本发明涉及一种基因重组的大肠杆菌及其合成芸苔素内酯的方法。
背景技术：
芸苔素甾醇（brassinoteroids，brs）是继生长素、赤霉素、细胞分裂素、脱落酸和乙烯之后发现的第六大类植物激素，对植物的生长发育具有重要的调控作用。br在很低的浓度即明显地增加植物的营养生长和促进受精，通常以0.1～0.001mg/l浓度即可显示其很高的生理活性。其主要作用是提高坐果率，促进作物生长，提高结实率，增加千粒重及提高作物抗寒、抗病能力，减轻药害。
1970年，美国学者j.w.mitchell等从油菜花粉中提取出一种具有强生理活性物质，对植物茎的伸长和细胞分裂有强烈的促进作用，定名为油菜素，又称芸苔素(brassins)。1979年美国学者grove利用蜜蜂采集的方法收获了227公斤的油菜花粉，提纯了4mg的油菜素，通过仪器分析确定其化学结构属于甾醇内酯，故命名为油菜素内酯(brassinolide，bl)。迄今发现了大约70种天然芸苔素内酯类化合物,被合称为油菜素甾醇类物质（brassinosteroid，br）。br在植物中广泛存在，由于它们的功能与bl相似，因此br成为了油菜素甾醇类物质的代称，而bl是油菜素甾醇类成员中活性最强的一种分子。
从90年代中期开始，研究者们对拟南芥、豌豆、西红柿、水稻等植物中发现的br突变体进行生理生化、分子遗传等方面的研究，促进了我们对br合成和促进的认识。br在植物体内合成以甲羟戊酸为前体，经过甾醇合成途径转化为油菜甾醇。从油菜甾醇转化为br，由早期和晚期c-22氧化途径、早期和晚期c6氧化途径、早期c-22氧化途径和晚期c-6氧化途径之间的合成捷径组成。迄今为止，研究者们已经从植物中克隆了24个br合成基因和6个br代谢基因，这些基因编码的酶可催化br合成途径的反应步骤。
早在1985年科研工作者就开始进行芸苔素内酯的化学合成。芸苔素内酯由麦角甾醇通过甲磺酰化反应制得麦角甾醇甲磺化物，水解得异麦角甾醇，氧化反应制得相应的烯酮，还原制得酮，开环得二烯酮，羟基化得四羟基酮，扩环制得芸苔素内酯。化学合成芸苔素内酯反应过程需强氧化剂及还原剂参与。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种可发酵制备芸苔素内酯的基因重组的大肠杆菌bl21(de3)-bl。
本发明的另一目的是提供基因重组的大肠杆菌bl21(de3)-bl在制备芸苔素内酯中的应用。
本发明是这样实现的：
1.基因重组的大肠杆菌bl21(de3)-bl，由大肠杆菌bl21(de3)携带的cyp90b1、cyp90c1、cyp85a2三个目的基因的重组质粒pet-28a-cyp90b1、pet-28a-cyp90c1、pet-28a-cyp85a2构成。导入的目的基因cyp90b1、cyp90c1、cyp85a2的mrna碱基序列和氨基酸序列分别见序列表中的序列1和2，3和4，5和6。该基因重组大肠杆菌的中文命名：大肠埃希氏菌，拉丁文名：escherichiacoli，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏日期：2017年5月27日，保藏编号：cgmccno.14203。
2．基因重组的大肠杆菌bl21(de3)-bl，制备方法如下：
（1）提取油菜植株各器官的总rna；
（2）将油菜植株总mrna反转录，产物即为油菜植株的cdna文库；
（3）目的基因引物设计及pgem-teasy重组质粒构建。三个基因引物分别为：
cyp90b1上游引物：5‘-gaattcatgttcgaaacagagcatc-3’（ecor1）
下游引物：5‘-ccgctcgaggccacagaatacgagaaac-3’（xho1）
cyp90c1上游引物：5‘-ggatcccgtatgcaacctccggc-3’（bamh1）
下游引物：5‘-taaagcggccgcaatgatcttcaagtgag-3’（not1）
cyp85a2上游引物：5‘-cgggatcccggatgggcataatg-3’（bamh1）
下游引物：5‘-ccgctcgagcggagtaaggtgaacact-3’（xho1）
通过pcr扩增、pcr产物胶回收、pcr产物与pgem-teasy质粒连接、重组质粒转化、质粒鉴定，构建cyp90b1、cyp90c1、cyp85a2三个基因的pgem-teasy重组质粒。
