一株产酶溶杆菌及其应用的制作方法

本发明涉及一株产酶溶杆菌，还涉及到该菌发酵液对植物病原真菌有广谱、高效拮抗方面的应用，属于农业生防微生物领域。

背景技术：

植物病害的70％～80％是病原真菌侵染所致，真菌病害一直是造成作物减产的主要原因之一，全球范围内每年因真菌引起的作物病害直接造成上千亿美元的经济损失。真菌病害不仅会造成作物产量下降和品质降低，而且会在侵染过程中产生有毒代谢物，对农产品的安全性构成极大威胁，目前由真菌引起的作物病害已经成为全球性的食物安全问题。

目前，真菌病害的防控主要依赖于化学农药的使用，但其带来的环境污染及农药残留引起的食品安全问题成为社会各界关注的焦点。生物防治作为一种替代传统化学防治方法应用于植物真菌病害防治的研究已经引起了全世界关注。一方面生防菌能抑制杀死病原菌，另一方面还能诱导植株提高抗病性，是一种环境友好的防治方法，极具开发潜力。美国、澳大利亚和日本等发达国家已将多株具有良好防病效果和环境友好的生防菌株投入使用，并且取得了良好效果。

以真菌作为生防菌，主要使用的是真菌孢子制剂，生产工艺复杂，生产成本较高，其产业化程度和应用范围受到一定的限制。链霉菌主要通过产生抗生素发挥生防作用，但由于资源短缺和作用机制的限制，该类生防制剂也受到研发成本和实际应用的制约。相比之下，细菌具有繁殖速度快、营养要求简单、环境适应性良好和根际土壤定植能力强等特点，已经成为植物病害生物防治领域的热点。

溶杆菌(lysobacterspp.)属于变形菌门，黄单胞菌目，黄单胞菌科，在《伯杰氏手册(第1版)》中分在第15组。该溶杆菌属中的四个种：产酶溶杆菌(lysobacterenzymogenes)、抗生素溶杆菌(lysobacterantibioticus)、变棕溶杆菌(lysobacterbrunescens)和胶状溶杆菌(lysobactergummosus)具有高效抗菌活性和植物病害生防潜力，是一类新型植物病害生防细菌。其作用机理为：(1)产生小分子抗菌次生代谢物质；(2)分泌产生大量胞外酶，包括几丁质酶、β-1，3-葡聚糖、蛋白酶和纤维素酶；(3)诱导植物产生抗病性；(4)较好的定殖能力。

综上所述，开发具有安全、高效、广谱生防潜力的溶杆菌菌株，对于生防溶杆菌资源库的构建，保护生态环境和减少化学农药的使用具有重要意义，同时也可以促进生态农业和绿色农业的发展。

技术实现要素：

针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供一种新型产酶溶杆菌le16，解决目前植物病害生防细菌选择受限的问题；进一步提供所述产酶溶杆菌le16在对植物病原真菌方面的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一株产酶溶杆菌，其特征在于,其16srdna具有序列表中的核苷酸序列，保藏登记号为：cgmccno.14215，分类命名为lysobacterenzymogenesle16。

进一步，所述产酶溶杆菌的发酵液在对柑橘炭疽病菌(colletotrichumgloeosporioides)、柑橘青霉病菌(penicilliumitalicum)、烤烟黑胫病菌(phytophthoranicotiana)、烤烟赤星病菌(alternariaalternate(fr.)keissler)、西瓜蔓枯病菌(didymellabryoniae)、松立枯丝核病菌(rhizoctoniasolani)、油菜菌核病菌(sclerotiniasclerotiorum)或辣椒疫病菌(phytophthoracapsici)等植物病原真菌的具有较强拮抗作用的应用。

进一步，该产酶溶杆菌的发酵液能有效防治烤烟黑胫病和白粉病。

进一步，产酶溶杆菌的发酵液在上述方面的应用，用于防治和治疗上述植物病原真菌和烤烟黑胫病和白粉病等生物药品方面的应用。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

