用于ESC向外胚层前体细胞分化的培养基和培养方法与流程

本申请涉及胚胎干细胞分化培养领域，特别是涉及一种用于esc向外胚层前体细胞分化的培养基和培养方法。

背景技术：

胚胎干细胞(embryonicstemcell，缩写esc)是从早期发育的哺乳动物胚胎或原始生殖细胞中分离得到的一类具有自我更新能力和分化全能性的细胞，在一定条件下可向内、中、外三个胚层的细胞分化，在新型药物筛选、细胞替代治疗以及再生医学研究中有巨大应用前景。

自从1998年thomson等人成功建立起第一株人胚胎干细胞系以来，由于esc出色的增殖能力以及几乎能分化为体内所有种类细胞的潜能而备受研究者的青睐。神经外胚层是神经系统发育的起源，也是早期哺乳动物胚胎发育的重要阶段，研究发现esc能分化为功能神经元、神经胶质细胞和少突胶质细胞等神经类细胞，对帕金森症、肌萎缩性侧索硬化以及神经损伤等神经类疾病的研究与治疗有重大意义。esc向外胚层前体细胞分化是形成神经外胚层的重要基础，因此，如何快速地从esc中获得高纯度的外胚层前体细胞越来越受到科研工作者以及相关生物公司的重视。

目前主要通过esc体外拟胚体培养和定向诱导分化两种方法得到外胚层前体细胞。其中，拟胚体培养的方法需要耗费大量时间，操作过程复杂，并且分化效率低。定向诱导分化的方法需要用到多种细胞因子组合，分化培养基成分复杂，成本高昂，不利于大规模使用。

技术实现要素：

本申请的目的是提供一种新的用于胚胎干细胞向外胚层前体细胞分化的培养基和培养方法。

本申请采用了以下技术方案：

本申请的一方面公开了一种用于胚胎干细胞向外胚层前体细胞分化的培养基，该培养基包括分化培养基；分化培养基的基础培养基为rpmi-1640培养基、dmem/f12培养基或knockoutdmem/f12培养基，并且，分化培养基中含有第一试剂、第二试剂和第三试剂；第一试剂为终浓度30-60ng/ml的activina或终浓度40-80ng/ml的bmp-4，第二试剂为终浓度1-5μm的a83-01，第三试剂为终浓度1-8μm的pnu74654、终浓度1-10μm的dorsomorphin或终浓度0.5-5％重量份的b-27。

需要说明的是，本申请的胚胎干细胞向外胚层前体细胞分化的培养方法包括三个培养步骤，即饲养层培养、无饲养层培养和分化培养；因此，相应的培养基也应该是由三种培养基组成的，即饲养层培养基、无饲养层培养基和分化培养基；其中，分化培养基是直接影响胚胎干细胞向外胚层前体细胞分化的培养基，因此，本申请经过大量的试验和研究提出了一种新配方的分化培养基，按照本申请的培养方法和本申请的分化培养基，胚胎干细胞向外胚层前体细胞分化的比例可以达到99％以上，大大优于以往的方法和分化培养基。并且，本申请的分化培养基，成份相对简单，成本低，利于大规模生产和使用。

可以理解，饲养层培养和无饲养层培养都可以参考使用现有的培养基，但是，为了达到更好的分化培养效果，本申请的优选方案中，对饲养层培养基和无饲养层培养基也进行了特别限定，这将在以下的方案中详细说明。

优选的，分化培养基的基础培养基为rpmi-1640培养基，第一试剂为终浓度30-60ng/ml的activina，第三试剂为终浓度1-10μm的dorsomorphin。

优选的，本申请的用于胚胎干细胞向外胚层前体细胞分化的培养基，还包括饲养层培养基，饲养层培养基为铺有小鼠成纤维细胞的dmem/f12培养基或knockoutdmem/f12培养基；饲养层培养基中含有培养基重量份5-30％的kosr、1×l-glutamine、1×mem-neaa、1×2-mercaptoethanol和2-10ng/ml的bfgf。其中，kosr是knockoutserumreplacement的缩写。

