一种两亲性类ε‑聚赖氨酸交替共聚物及其合成、该共聚物的组装体及其制备方法和应用与流程

本发明属于抗菌生物材料领域，具体涉及一种两亲性类ε-聚赖氨酸交替共聚物及其合成、该共聚物的组装体及其制备方法和应用

背景技术：

ε-聚赖氨酸(epl)是由l-赖氨酸的ε-氨基与另一l-赖氨酸的α-羧基形成ε-酰胺键聚合而成，由白色链霉菌发酵产生。它可以在人体中分解成为赖氨酸，而赖氨酸正是人体维持正常生理机能所必须的八大氨基酸之一。因此，早在20世纪80年代初，ε-聚赖氨酸(epl)便可作为一种天然的防腐剂添加入食品中，这种防腐剂对人体无毒副作用，比其他化学类防腐剂具有更高的安全性。ε-聚赖氨酸(epl)能作为食品防腐剂的主要原因是其具有高效、广谱的抗菌活性，尤其是l-赖氨酸残基在十个以上的ε-聚赖氨酸(epl)。其对革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌，保加利亚乳杆菌，热链球菌，微球菌等细菌，以及革兰氏阴性菌如沙门氏菌，大肠杆菌，产气节杆菌的生长繁殖都具有很强的抑制和杀灭作用。另外，其对真菌也具有抑制作用。

ε-聚赖氨酸(epl)作为一种生物相容性优异的亲水性高分子，由于不能在溶液中自组装形成纳米粒子，从而抑制了其在生物医用材料方面的作用。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的不足，首要目的是提供一种两亲性类ε-聚赖氨酸交替共聚物。

本发明的第二个目的在于提供一种两亲性类ε-聚赖氨酸交替共聚物的合成。

本发明的第三个目的在于提供一种组装体的制备方法和应用。

为达到上述目的，本发明的解决方案是：

一种两亲性类ε-聚赖氨酸交替共聚物，其结构式如下：

其中，n的取值范围为0～100中的整数且为偶数，n表示嵌段的聚合度，r表示二异氰酸酯；

当n的取值为0时，结构式如下：

所述二异氰酸酯为六亚甲基二异氰酸酯(hdi)、五亚甲基二异氰酸酯(pdi)、甲苯二异氰酸酯(tdi)、二苯基甲烷二异氰酸酯(mdi)、苯二亚甲基二异氰酸酯(xdi)、萘二异氰酸酯(ndi)中的一种。

一种上述的两亲性类epl交替共聚物的制备方法，其包括如下步骤：

(1)、将0.01～0.20mol单体α-z-l-赖氨酸与0.01～0.20mol氢氧化钠加入20～800ml去离子水中，常温常压下反应，反应时间为1～5h，之后于-50℃～-20℃温度下冷冻干燥12～24h，得到α-z-l-赖氨酸钠单体：

(2)、将0.01～0.20mol步骤(1)所得的α-z-l-赖氨酸钠单体与0.005～0.10mol二异氰酸酯于20～500ml有机溶剂中，常温常压下反应12～48h，并在沉淀剂作用下沉淀，得到：

其中，r表示二异氰酸酯。

(3)、将0.01～0.20mol步骤(2)中所得产物，与0～1.00mol二异氰酸酯于50～200ml有机溶剂中常温常压下反应1～5h，反应结束后，继续升温至50～70℃，使整个反应体系加热2～8h，发生回流反应以释放反应过程中产生的co2，将反应完成所得产物洗涤、蒸干即得到：

其中，n的取值范围为0～100中的整数且为偶数，n表示嵌段的聚合度，r表示二异氰酸酯；

当二异氰酸酯为0mol时，n的取值为0，表示步骤(2)所得产物不进行步骤(3)的反应而直接进入步骤(4-2)。

(4-1)、将0.01～0.20mol步骤(3)中所得产物与10～50ml脱保护剂在常温常压下反应2～6h。反应完成后洗涤、透析、蒸干即得到：

其中，n的取值范围为0～100中的整数且为偶数，n表示嵌段的聚合度，r为二异氰酸酯；

(4-2)、当n取值为0时，将0.01～0.20mol步骤(2)中所得产物与10～50ml脱保护剂反应，反应时间在2～6h是可以的，反应温度在20～40℃是可以的。反应完成后洗涤、透析、蒸干即得到：

优选地，步骤(2)中产物的合成包括如下步骤：

(a)、将0.01～0.20mol步骤(1)所得的α-z-l-赖氨酸钠单体溶于20～500ml有机溶剂中，充分溶解后加入0.005～0.10mol二异氰酸酯，在常温常压下，搅拌反应12～48h，反应完成后，在真空环境下除去有机溶剂。