1、本发明利用稀释涂布的方法，以烟草黑胫病病原菌作为靶标菌，从土壤中分离纯化得到一株对烟草黑胫病病原菌有较强拮抗作用的菌株le16，经形态学鉴定、16srdna测序等方法鉴定为产酶溶杆菌(lysobacterenzymogenes)。该产酶溶杆菌le16具有繁殖速度快、营养要求简单、环境适应性良好和根际土壤定植能力强等特点。另外也丰富了生防菌资源库。

2、本发明提供的产酶溶杆菌le16不同于已发现的其它生防溶杆菌，具有独特的16srdna核苷酸序列，并且该菌株在液体培养时具有自溶作用；自溶后细胞释放出大量的氨态氮和无机磷等，为植物提供易吸收的营养物质。此发酵液对多种植物病原真菌包括柑橘炭疽病菌(colletotrichumgloeosporioides)、柑橘青霉病菌(penicilliumitalicum)、烤烟黑胫病菌(phytophthoranicotiana)、烤烟赤星病菌(alternariaalternate(fr.)keissler)、西瓜蔓枯病菌(didymellabryoniae)、松立枯丝核病菌(rhizoctoniasolani)、油菜菌核病菌(sclerotiniasclerotiorum)、辣椒疫病菌(phytophthoracapsici)等具有较强的拮抗作用，具有广谱生防潜力，同时该产酶溶杆菌发酵液能有效防治烤烟黑胫病和白粉病。

3、本发明提供的产酶溶杆菌le16，其发酵液的制备过程工艺简单、原料和生产成本低、菌体生长快及被污染的几率低，优于目前传统的植物真菌病害防治方法。该产酶溶杆菌在植物真菌病害防治方面具有较好的应用前景。

附图说明

图1为本发明le16在4种不同培养基上的菌落形态；

图2为本发明le16在不同时间的摇瓶培养图；

图3为本发明le16摇瓶培养时的生长曲线；

图4为本发明le16发酵液对8种不同病原真菌的拮抗效果；

图5为本发明le16的16srdnapcr电泳图；

图6为本发明le16的系统发育树。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细说明。

一、材料和方法

1、试验菌株：

柑橘炭疽病菌(colletotrichumgloeosporioides)、柑橘青霉病菌(penicilliumitalicum)、烤烟黑胫病菌(phytophthoranicotiana)、烤烟赤星病菌(alternariaalternate(fr.)keissler)、西瓜蔓枯病菌(didymellabryoniae)、松立枯丝核病菌(rhizoctoniasolani)、油菜菌核病菌(sclerotiniasclerotiorum)、辣椒疫病菌(phytophthoracapsici)。

2、培养基：

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，nacl10.0g，蒸馏水1000ml，ph7.0，固体培养基分装后另加琼脂2.0g/100ml。

lb培养基：tryptone10.0g，nacl10.0g，yeastextract5.0g，蒸馏水1000ml，ph7.0，固体培养基分装后另加琼脂粉1.5g/100ml。

tsa培养基：胰蛋白胨大豆肉汤培养基(tryptic-soytone-broth-medium)30.0g，蒸馏水1000ml，分装后另加琼脂1.8g/100ml。

10％tsa培养基：胰蛋白胨大豆肉汤培养基(tryptic-soytone-broth-medium)3.0g，蒸馏水1000ml，分装后另加琼脂1.8g/100ml。

pda培养基：200g土豆煮沸30min后多层纱布过滤后用蒸馏水定容至1000ml，再加入葡萄糖20.0g，分装后另加琼脂2.0g/100ml。

实施例1：细菌的分离及鉴定

1、细菌的分离

le16从云南省玉溪市农田土壤中分离得到。在2016年烤烟旺长期，采集烤烟根际土壤，用稀释平板涂布法分离土壤中微生物。称取1.0g土壤置于装有100ml无菌水的250ml三角瓶中，在28℃、150r/min的摇床中震荡1h后制备成土壤悬液。然后，在无菌操作台上将土壤悬液稀释成不同浓度梯度，稀释倍数为10^-2～10^-7(即10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6和10^-7)。用灭菌后的移液枪分别吸取0.5ml稀释10^-2～10^-7倍的土壤悬浊液于牛肉膏蛋白胨固体培养基上并均匀涂布，每个稀释度重复5次。操作完成后，将平板在32℃条件下培养2d，挑取不同形态的细菌菌落在牛肉膏蛋白胨培养基上进行反复纯化，纯化5次后低温斜面保存。