（4）pet-28a(+)相关质粒构建。测序结果正确的三个基因的pgem-teasy质粒用相应引物上的酶进行双酶切，双酶切产物胶回收后与经相同双酶切后的载体pet-28a(+)进行连接并转化，挑取单克隆进行扩大培养并鉴定，得到cyp90b1、cyp90c1、cyp85a2三个目的基因的pet-28a(+)重组质粒：pet-28a-cyp90b1，pet-28a-cyp90c1，pet-28a-cyp85a2。
（5）cyp90b1、cyp90c1、cyp85a2蛋白的表达。将pet-28a-cyp90b1，pet-28a-cyp90c1，pet-28a-cyp85a2三种等量的重组质粒同时转化大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，用含kan抗性的平板进行筛选，通过pcr及双酶切筛选得到同时表达三个目的基因的工程菌大肠杆菌bl21(de3)-bl。
3.基因重组的大肠杆菌bl21(de3)-bl在发酵制备芸苔素内酯中的应用，添加底物麦角甾醇、甲羟戊酸和诱导物，调节发酵参数，补料进行连续发酵。
将诱导物与表达载体启动子相匹配，诱导物诱导启动子启动，进行转录。
工程菌菌液培养至对数期后接种到添加了底物麦角甾醇重量百分浓度为0.5~2%、甲羟戊酸重量百分浓度为1~5%和诱导物iptg重量百分浓度为0.02%的发酵基础培养基中（牛肉膏3~5g/l、胰蛋白胨5~10g/l、酵母膏2~4g/l、nacl5~10g/l），维持温度35~37℃、ph6.5-7.0深层液体发酵24~72h后，加入吐温-20（添加浓度为发酵液体积的0.01%~2.5%），调节发酵参数，并开始连续或间歇式流加补料培养基，解除阻遏，提高芸苔素内酯产量。发酵5~8d以后发酵液用乙酸乙酯提取结晶或过层析柱制得芸苔素内酯。
本发明解决了化学合成芸苔素内酯反应条件苛刻等问题。通过微生物发酵制备芸苔素内酯，条件温和，环境友好。芸苔素内酯的生物合成将会更好地推动芸苔素内酯的应用，从而提高粮食产品、提升作物品质。
附图说明：
图1为构建pet-28a(+)相关质粒流程图，以目的基因cyp90b1为例。
具体实施方式：
实施例1：
cyp90b1、cyp90c1、cyp85a2三个基因在原核微生物表达载体pet-28a(+)的构建、表达及发酵工艺如下，含有三种重组表达载体的大肠杆菌菌株bl21(de3)-bl已于2017年5月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：cgmccno.14203。
大肠杆菌菌株bl21(de3)–bl制备方法如下：
（1）油菜植株各器官的总rna
①取植物嫩叶，液氮研磨，每1.5mltube分装0.1克样品；
②每管加入0.5mltrizol液，迅速混匀，注意样品总体积不能超过所用trizol体积的10%；
③室温下静置5~10分钟以利于核酸蛋白质复合体的解离；
④加入0.5ml的氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒，室温静置5分钟，10000rpm离心10分钟；
⑤取上清液（水相）转入一新的离心管，加入等体积异丙醇，室温放置10分钟，10000rpm离心10分钟；
⑥弃去上清液，加入至少1ml的70%乙醇，涡旋混匀，4℃下7500rpm离心5分钟；
⑦小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5~10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低rna的溶解度。然后将rna溶于te，必要时可55~60℃水溶10分钟；
⑧dna的紫外分光光度计检测及浓度测定。
（2）植株总mrna反转录
根据primescripttmrtreagentkitwithgdnaeraser说明书，操作如下：
基因组dna的去除反应，如下：
反应程序：42℃，2min；4℃，2min
反转录反应：反应液在冰上配制，反应体系及条件如下：
反应程序：37℃，15min；85℃，5sec；4℃，2min，产物即为油菜植株的cdna文库。
（3）pgem-teasy相关质粒构建
以油菜植株cdna文库为模板，根据ncbi生物信息学分析，构建cyp90b1、cyp90c1、cyp85a2三个基因的pgem-teasy重组质粒。引物设计过程中应该注意酶切位点的选择及避免出现移码突变。
①表达载体为pet-28a(+)时，三个基因引物设计：
cyp90b1上游引物：5‘-gaattcatgttcgaaacagagcatc-3’（ecor1）
