抗氧化聚茶多酚纳米材料的制备方法和应用与流程

技术领域：

本发明属于生物基功能纳米材料的制备领域，具体而言是一种以绿茶提取物为基本原料，不添加外源助剂而得到一系列形貌、大小可控的抗氧化聚茶多酚纳米材料。

背景技术：
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生物基材料(bio-basedmaterials)指的是利用谷物、秸秆等可再生生物质为原料的高分子材料。当今社会能源逐渐紧缺，生物基材料由于来源广泛、可再生、环境友好和节约能源等优点，正逐步吸引人们的注意力，有望成为引领当代科技创新和经济发展的一大产业。生物基材料可大致分为两大类，其一是可再生原料通过生物转化直接得到的生物高分子材料；其二则是源于自然的单体经人工聚合形成的材料。后者于前者相比，其优势在于能实现更加精细的分子和结构上的设计。

茶是中国传统饮品之一，在中国的茶文化里，饮茶有振奋精神、延年益寿的功效，当代的科学也证明了这一点。茶叶中能延缓衰老的成分主要是茶多酚(teapolyphenols，简称tp)，茶多酚是茶叶中一系列多酚化合物的总称，主要成分为儿茶素，包括表儿茶素(ec)、表没食子儿茶素(egc)、表儿茶素没食子酸酯(ecg)和表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)四种。相关研究表明，茶多酚以及茶多酚富集的产品在预防肿瘤(annualreviewofpharmacologyandtoxicology,2002；42:25-54)、心血管疾病(circulation,2004；109:2448-2453)、癌症(molecules2007,12,946)等方面有着显著作用。同时儿茶素具有良好的抗氧化能力和金属离子螯合能力，故而茶多酚被视为具有开发潜力的生物基单体。与此同时，纳米材料由于其微观特性，在能源、保健和环境领域有着广阔的应用空间。综合以上两点，以茶多酚为单体构建功能化聚合物纳米材料这一课题值得深入研究。

目前，一些合成茶多酚纳米材料的方法已被报道，然而这些方法均无法避免反应过程中外源添加剂的加入。例如，xudongli等用cu²⁺诱导tp的氧化偶联，得到了中空多孔的茶多酚纳米粒子，可用于药物运输及响应释放(journaloftheamericanchemicalsociety,2013；135:4179-4182)；fei的团队在微波辐射下，以ag⁺作为氧化剂，tp为单体，用一锅法合成了带有荧光的tp-ag核壳复合纳米材料(acsnano2014,8,8529)；markova等通过tp和fe³⁺合成了tp-fe纳米混合物，并探究了fe³⁺在此过程中的作用(acssustainablechemistry&engineering,2014,2(7):1674-1680)。

可见，在目前被报道的工作中，研究人员普遍使用金属离子作为添加剂；金属离子如cu²⁺、ag⁺、fe³⁺等能有效诱导茶多酚氧化交联从而得到形态规整的纳米复合物，但与此同时，外源金属离子的加入也对纳米复合物的毒性和生物相容性产生了一定的影响；外源添加剂的加入一定程度上增加了产物的毒性，影响了材料在生物医学领域的应用，因此，更加安全无毒，符合绿色化学理念的功能化多酚纳米粒子的合成方法仍待研究。

技术实现要素：
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针对上述缺陷，本发明提供一种不使用外源添加剂的纯有机茶多酚纳米粒子及其制备方法，并可以通过调整配方来调节产物粒子的大小，实验得到的粒子粒径在100～300nm范围内；且本发明所得茶多酚纳米粒子在自由基清除方面表现优异，有望作为绿色抗氧药物和安全无毒的食品添加剂广泛使用。

本发明的技术方案：

本发明要解决的第一个技术问题是提供一种抗氧化聚茶多酚纳米材料，所述抗氧化聚茶多酚纳米材料以茶多酚和茶碱为原料制备而成，各原料的质量比为：茶多酚2重量份，茶碱0.5～2重量份。