优选的，饲养层培养基为铺有小鼠成纤维细胞的dmem/f12培养基。

需要说明的是，dmem/f12培养基是一种只含有基础成分的培养基，价格便宜，不含有kosr，使用时需要添加kosr；knockoutdmem/f12培养基由于含有能够与kosr更适合的配套成份，所以价格更高，但是，使用时还是需要额外添加kosr。本申请在试验中发现dmem/f12培养基与knockoutdmem/f12培养基的使用效果并没有明显差异，出于成本考虑，本申请优选采用dmem/f12培养基。

优选的，本申请的用于胚胎干细胞向外胚层前体细胞分化的培养基，还包括无饲养层培养基，无饲养层培养基的基础培养基为mtesr培养基或e8培养基，其中设覆盖有浓度为8-12mg/ml的bdmatrigel基质或浓度为0.2-0.5％重量份的纤连蛋白。

优选的，无饲养层培养基的基础培养基为mtesr培养基，其中铺设覆盖有浓度为8-12mg/ml的bdmatrigel基质。

其中，8-12mg/ml的bdmatrigel基质是指基质自身的浓度，其铺设量为将培养皿表面覆盖即可。同样的，0.2-0.5％重量份的纤连蛋白也是指其自身浓度，铺设量为将培养皿表面覆盖即可。bdmatrigel基质或纤连蛋白凝固后再加入mtesr培养基或e8培养基，形成无饲养层培养基。

需要说明的是，本申请中，饲养层培养基、无饲养层培养基和分化培养基是三个独立的产品，可以独立的生产、销售、购买和使用；只是本申请的胚胎干细胞向外胚层前体细胞分化的培养方法，将三者结合起来以达到更好的外胚层前体细胞分化效果。可以理解，单独从胚胎干细胞的培养来说，也可以独立的采用本申请的饲养层培养基替换现有的饲养层培养的培养基，或者独立的采用本申请的无饲养层培养基替换现有的无饲养层培养的培养基，又或者独立的采用本申请的分化培养基替换现有的分化培养的培养基。

本申请的另一面公开了本申请的培养基在人胚胎干细胞向外胚层前体细胞分化中的应用。

本申请的另一面公开了本申请的培养基在人胚胎干细胞分化制备功能神经元、神经胶质细胞或少突胶质细胞中的应用。

需要说明的是，本申请的培养基本身就是针对胚胎干细胞向外胚层前体细胞分化而提出的，因此，只要需要通过胚胎干细胞向外胚层前体细胞分化而制备的功能细胞，都可以采用本申请的培养基，不只限于功能神经元、神经胶质细胞或少突胶质细胞。

本申请的再一面公开了一种胚胎干细胞向外胚层前体细胞分化的培养方法，包括以下步骤，

(1)对胚胎干细胞进行饲养层培养；其中，在胚胎干细胞进行饲养层培养之前，通常还包括对液氮罐中取出esc进行复苏，然后再接种进行饲养层培养，esc复苏的方法参考现有技术，在此不做具体限定；

(2)胚胎干细胞饲养层培养至80％-90％融合时传代，进行无饲养层培养；

(3)无饲养层培养至30％-60％融合时，对其进行3-6天的分化培养，使得胚胎干细胞向外胚层前体细胞分化；

其中，分化培养采用的培养基为分化培养基，分化培养基的基础培养基为rpmi-1640培养基、dmem/f12培养基或knockoutdmem/f12培养基，并且，分化培养基中含有第一试剂、第二试剂和第三试剂；

第一试剂为终浓度30-60ng/ml的activina或终浓度40-80ng/ml的bmp-4，

第二试剂为终浓度1-5μm的a83-01，

第三试剂为终浓度1-8μm的pnu74654、终浓度1-10μm的dorsomorphin或终浓度0.5-5％重量份的b-27；

优选的，分化培养基的基础培养基为rpmi-1640培养基，第一试剂为终浓度30-60ng/ml的activina，第三试剂为终浓度1-10μm的dorsomorphin。

