一种抗人巨细胞病毒卵黄抗体及其制备方法和应用与流程

本发明涉及人巨细胞病毒领域，且特别是涉及一种抗人巨细胞病毒卵黄抗体及其制备方法和应用。

背景技术：

大量流行病学调查结果表明人巨细胞病毒(humancytomeglovirus，hcmv)在育龄妇女生殖道的隐性感染率超过90％。当妇女怀孕时，潜伏体内的hcmv被激活、繁殖而导致胎儿的宫内感染，结果会导致死胎(流产)、畸胎和新生儿出生缺陷。孕妇宫内感染的hcmv还可传给新生儿并潜伏在其泌尿生殖系统，病毒对这些出生就已经携带hcmv的新生儿肾脏持续的损害可能是其成年后发生原发性肾功衰竭的原因之一。另外妇女生殖道的乳头瘤病毒hpv长期潜伏感染是导致妇女子宫颈癌等生殖系统癌肿发生的元凶，大量研究表明hpv合并cmv感染后，其致癌风险将增加900倍以上。现在临床上广泛使用的、以“更昔洛韦”为代表的抗hcmv药物，其抗病毒机理是通过抑制dna的复制来完成的。但由于在抑制病毒dna复制的同时也抑制了正常人体细胞的dna复制，因而其具有抑制人体生长发育的严重副作用，被禁止用于孕妇和少年儿童。综上可见，hcmv在育龄妇女生殖道的潜伏感染是目前医学界尚未能解决的、严峻的公共卫生问题。

因此现有技术还有待于改进和发展。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供一种抗人巨细胞病毒卵黄抗体及其制备方法和应用，旨在解决现有技术的抗hcmv药物抑制人体生长发育的严重副作用，无法用于孕妇和少年儿童的问题。

本发明解决技术问题所采用的技术方案如下：

一种抗人巨细胞病毒卵黄抗体的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、培养正常人肺胚胎成纤维细胞hel；

步骤2、将步骤1中的成纤维细胞hel用hcmv标准病毒株感染；

步骤3、获取步骤2中感染hcmv标准病毒株的成纤维细胞hel，经裂解、分离、提取和纯化后，获得优质hcmv病毒蛋白；

步骤4、将步骤3中获得的优质hcmv病毒蛋白制备免疫针剂；

步骤5、利用步骤4制备的免疫针剂对母鸡进行免疫注射；

步骤6、收集步骤5中已经免疫注射后的母鸡生产的鸡蛋；

步骤7、将步骤6收集的鸡蛋去蛋白留蛋黄，分离提纯获得抗hcmv卵黄抗体。

所述的抗人巨细胞病毒卵黄抗体的制备方法，其中，所述步骤5中的母鸡选用50-100天龄的母鸡。

所述的抗人巨细胞病毒卵黄抗体的制备方法，其中，所述步骤6中，收集已经注射免疫针剂120天-180天龄的母鸡生产的鸡蛋。

一种抗人巨细胞病毒卵黄抗体，通过如上所述的抗人巨细胞病毒卵黄抗体的制备方法得到。

一种抗人巨细胞病毒卵黄抗体的用途，所述抗人巨细胞病毒卵黄抗体在制备女性生殖道健康护理凝胶的应用。

一种含有所述的抗人巨细胞病毒卵黄抗体的女性生殖道健康护理凝胶，其组分包括抗hcmv天然提取物、小分子团水、抗hcmv卵黄抗体、保湿剂、皮肤调理剂、增稠剂、ph调节剂以及清凉剂。

所述的女性生殖道健康护理凝胶，按照各个组分在该女性生殖道健康护理凝胶中的质量百分含量计，包括：

抗hcmv天然提取物，含量为5％～20％；

小分子团水，含量为30％～70％；

抗hcmv卵黄抗体，含量为5％～20％；

保湿剂，含量为8％～20％；

皮肤调理剂，含量为6％～9％；

增稠剂，含量为1％～3％；

ph调节剂，含量为0.05％～0.15％；

清凉剂，含量为0.02％～0.2％。

所述的女性生殖道健康护理凝胶，其中，所述保湿剂为甘油、丙二醇或者丁二醇中的一种或者两种以上的混合物；所述皮肤调理剂为甘油聚甲基丙烯酸酯、乙醇、氢氧化铵、n-丁醇、异丙醇、苦参根提取物、鱼腥草提取物或者透明质酸中的一种或者两种以上的混合物；所述增稠剂为羟乙基纤维素或者聚丙烯酸钠接枝淀粉中的一种或者两种的混合物。

所述的女性生殖道健康护理凝胶，其中，所述抗hcmv天然提取物为田七提取物。

一种如上所述的女性生殖道健康护理凝胶的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、将抗hcmv天然提取物、抗hcmv卵黄抗体以及皮肤调理剂、清凉剂依次添加到小分子团水中，至完全溶解，混合均匀得到第一混合物；