进一步，所述抗氧化聚茶多酚纳米材料采用下述制备方法：茶多酚水溶液与茶碱水溶液在空气氛围中于75～85℃(优选为80℃)搅拌反应直至得到棕色透明的混合溶液，停止反应；再将所得混合溶液冷却至室温，然后静置至混合溶液呈浑浊状且肉眼可见棕黄色沉淀；最后经离心处理、洗涤得到抗氧化聚茶多酚纳米材料。

进一步，所述抗氧化聚茶多酚纳米材料的粒径在100～300nm。

进一步，所述抗氧化聚茶多酚纳米材料的粒径通过下述方式调控：

控制茶多酚与茶碱的质量比为1.1～1.5时，所述抗氧化聚茶多酚纳米材料的粒径为132～175nm；控制茶多酚与茶碱的质量比为1.8～2.5时，所述抗氧化聚茶多酚纳米材料的粒径为173～240nm；控制茶多酚与茶碱的质量比为4时，所述抗氧化聚茶多酚纳米材料的粒径为109～125nm。

本发明要解决的第二技术问题是提供一种抗氧化聚茶多酚纳米材料的制备方法，所述方法为：茶多酚水溶液与茶碱水溶液在空气氛围中于75～85℃(优选为80℃)搅拌反应直至得到棕色透明的混合溶液，停止反应；再将所得混合溶液冷却至室温，然后静置至混合溶液呈浑浊状且肉眼可见棕黄色沉淀；最后经离心处理、洗涤得到抗氧化聚茶多酚纳米材料；其中，混合溶液中茶多酚与茶碱的质量比为：茶多酚2重量份，茶碱0.5～2重量份。

进一步，上述方法中，所述茶多酚水溶液的质量浓度为5～10mg/ml，所述茶碱水溶液的质量浓度为0.5～2mg/ml。

进一步，上述方法中，反应前茶多酚水溶液和茶碱水溶液分别经过超声处理2～5分钟，确保茶多酚和茶碱完全溶解。

进一步，上述方法中，茶多酚水溶液与茶碱水溶液在空气氛围中于搅拌反应24～36小时(优选为30小时)得到棕色透明的混合溶液。

进一步，茶多酚水溶液与茶碱水溶液反应前先分别在75～85℃下预热10～15min。

进一步，上述方法中，离心处理中，离心速率为12000～16000r/min(优选为15000r/min)，离心时间为5～12分钟(优选为10分钟)。

进一步，上述方法中，冷却至室温静置24～72(优选为48小时)小时。

进一步，上述方法中，采用蒸馏水洗涤至少三次。

本发明要解决的第三个技术问题是提供上述抗氧化聚茶多酚纳米材料在氧化剂中的用途。

本发明的有益效果为：

1、本发明合成方法原料均属于茶叶提取物，来源广泛、可再生，合成时以去离子水为分散剂，反应过程中亦不再添加其他试剂，保证了产物粒子的毒性更低，绿色环保，安全可靠，在食品安全、生物医药领域有更广泛的应用。