2、拮抗细菌的筛选：

用接种针分别挑取斜面保存的细菌菌株，接种于50ml灭菌后的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在28℃、100r/min的摇床中培养24h，制备成od600值为1.0的细菌菌液。在pda平板中央接种直径为6mm的烤烟黑胫病菌菌块，取上述细菌菌液1ml，均匀滴加于黑胫病菌块周围，5次重复，同时以滴加无菌水的平板作为对照，将平板在28℃条件下培养4d后，观察病原菌的生长状况，筛选出对烤烟黑胫病菌拮抗作用最强的细菌菌株。

实施例2：拮抗细菌菌株的鉴定

1、菌落的形态观察

将拮抗作用最强的上述细菌菌株接种于牛肉膏蛋白胨培养基、lb培养基、tsa培养基和10％tsa培养基上，32℃条件下培养12h，观察菌落形态。如图1为本发明le16在4种不同培养基上的菌落形态，在牛肉膏蛋白胨培养基、lb培养基和tsa培养基上，菌落都呈现淡黄色，菌体湿润有光泽，表面突出，呈现粘液状，不易挑起；在10％tsa培养基上，菌落呈现乳白色，表面平坦，不易挑起。在各种培养基上培养，该菌株均产生难闻的臭味。

2、细菌革兰氏染色反应

(1)涂片：取一片干净载玻片，在玻片中央滴一小滴无菌蒸馏水，用无菌接种环挑取少量菌体涂成很薄的一层水膜，在酒精灯火焰上来回几次干燥固定。

(2)初染：在菌体上滴加结晶紫染液，1min后用蒸馏水轻轻冲洗至洗出液为无色。

(3)媒染：在菌体部分滴加碘液，1min后用蒸馏水洗净。

(4)脱色：将载玻片上的水甩净，用95％酒精滴洗菌体部分至洗出液刚刚不出现紫色为止，整个过程大约持续20s，接着立即用蒸馏水将载玻片洗净，终止脱色。

(5)复染：甩去载玻片上的水，在涂面上滴加蕃红染液，1min后用蒸馏水洗净后干燥。

(6)镜检：在油镜下检测染色结果，病观察菌体形状。

经过革兰氏染色反应得到le16为革兰氏阴性菌，细胞呈杆状。

3、细菌生长曲线测定

用接种针挑取固体培养基上的细菌菌株，接种于100ml灭菌后的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在28±1℃，100r/min摇床中培养12h，制备出含10^6～9cfu/ml的种子液；三角瓶中装入50ml牛肉膏蛋白胨液体培养基，灭菌后冷却至常温，按10²cfu/ml的接种量进行接种，然后将三角瓶置于28±1℃，100r/min摇床中培养，每隔12h测定od600值的大小并对菌液进行拍照，制成细菌生长曲线(图3)和不同时间的摇瓶生长图(图2)。经过对细菌生长曲线的测定，发现le16菌体数量在培养48h后达到顶峰，后逐渐减少，并在144h左右菌体完全消失。

4、发酵液制备方法

用接种针挑取固体培养基上的细菌菌体，接种于100ml灭菌后的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在100r/min，28±1℃摇床中培养12h，制备出含10^6～9cfu/ml的种子液；三角瓶中装入50ml牛肉膏蛋白胨液体培养基(培养基ph：7.0；氨态氮含量：90～100mg/l；有效磷含量：1.5～2.0mg/l；有效钾含量：8～10mg/l)，灭菌后冷却至常温，按10²cfu/ml的接种量进行接种，然后在28±1℃、100r/min条件下摇床培养6d，菌体全部自动消失，制备出自溶后的产酶溶杆菌发酵液(发酵液ph：9.0～9.5；氨态氮含量：900～1100mg/l；有效磷含量：14～16mg/l；有效钾含量：8～10mg/l)。

上述实验可知，该菌自溶后发酵液中的氨态氮含量和有效磷含量大幅度增加，约为初始培养的10倍。

5、对病原真菌的拮抗作用

将制备出的发酵液ph调节为中性后混入pda培养基中，制成4种不同浓度的带毒平板，发酵液含量分别为：0％(处理ck)，10％(处理a)，20％(处理b)和40％(处理c),并保证每毫升培养基中的营养物质含量相等。再将8种不同类型的病原真菌接种于不同浓度的带毒平板上，每个处理重复3次，在28℃条件下培养4d后观察效果并拍照(图4)。

