系为(50μl)：水化缓冲液29.5μl，醋酸镁(初始浓度为280mm)2.5μl，以及总体积为18μl的引物、探针和模板cdna混合物。所述18μl的引物、探针和模板cdna混合物具体为：上游引物p1和下游引物p2(初始浓度20μm)各0.7μl、探针1(初始浓度20μm)0.3μl、上游引物p3和下游引物p4(初始浓度20μm)各0.8μl、探针2(初始浓度20μm)0.4μl、上游引物p5和下游引物p6(初始浓度20μm)各0.5μl、探针3(初始浓度20μm)0.3μl、模板cdna2-6μl(检测单一一种病毒时加入2μl该病毒的模板cdna，同时检测2病毒时，2种病毒的模板cdna各加入2μl，同时检测3种病毒时，3种病毒的模板cdna各加入2μl)、用无核酸酶纯水补足体积为18μl。

所述多重rpa扩增反应的加样顺序和反应条件为：是首先将除了醋酸镁之外的成分加入到twistnfo试剂盒提供的冻干酶复合物反应管中，然后将醋酸镁加入到冻干酶复合物反应管的盖子内表面，然后盖上盖子，瞬时离心，使醋酸镁进入反应体系中启动反应；将冻干酶复合物反应管放入t8反应器或恒温水浴锅或其他形式的恒温装置中，40℃恒温孵育40分钟(其中，在恒温孵育开始后的5-7分钟，取出冻干酶复合物反应管，颠倒震荡8-10次，瞬时离心，然后再放回t8反应器或恒温水浴锅或其他形式的恒温装置中继续孵育至40分钟)。

多重rpa扩增反应同时检测新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和h9n2亚型禽流感病毒的结果如图5所示，结果显示，在以新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和h9n2亚型禽流感病毒的总cdna为模板时，经过扩增在胶体金侧向流免疫层析试纸条能够同时出现与新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和h9n2亚型禽流感病毒相对应的检测线，以单一一种病毒的cdna为扩增模板时，胶体金侧向流免疫层析试纸条只能出现与单一检测病毒相对应的检测线。由此说明，本发明设计的多重rpa引物和探针对ndv、ibv和h9n2亚型aiv具有较高的特异性，能够实现三种病毒的同时检测，本发明的多重rpa同时检测ndv、ibv和h9n2亚型aiv的方法可以应用在规模化养禽场和散养场ndv、ibv和h9n2亚型aiv三种病毒的快速现场检测相关工作中。

sequencelisting

<110>河南农业大学

<120>一种用于同时检测ndv、ibv和h9n2亚型aiv的多重rpa引物和探针及其检测方法

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