2、本发明所得的茶多酚纳米粒子为纯有机质，反应原料均来自于茶叶，无外源添加剂即可得到形状规整、大小可控、大小均一且分布均匀的抗氧化聚茶多酚纳米粒子。

3、本发明方法制备的抗氧化聚茶多酚纳米粒子在自由基清除能力上远超同等粒径的聚多巴胺纳米粒子，是一种良好的抗氧化试剂。

4、本发明方法配方简单，成本较低，工艺流程短，简便易行，合成过程无污染，属于符合绿色化学理念的制备方案。

附图说明：

图1a为tp浓度2mg/ml，不添加茶碱时，在80℃下反应30h所得产物sem图；图1b-f为本发明实施例1-5采用不同配方所得产物的sem图，其中，反应初始tp浓度均为2mg/ml：图1(b)茶碱浓度0.5mg/ml，所得抗氧化聚茶多酚纳米材料记为pn-1，粒径117±8nm；图1(c)茶碱浓度0.8mg/ml，所得抗氧化聚茶多酚纳米材料记为pn-2，粒径191±18nm；图1(d)茶碱浓度1.1mg/ml，所得抗氧化聚茶多酚纳米材料记为pn-3，粒径213±27nm；图1(e)茶碱浓度1.4mg/ml，所得抗氧化聚茶多酚纳米材料记为pn-4，粒径152±23nm；图1(f)茶碱浓度1.7mg/ml，所得抗氧化聚茶多酚纳米材料记为pn-5，粒径149±17nm。

图2为对比例1所得聚多巴胺纳米粒子sem图，图2(a)：粒径196±13nm的pda-1,；图2(b)：粒径146±19nm的pda-2。

图3为对实施例1所得抗氧化聚茶多酚纳米粒子进行epr检测所得到的谱图。

图4为对实施例2-5所得抗氧化聚茶多酚纳米粒子和对比例1所得粒径相近的聚多巴胺纳米粒子进行自由基清除实验所得曲线图。

具体实施方式：

本发明中，茶多酚的邻苯二酚结构在空气中即可自发氧化形成醌结构，被氧化后的茶多酚能与未被氧化的茶多酚反应生成二聚物，该二聚物的邻苯二酚结构再次被氧化，重复上述过程，从而实现茶多酚小分子的聚合；然而，具体实验发现，在仅仅使用茶多酚为唯一单体的情况下，无法得到外观形态规整的聚合物(如图1a)，原因在于茶多酚自发氧化反应时交联位点不够，不足以形成三维交联结构。因此，寻找一种合适的试剂促进tp交联是有必要的。本发明首次选择茶碱作为添加剂来促进茶多酚的氧化交联。

本发明进一步探索到可选取如下反应条件：反应温度为80℃，分散相为水相，在空气下进行氧化；高温下反应30h后，将反应原液冷却到室温，静置48h后进行离心，离心时转速15000r/min，时间10min；用扫描电镜(sem)观察离心所得产物，为尺寸较均一，分布均匀的纳米小球；对离心所得的褐色沉淀进行冷冻干燥，最终得到黄褐色粉末。

下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。

本发明的实施例中，新鲜绿茶多酚(tp)粉(茶多酚wt％≥95％，即茶多酚的纯度≥95％)购自无锡太阳绿色电力有限公司(中国江苏)。茶碱购自sigma-aldrich，纯度≥98％。

实施例1-5抗氧化聚茶多酚纳米粒子(pn-i,i＝1-5)的制备

原料：茶多酚、茶碱，各原料用量配比关系如表1所示。

制备方法：具体制备步骤如下：

(1)原料准备：按照表1称量相应质量的tp粉和茶碱粉末，溶于去离子水中分别配制成tp水溶液和茶碱水溶液，并采用超声处理的方法超声处理2～5分钟确保茶多酚和茶碱充分溶解；然后放入油浴锅(80℃)中预热；

(2)反应过程：将预热好的茶碱溶液与tp溶液混合，确保反应体系存在空气的参与，反应温度80℃；可以观察到，溶液在开始时呈浅粉色，搅拌约5小时后，溶液变黄；随着反应时间的延长，颜色逐渐加深，30小时后获得棕色透明溶液；

(3)后期处理：将反应后的溶液冷却至室温，并在室温下储存48小时，溶液在此过程中逐渐变得混浊；对其进行离心(15000r/min，10分钟)，可得到棕黄色粉末，用蒸馏水洗涤三次得到样品粒子pn-i(i＝1-5)。