由图4(le16发酵液对8种不同病原真菌的拮抗效果)可以看出，本发明菌株发酵液浓度为40％时，柑橘炭疽病菌(colletotrichumgloeosporioides)、柑橘青霉病菌(penicilliumitalicum)、烤烟黑胫病菌(phytophthoranicotiana)、烤烟赤星病菌(alternariaalternate(fr.)keissler)、西瓜蔓枯病菌(didymellabryoniae)、松立枯丝核病菌(rhizoctoniasolani)、油菜菌核病菌(sclerotiniasclerotiorum)、辣椒疫病菌(phytophthoracapsici)在培养基上的生长受到了明显的限制，本发明菌株发酵液浓度为20％时，以上8种不同类型的病原真菌的生长也受到不同程度的限制。

6、烤烟黑胫病防治实例

在重庆市某烟地于2017年4月25日和5月15日分别用步骤4制备的le16发酵液兑水稀释2倍灌根，每株烟苗施用50ml，防治烟草黑胫病的效果为75.7％。

7、烤烟白粉病防治实例

在重庆市某烟地于2017年6月1日和6月10日，分别用步骤4制备的le16发酵液兑水稀释4倍，喷施于发生白粉病的烟株叶片(以湿润叶片为度)，对白粉病菌的杀灭率为85.7％。

实施例3：16srdna测序

首先用takaraagarosegeldnapurification细菌基因组dna提取试剂盒提取le16的dna，作为16srdna扩增的模板。选用细菌通用引物27f(5’-agagtttgatcctggctcag-3’)和1492r(5’-taccttgttacgactt-3’)进行pcr扩增。pcr反应体系20μl：

10×extaqbuffer2.0μl；2.5mmdntpmixture1.6μl；5pmol/μl引物27f0.8μl；5pmol/μl引物1492r0.8μl；模板dna0.5μl；5u/μlextaqdna聚合酶0.2μl；ddh2o14.1μl。pcr扩增程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min30s、24个循环，最后72℃延伸10min。pcr反应产物经1％琼脂糖凝聚电泳检测，与dl2000marker比较，片段大小正确，为目的片段，见图5。将目的片段纯化后在abi3730xl测序仪上进行测序，所得序列长度为1292bp，具体见le1616srdna序列表的核苷酸序列。

将所得序列与ncbi核苷酸序列数据库进行同源性比对分析。结果显示，菌株le16与lysobacterenzymogenesstrain521，lysobacterenzymogenesstrainc3，lysobacterenzymogenesstraince710等有较高的同源性，用mega软件中的邻接法(neighbor-joining)构建系统发育树，见图6。由图可知le16与lysobacterenzymogenes遗传距离最近，根据同源性比对和系统发育分析结果，le16属于产酶溶杆菌。

本发明提供的生防细菌le16，经形态、生理生化及16srdna测序等方法鉴定得到该菌株为产酶溶杆菌(lysobacterenzymogenes)。已于2017年6月2日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc)，保藏号为cgmccno.14215，分类命名为产酶溶杆菌lysobacterenzymogenes。在不同培养基上，le16生长速度极快：在牛肉膏蛋白胨培养基、lb培养基和tsa培养基上，菌落都呈现淡黄色，菌体湿润有光泽，表面突出，呈现粘液状，不易挑起；在10％tsa培养基上，菌落呈现乳白色，表面平坦，不易挑起。生理特征：革兰氏阴性、细胞呈杆状、无鞭毛。最适生长温度：28℃。在各种培养基上培养，该菌株均产生难闻的臭味。该菌株的发酵液对多种植物病原真菌具有较强的拮抗作用，能有效防治烤烟黑胫病和白粉病。该菌株在植物病原真菌防治上具有巨大的应用潜力。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案尤其是对本菌株的抗菌谱和发酵液的制备方法进行扩展、修改或者等同替换，用于植物真菌病害的防治，应视为不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

sequencelisting

<110>西南大学

<120>一株产酶溶杆菌le16及其应用

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