(b)、将步骤(a)所得产物溶解于10ml～500ml去离子水中至得到浅黄色澄清溶液，逐滴滴加沉淀剂调节ph值至3.5，在酸化过程中不断析出白色固体。

(c)、将步骤(b)所得白色固体洗涤，干燥，得到所述步骤(2)中产物。

优选地，二异氰酸酯为六亚甲基二异氰酸酯(hdi)、五亚甲基二异氰酸酯(pdi)、甲苯二异氰酸酯(tdi)、二苯基甲烷二异氰酸酯(mdi)、苯二亚甲基二异氰酸酯(xdi)、萘二异氰酸酯(ndi)一种。

优选地，有机溶剂为无水n,n-二甲基甲酰胺(dmf)、二甲基亚砜(dmso)中的一种以上；

优选地，沉淀剂为稀盐酸、稀硫酸、醋酸、三氟乙酸中的一种以上；

优选的，脱保护剂为含溴化氢的冰醋酸溶液，三氟乙酸中的一种；所述含溴化氢的冰醋酸溶液中溴化氢所占质量分数为33％-35％；

优选地，步骤(1)中，反应时间为2h，反应温度常温下即可，通常在20～40℃之间均可；

优选地，步骤(2)中，反应时间为12h，反应温度常温下即可，通常在20～40℃之间均可；

优选地，步骤(3)中，反应时间为2h，反应温度常温下即可，通常在20～40℃之间均可；继续升温至60℃，整个反应体系时间加热3h，使整个反应体系发生回流反应；

优选地，步骤(4)中，反应时间为4h，反应温度常温即可，通常在20～40℃之间均可。

一种组装体，其由如上述的两亲性类ε-聚赖氨酸交替共聚物自组装形成。

一种上述组装体的制备方法，其包括如下步骤：

将0.2mg-10mg两亲性类ε-聚赖氨酸交替共聚物：

溶于2.0～5.0ml去离子水中，快速搅拌，即得到组装体。

其中，搅拌速度为500～1500r/min，优选为1000r/min；搅拌时间为12～24h，优选为12h。

一种上述的组装体在药物的封装、运输、靶向释放、合成纳米粒子及化学微反应器等方面的应用。

由于采用上述方案，本发明的有益效果是：

第一、本发明制备的两亲性类ε-聚赖氨酸交替共聚物具有良好的的抗菌性和优异的生物相容性，且极易自组装形成组装体，形成纳米囊泡，在生物医用方面有很大的应用前景。

第二、本发明的原料便宜易得，成本低廉；本发明的合成路线简单，条件可控。

第三、本发明制备的两亲性类ε-聚赖氨酸交替共聚物是一种经济、低毒和稳定的生物材料，具有广泛的应用前景及价值。

附图说明

图1a为本发明实施例1所得共聚物组装体在分辨率为1时的tem图。

图1b为本发明实施例1所得共聚物组装体在分辨率为0.5时的tem图。

图2a为本发明中实施例1所得共聚物在大肠杆菌中的抗菌性，横坐标为时间(time)，纵坐标为600nm时的od值(即odat600nm)。

图2b为本发明中实施例1所得共聚物在金黄色葡萄球菌中的抗菌性，横坐标为时间(time)，纵坐标为600nm时的od值(即odat600nm)。

图3为本发明所述实施例1两亲性类ε-聚赖氨酸交替共聚物组装体的细胞毒性图。

具体实施方式

本发明提供了一种两亲性类ε-聚赖氨酸交替共聚物及其合成、该共聚物的组装体及其制备方法和应用。

<两亲性类ε-聚赖氨酸交替共聚物>

一种两亲性类ε-聚赖氨酸交替共聚物，其结构式如下：

其中，n的取值范围为0～100中的整数且为偶数，n表示嵌段的聚合度，r表示二异氰酸酯；

当n的取值为0时，结构式如下：

<两亲性类ε-聚赖氨酸交替共聚物的制备方法>

一种上述的两亲性类ε-聚赖氨酸交替共聚物的制备方法，其包括如下步骤：

(1)、将0.01～0.20mol单体α-z-l-赖氨酸与0.01～0.20mol氢氧化钠加入20～800ml去离子水中，反应时间为1～5h是可以的，反应温度在20～40℃是可以的，之后于-50℃～-20℃温度下冷冻干燥，冷冻干燥时间为12～24h是可以的，得到α-z-l-赖氨酸钠单体：