进一步优选的，本申请的培养方法中，饲养层培养采用的培养基为饲养层培养基，饲养层培养基为铺有小鼠成纤维细胞的dmem/f12培养基或knockoutdmem/f12培养基；饲养层培养基中含有培养基重量份5-30％的kosr、1×l-glutamine、1×mem-neaa、1×2-mercaptoethanol和2-10ng/ml的bfgf；无饲养层培养采用的培养基为无饲养层培养基，无饲养层培养基的基础培养基为mtesr培养基或e8培养基，其中铺设覆盖有浓度为8-12mg/ml的bdmatrigel基质或浓度为0.2-0.5％重量份的纤连蛋白。

优选的，饲养层培养基为铺有小鼠成纤维细胞的dmem/f12培养基；无饲养层培养基的基础培养基为mtesr培养基，mtesr培养基中铺设覆盖有浓度为8-12mg/ml的bdmatrigel基质。

本申请的有益效果在于：

本申请的用于胚胎干细胞向外胚层前体细胞分化的培养基，成份相对简单、成本低，利于大规模生产和使用。采用本申请的培养基的胚胎干细胞向外胚层前体细胞分化培养方法，操作便利快捷，能快速获得生长状态好、分化效率高的外胚层前体细胞，分化比例可以达到99％以上，为胚胎干细胞大规模的分化生产外胚层前体细胞奠定了基础。

附图说明

图1是本申请实施例中胚胎干细胞饲养层培养的显微镜观察结果；

图2是本申请实施例中胚胎干细胞无饲养层培养的显微镜观察结果；

图3是本申请实施例中胚胎干细胞分化得到的外胚层前体细胞的显微镜观察结果；

图4是本申请实施例中qpcr得到的多能性基因nanog和oct4的表达结果，图中control是指没有诱导分化的对照样品，induction是指向外胚层前体细胞分化的样品，纵坐标是指向外胚层前体细胞分化样品的相关基因相对于对照样品的基因表达量；

图5是本申请实施例中qpcr得到的外胚层前体细胞特异性基因pax6和ncam-1的表达结果，图中control是指没有诱导分化的对照样品，induction是指向外胚层前体细胞分化的样品，纵坐标是指向外胚层前体细胞分化样品的相关基因相对于对照样品的基因表达量；

图6是本申请实施例中流式细胞仪对外胚层前体细胞表面抗原cd56的检测结果，图中，a图的横坐标fsc是指细胞的前向角散射，纵坐标ssc是指细胞的侧向角散射；

图7是本申请实施例中免疫荧光染色检测外胚层前体细胞特异性蛋白otx-2的检测结果。

具体实施方式

现有的esc向外胚层前体细胞分化的方法和培养基，要么操作复杂、耗时长、分化效率低，如拟胚体培养；要么培养基成份复杂、成本高、很难大规模使用，如定向诱导分化。因此，本申请首先从培养基的角度入手，研发了一种成份简单、成本低、利于大规模使用的分化培养基；在此基础上，进一步优化培养方法，提出饲养层培养、无饲养层培养和分化培养的三步培养步骤，使得胚胎干细胞向外胚层前体细胞分化的比例达到99％以上。并且，本申请的培养方法和培养基，操作简单、成本低，且能快速地从esc中获得生长状态好、分化效率高的外胚层前体细胞。在以上研究的基础上，本申请进一步的研发了配套的饲养层培养基、无饲养层培养基，以达到更好的分化效率和质量。

本申请中activina为激活素a；bmp-4为骨形态发生蛋白4，英文名称为bonemorphogeneticprotein-4，缩写bmp-4；a83-01为选择性小分子抑制剂；pnu74654为wnt/β-catenin抑制剂；dorsomorphin为amquar信号通路抑制剂；b-27为神经细胞生长添加剂；l-glutamine为l-谷氨酰胺；mef为mouseembryonicfibroblast的缩写，即小鼠成纤维细胞；mem-neaa为包含非必需氨基酸试剂的mem培养基；2-mercaptoethanol为2-巯基乙醇；bfgf为碱性成纤维细胞生长因子；knockoutserumreplacement缩写kosr，即血清替代物；bdmatrigel为bd公司的基质胶；以上试剂都可以通过市场购买。

此外，本申请的所有培养基，包括rpmi-1640培养基、dmem/f12培养基、knockoutdmem/f12培养基、mtesr培养基和e8培养基，除特别限定的以外，其它都是通过市场购买获得。