下游引物：5‘-ccgctcgaggccacagaatacgagaaac-3’（xho1）
cyp90c1上游引物：5‘-ggatcccgtatgcaacctccggc-3’（bamh1）
下游引物：5‘-taaagcggccgcaatgatcttcaagtgag-3’（not1）
cyp85a2上游引物：5‘-cgggatcccggatgggcataatg-3’（bamh1）
下游引物：5‘-ccgctcgagcggagtaaggtgaacact-3’（xho1）
②含酶切位点引物扩增三个目的基因，pcr反应体系如下：
③pcr反应条件：
④pcr产物切胶回收：
pcr反应结束后的产物中加入6×loadingbuffer在1%琼脂糖凝胶中电泳，电泳结束后在bio-rad凝胶成像分析仪中进行切胶回收，按照axygendna胶回收试剂盒进行dna回收，用紫外分光光度计测定dna的浓度及纯度。
⑤连接：
回收后的pcr产物先连接到pgem-t-easy载体上，连接体系如下：
4℃连接过夜
⑥转化：
a从-80℃冰箱中取100μl/ep管的感受态细胞dh5α悬液,冰上解冻；
b加入5μl含重组质粒的连接体系,轻轻混匀,冰上放置30分钟；
c43℃水浴中热击90秒,迅速将ep管置于冰上冷却3-5分钟；
d向ep管中加入1mllb液体培养基(不含amp),混匀后37℃振荡培养1小时,使细菌恢复正常生长状态；
e将复苏后的菌液离心，用100μl新鲜lb液体培养基重悬后，取30μl涂布于含amp的lb固体培养基上,正面向上放置至菌液完全被培养基吸收，倒置培养皿，37℃培养16-24小时；
f次日，挑单克隆进行扩大培养后提取质粒。
⑦质粒鉴定
质粒分别进行酶切、pcr及测序鉴定。
（4）pet-28a(+)相关质粒构建
测序结果正确的三个基因的pgem-teasy质粒用相应引物上的酶进行双酶切酶切，双酶切产物胶回收后与经相同双酶切后的载体进行连接并转化，挑取单克隆进行扩大培养并鉴定（操作方法同3）。得到cyp90b1、cyp90c1、cyp85a2三个基因的pet-28a(+)重组质粒即：pet-28a-cyp90b1，pet-28a-cyp90c1，pet-28a-cyp85a2。
（5）cyp90b1、cyp90c1、cyp85a2蛋白的表达
①质粒转化
pet-28a-cyp90b1，pet-28a-cyp90c1，pet-28a-cyp85a2三种等量的重组质粒同时转化大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，用含kan抗性的平板进行筛选，通过酶切、pcr鉴定选择可同时容纳三种重组质粒的感受态细胞。
②培养及诱导
a将转化后的表达菌挑取单克隆接种于5ml含100μg/mlkan的lb液体培养基中，37℃摇床振荡培养过夜；
b第二天以1:100的比例接种于250ml含100μg/mlkan的lb液体培养基中，加入iptg至终浓度为0.2mm，加入反应底物，诱导培养。
实施例2
基因重组的大肠杆菌bl21(de3)制备芸苔素内酯的应用：
实施例1步骤（5）培养及诱导
a将转化后的表达菌挑取单克隆接种于5ml含100μg/mlkan的lb液体培养基中，37℃摇床振荡培养过夜；
b第二天以1:100的比例接种于250ml含100μg/mlkan的lb液体培养基中，加入iptg至终浓度为0.2mm，加入反应底物，诱导培养。
工程菌菌液培养至对数期后接种到添加了底物麦角甾醇重量百分浓度为0.5~2%、甲羟戊酸重量百分浓度为1~5%和诱导物iptg重量百分浓度为0.02%的发酵基础培养基中，发酵基础培养基成分：牛肉膏3~5g/l、胰蛋白胨5~10g/l、酵母膏2~4g/l、naoh5~10g/l，维持温度35~37℃、ph6.5-7.0深层液体发酵24~72h后，加入吐温-20（添加浓度为发酵液体积的0.01%~2.5%），并开始连续或间歇式流加补料培养基，解除阻遏，提高芸苔素内酯产量。发酵5-8d以后发酵液浓缩后用乙酸乙酯提取结晶或过层析柱制得芸苔素内酯。
上述实施例是对本发明的上述内容作进一步的说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于上述实施例。对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，凡基于上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
序列表