(2)将0.01～0.20mol步骤(1)所得的α-z-l-赖氨酸钠单体与0.005～0.10mol二异氰酸酯于20～500ml有机溶剂中反应，反应时间为12～48h是可以的，并在沉淀剂作用下沉淀，得到：

其中，r表示二异氰酸酯。

(3)、将0.01～0.20mol步骤(2)中所得产物，与0～1.00mol二异氰酸酯于50～200ml有机溶剂中反应，反应时间在1～5h是可以的，反应温度在20～40℃是可以的，反应结束后，继续升温至50～70℃，使整个反应体系加热2～8h，发生回流反应以释放反应过程中产生的co2，将反应完成所得产物洗涤、蒸干即得到：

其中，n的取值范围为0～100中的整数且为偶数，n表示嵌段的聚合度，r表示二异氰酸酯；

本步骤中当二异氰酸酯为0mol时，n的取值为0，表示步骤(2)所得产物不进行步骤(3)的反应而直接进入步骤(4-2)。

(4-1)、将0.01～0.20mol步骤(3)中所得产物与10～50ml脱保护剂反应，反应时间在2～6h是可以的，反应温度在20～40℃是可以的。反应完成后洗涤、透析、蒸干即得到：

其中，n的取值范围为0～100中的整数且为偶数，n表示嵌段的聚合度，r为二异氰酸酯；当n的取值为0时的步骤见(4-2)；

(4-2)、当n取值为0时，将0.01～0.20mol步骤(2)中所得产物与10～50ml脱保护剂反应，反应时间在2～6h是可以的，反应温度在20～40℃是可以的。反应完成后洗涤、透析、蒸干即得到：

优选地，所述步骤(2)中产物的合成包括如下步骤：

(a)、将0.01～0.20mol步骤(1)所得的α-z-l-赖氨酸钠单体溶于20～500ml有机溶剂中，充分溶解后加入0.005～0.10mol二异氰酸酯，在20～40℃下，搅拌反应12～48h。反应完成后，在真空环境下除去有机溶剂。

(b)、将(a)所得产物溶解于10ml～500ml去离子水中，得到黄色澄清溶液，逐滴滴加酸性沉淀剂调节ph值至3.5，在酸化过程中不断析出白色固体。

(c)、将所述白色固体洗涤，干燥，得到所述(2)中产物。

其中，二异氰酸酯为六亚甲基二异氰酸酯(hdi)、五亚甲基二异氰酸酯(pdi)、甲苯二异氰酸酯(tdi)、二苯基甲烷二异氰酸酯(mdi)、苯二亚甲基二异氰酸酯(xdi)、萘二异氰酸酯(ndi)一种。

有机溶剂为n,n-二甲基甲酰胺(dmf)、二甲基亚砜(dmso)中的一种以上；

沉淀剂为稀盐酸、稀硫酸、醋酸、三氟乙酸中的一种以上；

脱保护剂为含溴化氢的冰醋酸溶液(溴化氢质量分数为33％～35％)，三氟乙酸中的一种；

步骤(1)中，反应时间为可以为1～5h，优选为2h，反应温度反应温度常温即可，通常在20～40℃之间均可；

步骤(2)中，反应时间为可以为12～48h，优选为12h，反应温度反应温度常温即可，通常在20～40℃之间均可；

步骤(3)中，反应时间为可以1～5h，优选为2h，反应温度常温即可，通常在20～40℃之间均可；继续加热至60～70℃，继续加热反应体系时间为2～8h，使体系发生回流反应以释放反应过程中产生的co2；

步骤(4)中，反应时间可以为2～6h，优选为4h，反应温度常温即可，通常在20～40℃之间均可。

<组装体>

一种组装体，其由上述的两亲性类ε-聚赖氨酸交替共聚物自组装形成。

自组装是指基本结构单元基于非共价键相互作用，如氢键、疏水作用、范德华力和π-π键堆积等，自发形成的稳定或亚稳定而具有一定规则几何结构的过程。

本发明中将亲水性的α-z-l-赖氨酸与疏水性的二异氰酸酯交替共聚，得到的两亲性类ε-聚赖氨酸交替共聚物，具有良好的抗菌性以及优异的生物相容性，且在水溶液环境下能很好的自组装形成纳米囊泡。