下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。

实施例一

本例的以购自美国哈佛大学的胚胎干细胞为试验材料，进行外胚层前体细胞分化培养。本例的采用的培养基包括三组培养基，即饲养层培养基、无饲养层培养基和分化培养基。

饲养层培养基：为铺有小鼠成纤维细胞的dmem/f12培养基，培养基中含有重量份5-30％的kosr、1×l-glutamine、1×mem-neaa、1×2-mercaptoethanol和2-10ng/ml的bfgf，本例具体的kosr用量为20％，bfgf用量为10ng/ml。本例的kosr、1×l-glutamine、1×mem-neaa、1×2-mercaptoethanol和bfgf都购自gibco。

无饲养层培养基：为基铺设覆盖有8-12mg/ml的bdmatrigel基质或重量份0.2-0.5％的纤连蛋白的mtesr培养基或e8培养基，本例具体的为设覆盖有10mg/ml的bdmatrigel基质的mtesr培养基。其中，bdmatrigel基质购自bd公司，mtesr培养基购自stemcelltechnologies。

分化培养基：为含有第一试剂、第二试剂和第三试剂的rpmi-1640培养基，第一试剂为终浓度30-60ng/ml的activina或终浓度40-80ng/ml的bmp-4，本例具体的为终浓度50ng/ml的activina，第二试剂为终浓度1-5μm的a83-01，本例具体的用量为3μm，第三试剂为终浓度1-8μm的pnu74654、终浓度1-10μm的dorsomorphin或终浓度0.5-5％重量份的b-27，本例具体的为终浓度5μm的dorsomorphin。其中，rpmi-1640培养基还可以采用dmem/f12培养基或knockoutdmem/f12培养基替换，本例优选采用rpmi-1640培养基。

本例的胚胎干细胞向外胚层前体细胞分化的培养方法，具体包括以下步骤：

(1)esc饲养层培养

从液氮罐中取出h1系esc，在37℃水浴锅里融化，1000rpm离心5min，重悬细胞后接种到提前铺有mef的dmem/f12培养基中，每天换液，显微镜下观察细胞生长情况。

(2)esc无饲养层培养

待h1系esc在饲养层培养培养基中长到80％-90％融合时进行传代，本例具体的在90％融合时传代，进行无饲养层培养。

具体的，在esc长到90％融合时，加入1mg/mlⅳ型胶原酶(购自gibco)，消化15min；然后，按1:3的比例接种到无饲养层培养基中，每天换液，显微镜下观察细胞生长情况。

(3)esc向外胚层前体细胞分化

h1系esc在无饲养层培养基中长到30％-60％融合时进行分化培养，本例具体的长到40％融合时进行分化培养。

具体的将esc置于分化培养基中，培养3-6天，本例具体培养了5天，最终得到分化的外胚层前体细胞。培养过程中，每天换液，显微镜下观察细胞生长情况。

在以上培养过程中，通过显微镜观察得到的细胞生长情况如下：

h1系esc复苏4天后在mef饲养层培养基上形成圆形克隆团，如图1所示，说明细胞复苏后生长状态良好。然后，转换成无饲养层培养基，培养3天形成克隆团，并且周围并没有自发分化的细胞，如图2所示，说明细胞可以进行后续的定向分化。最后，在分化培养基上培养5天后，细胞形态发生明显变化，由克隆团状生长向周围铺开生长，且细胞形态呈梭形，表明esc已经开始分化，如图3所示，并且细胞状态良好。

实施例二

本例采用了三种方法对实施例一得到的esc分化外胚层前体细胞进行鉴定，即分别采用了qpcr检测外胚层前体细胞特异性基因表达、流式细胞术检测外胚层前体细胞表面抗原表达，以及免疫荧光染色检测外胚层前体细胞特异性蛋白表达。通过三种检测方法，进一步确定esc分化得到的细胞为外胚层前体细胞，并定量的对其分化效率进行检测。详细如下：