粒子表征：

将实施例1-5所得样品粒子pn-i(i＝1-5)进行扫描电镜(sem)测试，观察粒子形貌并统计粒径；并对tp浓度2mg/ml，不添加茶碱时，在80℃下反应30h所得产物进行sem测试；结果如图1和表1所示。同时用动态光散射粒度仪(dls)检测纳米粒子的大小，结果也表明不同配方所得的粒子直径也存在明显的差异，规律与sem结果相同。另外，还测量了实施例所得各组纳米粒子的zeta电位，分散相为去离子水，所得数值均在-30mv以下，证明本发明实施例所得pns(各实施例所得合成茶多酚纳米材料)表面为天然负电位，能在水中稳定分散。

表1pn-i(i＝1-5)对应的配方和表征结果

表1中，mg/ml为原料占总反应体系的浓度；如茶多酚mg/ml是指1ml混合溶液(茶多酚溶液和茶碱溶液形成的混合溶液)中茶多酚的浓度初始ph值为将原料混合后，反应起始点的ph值。

抗氧化聚茶多酚纳米粒子的抗氧化活性检测：

电子顺磁共振(epr)方法被广泛应用于天然产物的抗氧化活性研究中，通过对实验产物粒子epr的测定和自由基清除实验来检测茶多酚纳米粒子(pns)的抗氧化活性。

epr的测定方式如下：brukerepremx_plus上进行抗氧化聚茶多酚纳米粒子粉末的epr(电子顺磁共振)测试；波谱仪在x-band(9.85ghz)下运行，并且在0.1mw功率下以100khz场调制获得光谱；抗氧化聚茶多酚纳米粒子pn-1(实施例1)的epr图如图3所示，pns的epr谱图与文献中报道的具有自由基清除能力的聚多巴胺纳米粒子epr谱图类似。由图3可知：所得的抗氧化聚茶多酚纳米粒子成分中有自由基的存在，可进一步探究其自由基清除能力。

自由基清除实验操作方式如下：结合抗氧化聚茶多酚纳米粒子(pns)的水溶性，使用纯度为97.0％(lc)的2,2-二苯基-1-苦肼基(dpph)测定来评估不同粒子的自由基清除活性，一般程序如下所述：现配的浓度为0.1mm的dpph/乙醇溶液，将100μg的抗氧化聚茶多酚纳米粒子粉末加入到dpph溶液中，反应体系中dpph的初始浓度为0.1mm，总体积为10ml，通过测量反应体系随着时间推进在517nm处的吸光度变化来评估清除活性，一般地，每五分钟取一个样品点进行测试，直到吸光度不变。

对比例1

为了证明pns在自由基清除上的优势，制备粒径相仿的聚多巴胺纳米粒子进行比较。聚多巴胺纳米粒子的制备：称量一定量的多巴胺盐酸盐固体，置于一定体积比的乙醇水溶液中溶解，待固体完全溶解后加入少量的氨水调节ph值，反应12小时后对反应液进行离心处理，得黑色沉淀物，用去离子水反复洗涤；合成方法根据文献(k.-y.ju,etal.biomacromolecules,2011；12:625-632)中的方法，制备得到了不同原料比的聚多巴胺纳米粒子pda-1、pda-2；对比例1所得聚多巴胺纳米粒子sem图如图2所示；图2表明制得的聚多巴胺纳米粒子pda-1、pda-2的粒径分别同本发明实施例所得pn-3(pn-2)、pn-5(pn-4)粒径相近。并对所得聚多巴胺纳米粒子进行了自由基清除实验，自由基清除实验操作方法同上。本发明实施例2-5所得抗氧化聚茶多酚纳米粒子和聚多巴胺纳米粒子的自由基清除曲线如图4所示。

结果表明，本发明在其他反应条件不变的前提下，通过调整配方中茶多酚与茶碱的质量比，一组不同粒径的抗氧化聚茶多酚纳米粒子可被制取。经过对扫描电镜图(sem)的统计和动态光散射粒度仪(dls)的验证，试验中不同配方所得的粒子直径存在明显的差异。进一步地，实验所得各组纳米粒子的zeta电位哦数值均在-30mv以下，证明了该方法得到的茶多酚纳米粒子自然呈表面负电，无需表面修饰即可在水中稳定分散。