<组装体的制备方法>

一种上述的组装体的制备方法，其包括如下步骤：

将0.2mg～10mg两亲性类ε-聚赖氨酸共聚物：

溶于2.0-5.0ml去离子水中，快速搅拌数小时，得到组装体。。

其中，搅拌速度为500-1500r/min，优选为1000r/min，搅拌时间为12-24h，优选为12h。

<组装体的应用>

一种上述的组装体可以应用在药物的封装、运输、靶向释放、合成纳米粒子和化学微反应器等方面。

以下结合附图所示实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1：第一步：两亲性类ε-聚赖氨酸交替共聚物的制备方法

本实施例的两亲性类ε-聚赖氨酸交替共聚物的制备方法，其包括如下步骤：

(1)、将20.000g(71.429mmol)α-z-l-赖氨酸单体溶于500ml去离子水中，加入2.857g(71.425mmol)的氢氧化钠进行溶解中和，室温下反应2小时后，在-30℃温度下冷冻干燥12h，得到α-z-l-赖氨酸钠单体；

(2)、将15.000g(49.669mmol)步骤(1)所得的α-z-l-赖氨酸钠单体溶于150ml无水n,n-二甲基甲酰胺，加入4.177g(24.835mmol)hdi(六亚甲基二异氰酸酯)，于室温下搅拌反应12h。反应完成后于真空环境下除掉溶剂，加入300ml去离子水进行溶解，得到澄清浅黄色溶液，逐滴缓慢滴加稀盐酸调节ph值至3.5，滴加过程中逐渐有白色固体析出。随后将白色固体用大量去离子水洗涤三次，蒸干得到：

(3)、将10.000g(14.451mmol)步骤(2)中所得产物溶于100ml无水n,n-二甲基甲酰胺中，一次性迅速加入2.124g(13.735mmol)hdi混合均匀，室温下搅拌反应2h，反应完毕后继续升温，在60℃下回流反应4h，使反应过程产生的co2得以释放保证聚合成功。聚合完成后，将溶剂蒸干，用大量去离子水多次洗涤，蒸干后得到：

(4)、向5g(0.367mmol)步骤(3)所得产物中加入25ml含溴化氢的冰醋酸溶液(溴化氢含量为33％)进行脱保护，反应时间约4小时。然后用丙酮反复洗涤5次，放入分子量为3500的透析袋进行透析，蒸干后得到：

第二步：自组装形成两亲性类ε-聚赖氨酸交替共聚物囊泡组装体

本实施例的共聚物囊泡组装体的制备方法，其包括如下步骤：

将4.0mg(0.608mmol)上述步骤所得的两亲性类ε-聚赖氨酸交替共聚物溶于2.000ml去离子水中，在1000r/min转速下搅拌12h，即可得到本实施例两亲性类epl交替共聚物囊泡组装体。

实施例2：

第一步：两亲性类ε-聚赖氨酸交替共聚物的制备方法

本实施例的两亲性类ε-聚赖氨酸交替共聚物的制备方法，其包括如下步骤：

(1)、将20.000g(71.429mmol)α-z-l-赖氨酸单体溶于500ml去离子水中，加入2.857g(71.425mmol)的氢氧化钠进行溶解中和，室温下反应2小时后，在-30℃温度下冷冻干燥12h，得到α-z-l-赖氨酸钠单体；

(2)、将15.000g(49.669mmol)步骤(1)所得的α-z-l-赖氨酸钠单体溶于150ml无水n,n-二甲基甲酰胺，加入6.209g(24.835mmol)mdi(二苯甲烷二异氰酸酯)，于室温下搅拌反应12h。反应完成后于真空环境下除掉溶剂，加入300ml去离子水进行溶解，得到澄清亮黄色溶液，逐滴缓慢滴加稀盐酸调节ph值至3.5，滴加过程中逐渐有白色固体析出。随后将白色固体用大量去离子水洗涤三次，蒸干得到：

(3)、将11.185g(14.451mmol)步骤(2)中所得产物溶于100ml无水n,n-二甲基甲酰胺中，一次性迅速加入3.161g(12.644mmol)mdi混合均匀，室温下搅拌反应2h。反应完毕后继续升温，在60℃下回流反应4h，使反应过程产生的co2得以释放保证聚合成功。聚合完成后，将溶剂蒸干，用大量去离子水多次洗涤，蒸干后得到：

(4)、向5g(0.337mmol)步骤(3)产物加入25ml溴化氢的乙酸溶液(溴化氢质量分数为33％)进行脱保护，反应时间约4小时。然后用丙酮反复洗涤5次，放入分子量为3500的透析袋进行透析，蒸干后得到：