1.三种检测方法

1.1qpcr检测外胚层前体细胞特异性基因表达

h1系esc在分化培养基上培养5天后，提取其细胞总rna，rna提取采用购自takara的rna提取试剂盒。同时，提取没有经过分化培养基培养的h1系esc的细胞总rna作为对照。对rna进行逆转得到cdna，然后再进行qpcr。本例具体的，通过qpcr计算外胚层前体细胞特异性基因pax6、ncam-1以及多能性基因nanog和oct4的相对表达。

为此，本例设计了pax6、ncam-1、nanog和oct4四个基因的qpcr检测引物；同时，设计了管家基因gapdh的检测引物。四个基因和管家基因的引物如表1所示。

表1外胚层前体细胞检测引物

其中，管家基因gapdh，在任何时候都会表达，pcr检测时，作为一个参考和对照基因，用来计算目的基因的相对表达。

本例rna逆转为cdna的反应体系为：

逆转为的反应条件为：37℃30min、85℃10s、4℃冷却。

本例的qpcr反应体系为：

qpcr的反应条件为：95℃预变性30s，然后进入40个循环：95℃15s、60℃60s，在60℃时收集荧光，循环结束后4℃待机。

1.2流式细胞术检测外胚层前体细胞表面抗原表达

h1系esc在分化培养基上培养5天后，向其中加入1×accutase细胞消化液(购自innovativecelltechnologies)，然后于37℃消化10min，消化完成后，用40μm滤膜过滤收集细胞，并调整细胞浓度至5×10⁶cells/ml。向收集的细胞液中加入羊抗人cd56抗体(购自bd)，4℃避光孵育30min，孵育完成后300g室温离心5min，弃上清，上机检测。本例采用的流式细胞为bdfacsjazz流式细胞仪。

1.3免疫荧光染色检测外胚层前体细胞特异性蛋白表达

h1系esc在分化培养基上培养5天后，用含4％多聚甲醛的1×dpbs杜氏磷酸缓冲液(购自gibco)固定细胞，并用含10％正常驴血清、0.5％tritonx-100(购自beyotime)和1％bsa的1×dpbs封闭30min；然后用羊抗人otx-2(购自r&d)抗体室温避光孵育3小时，孵育完后用含1％bsa的1×dpbs洗涤细胞，荧光显微镜下观察拍照免疫染色情况。

2.结果

2.1qpcr检测结果

通过qpcr计算pax6、ncam-1、nanog和oct4四个基因的相对表达量，结果如图4和图5所示，图4是多能性基因nanog和oct4的表达，图5是外胚层前体细胞特异性基因pax6和ncam-1的表达；图4和图5中control是指没有诱导分化的对照样品，induction是指向外胚层前体细胞分化的样品，纵坐标是指向外胚层前体细胞分化样品的相关基因相对于对照样品的基因表达量。结果显示，多能性基因nanog和oct4的表达明显下降，而外胚层前体细胞特异性基因pax6和ncam-1的表达分别增加了7倍和31倍，增加量显著，说明h1系esc向外胚层分化明显，而多能性基因的表达受到明显抑制。

2.2流式细胞仪检测结果

利用流式细胞仪对外胚层前体细胞表面抗原cd56进行检测，结果如图6所示，图中a图为散点分布图，b图为统计的峰图；结果显示，外胚层前体细胞表面抗原cd56表达率达到99.13％，说明esc向外胚层前体细胞分化的比例达到99％以上，远远高于现有的外胚层前体细胞获取方法。可见，实施例一的培养基和培养方法，能够达到较高的分化效率。

2.3免疫荧光染色检测结果

通过免疫荧光染色检测外胚层前体细胞特异性蛋白otx-2，结果如图7所示，图中，dapi图为细胞核染色图，otx-2图为外胚层前体细胞特异性蛋白otx-2荧光染色图，merge图为输出的dapi图和otx-2图的合并图；结果显示，免疫荧光染色呈阳性反应，外胚层前体细胞特异性蛋白otx-2表达显著，说明esc向外胚层前体细胞分化成功。

通过三种方法的检测判断，说明采用本申请的培养方法和分化培养基，诱导esc分化得到的外胚层前体细胞，具有生长状态好、分化比例高等特点，并为外胚层前体细胞的大规模获得奠定了基础。

以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

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<110>深圳华大基因研究院

<120>用于esc向外胚层前体细胞分化的培养基和培养方法

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