第二步：自组装形成两亲性类ε-聚赖氨酸交替共聚物囊泡组装体

本实施例的共聚物囊泡组装体的制备方法，其包括如下步骤：

将4.0mg(0.512mmol)上述步骤所得的两亲性类ε-聚赖氨酸交替共聚物溶于2.000ml去离子水中，在1000r/min转速下搅拌12h，即可得到本实施例两亲性类ε-聚赖氨酸交替共聚物囊泡组装体。

<实验>

以上述实施例的两亲性类ε-聚赖氨酸交替共聚物和组装体为产品进行如下实验。

<实验1>

图1a和图1b分别为实施例1所得两亲性类ε-聚赖氨酸交替共聚物组装体分别在分辨率为1μm时和分辨率为0.5时的tem图，由图1a的tem图可见，实施例1所得两亲性类epl交替共聚物在水中能组装成纳米囊泡；放大倍数后，如图2a所示，可更清晰地看到此囊泡的形貌。

<实验2>

本实验是为了验证实施例1所得两亲性类ε-聚赖氨酸交替共聚物在革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)和革兰氏阴性菌(大肠杆菌)中的抗菌性能。

最小抑菌浓度(mic)是评估抗菌剂抗菌性能的重要参数。本实验分别使用革兰氏阴性菌(大肠杆菌)和革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)来测定两亲性类ε-聚赖氨酸交替共聚物的抗菌性能。实验步骤如下：

(1)在培养皿中加入10ml的lb骨肉汤；

(2)在96孔板第一行的每格均加入100μl的lb骨肉汤。接着在第一格中加入100μl浓度为5mg/ml的实施例1所得的两亲性类epl交替共聚物水溶液，充分混合，取100μl该混合液加入到96孔板第一行第二格中，混合均匀，然后再取100μl该混合液到该行第三格，以此类推；

(3)将10μl已活化好的细菌加入到步骤(1)中的10ml的lb骨肉汤中，然后从中各取100μl加入步骤(2)中的每一个混合液的格子里。

加入100μl细菌液后(金黄色葡萄球菌或大肠杆菌)，96孔板的混合液中实施例1所得两亲性类epl交替共聚物浓度分别为250μg/ml、125μg/ml、62.5μg/ml、31μg/ml、16μg/ml，放入37℃恒温箱中恒温培养，每隔2小时用紫外分光光度计测定其在600nm处的光密度，图2a和图2b中纵坐标的od值指的是光密度(opticaldensity)，表示被检测物吸收掉的光密度，即吸光度。od值越大，液体中所含物质含量越高，不同物质有其特定的光吸收波长，其测试结果如图2a及图2b所示，图2a及图2b分别代表了两亲性类epl交替共聚物分别作用于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌后的结果，即抗菌性，反映了不同情况下细菌的生长率，od值越大，说明细菌的生长率越大，由图2a及图2b图可知，两亲性类epl交替共聚物囊泡具有良好的抗菌性，并且在第12小时，两亲性类epl交替共聚物浓度为120μg/ml时，两种细菌的生长逐渐趋于稳定，该抗菌剂对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的最低抑菌浓度mic值均为120μg/ml。

<实验3>

本实验的目的在于研究两亲性类ε-聚赖氨酸交替共聚物组装体对l02细胞的毒性。

本实验通过cck-8试剂盒来测定实施例1所得两亲性类ε-聚赖氨酸交替共聚物组装体对于l02(正常人体肝细胞)的毒性。研究人员使用96孔铺板，每孔加入100μl细胞悬液(4000个)和培养基在37℃、5％的相对湿度的培养箱中一起培养24h，培养箱中充满co2；然后在各个孔的细胞悬液中分别加入50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、600μg/ml、800μg/ml和1000μg/ml的两亲性类epl交替共聚物组装体溶液再继续培养24h，48h及72h。使用未与两亲性类ε-聚赖氨酸交替共聚物组装体溶液处理的细胞作为空白对照组。实验组和对照组培养完成之后，在每一个小孔内均加入cck-8染色剂，在37℃下培养1h。研究人员通过酶标仪，使用双波长法测量实验组和对照组的样品在450nm和630nm处的吸光度。实验组和对照组的每个样品重复测量四次，根据正常肝细胞存活量与对照组肝细胞总量的比值计算得到细胞存活率，测试结果如图3所示，其中，横坐标表示囊泡浓度(vesicleconcentration)，纵坐标表示细胞存活率(relativecellviability)。

从图3得知，随着两亲性类epl交替共聚物组装体的浓度逐渐增加，从50μg/ml增加至1000μg/ml，细胞存活率均为100％以上，因此可以判断，本发明中的两亲性类epl交替共聚物对细胞基本是无毒副作用的即：该聚合物具有优异的生物相容性。

上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。