步骤2、将保湿剂、增稠剂依次加入到步骤1中的第一混合物中，使其完全溶解，混合均匀得到第二混合物；

步骤3、将ph调节剂加入到第二混合物中，得到所述女性生殖道健康护理凝胶。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明的女性生殖道健康护理凝胶通过将抗hcmv天然提取物广谱抗病毒的特性与特殊制备的抗hcmv卵黄抗体的特异性抗hcmv特性结合起来，通过作用于病毒入侵人体细胞信号通道各水平的干预，阻止病毒的入侵或与正常细胞dna的整合，达到抑制病毒生长繁殖的作用，同时对正常人体细胞无害，从而达到高效抗hcmv作用，起到局部清洁、抑制病原体生长和抗病毒功效，从而为育龄女性及孕妇建立健康屏障，降低孕妇宫内病毒感染几率继而减低新生儿出生缺陷发病率，降低女性生殖道癌肿的发病率；且无毒，育龄女性、孕妇及婴幼儿均适用，针对性强，作用直接，效果优于传统的口服或注射给药。

附图说明

图1为人包皮成纤维细胞hffs在培养基正常生长96小时显微镜下观察到的实时图片；

图2为hcmv感染hffs后培养96小时显微镜下观察到的实时图片；

图3为hcmv感染hffs后加igy培养96小时显微镜下观察到的实时图片。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚、明确，以下结合实施例对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明提供了一种人巨细胞病毒卵黄抗体的制备方法，包括以下

步骤：

步骤1、培养正常人肺胚胎成纤维细胞hel；

步骤2、将步骤1中的成纤维细胞hel用hcmv标准病毒株感染；

步骤3、获取步骤2中感染hcmv标准病毒株的成纤维细胞hel，经裂解、分离、提取和纯化后，获得优质hcmv病毒蛋白；

其中，在步骤3中，将感染hcmv标准病毒株的成纤维细胞hel裂解、分离、提取得到hcmv蛋白粗品，其具体操作如下所示：

首先，培养的成纤维细胞hel在具盖试管内悬浮于0.15m，ph6.5-7.4的磷酸缓冲溶液中；接着，将试管反复置于“无水酒精-干冰溶液”浴锅和37℃水浴锅中，放置时间以试管中hel细胞液完全冻结和完全融化为准，如此反复冻融三次后，试管于10000rpm速度，4℃离心15分钟，弃上清液，再将沉淀用适量的0.15m，ph6.5-7.4的磷酸缓冲溶液重悬浮，即得hcmv蛋白粗提品。

步骤3中的hcmv蛋白的纯化具体操作如下所示：

首先，将hcmv蛋白粗提溶液过deae弱阴离子交换柱(交换柱预先用0.15m，ph6.5-7.4的磷酸缓冲溶液平衡)，弃流出液以除去核酸杂质，然后用含0.25mnacl的0.15m，ph6.5-7.4的磷酸缓冲溶液洗脱，最后收集280nm波长下的流出峰，即得纯化的hcmv蛋白溶液。

步骤4、将步骤3中获得的优质hcmv病毒蛋白制备免疫针剂；

步骤5、利用步骤4制备的免疫针剂对母鸡进行免疫注射；

步骤6、收集步骤5中已经免疫注射后的母鸡生产的鸡蛋；

步骤7、将步骤6收集的鸡蛋去蛋白留蛋黄，分离提纯获得抗hcmv卵黄抗体(igyagainsthcmv,简称igy)。

所述步骤7中的“分离提纯”具体操作如下所示：

首先，将收集的蛋黄加9倍灭菌蒸馏水稀释，4℃-8℃放置过夜弃沉淀，取上清液过deae弱阴离子交换柱(交换柱预先用0.15m，ph6.5-7.4的磷酸缓冲溶液平衡)，弃流出液以除去核酸杂质，然后用含0.25mnacl的0.15m，ph6.5-7.4的磷酸缓冲溶液洗脱，最后收集280nm波长下的流出峰，即得纯化的hcmv卵黄抗体。

优选的，所述步骤5中的母鸡选用50-100天龄母鸡，例如可以选用出生50天的母鸡、出生75天的母鸡、或者出生100天的母鸡。

所述步骤6中，收集已经注射免疫针剂120天-180天龄母鸡生产的鸡蛋，例如可以收集已经注射免疫针剂120天、150天龄母鸡生产的鸡蛋、或者收集已经注射免疫针剂180天龄母鸡生产的鸡蛋。

本发明的抗人巨细胞病毒卵黄抗体igy是禽类在卵发育期间受到异种抗原刺激后产生于卵黄中的特异性抗体，具有操作简便，无须处死动物，且来源安全(源于鸡蛋的卵黄抗体igy属于美国和欧盟fda认可的“传统安全食品”，无须进行安全性审查)。

本发明还提供了一种抗人巨细胞病毒卵黄抗体，通过如上所述的抗人巨细胞病毒卵黄抗体的制备方法得到。

下面对本发明所制备的抗人巨细胞病毒卵黄抗体在抗hcmv方面的功效进行实验，如下所示：

(1)抗人巨细胞病毒卵黄抗体的制备

取纯化的hcmv抗原蛋白对三月龄左右的母鸡进行免疫注射，收集该母鸡生产的所有鸡蛋，取蛋黄，经分离、提取和纯化，得到特异性抗hcmv的卵黄抗体igy。

(2)取人包皮成纤维细胞hffs在培养基中培养，将hffs培养96小时在显微镜下观察，如图1所示，人包皮成纤维细胞hffs正常生长。

(3)使用hcmv感染hffs，96小时在显微镜下观察如图2所示，由于病毒大量复制，致细胞肿胀、空斑形成，细胞基本死亡。

(3)在使用hcmv感染hffs的同时往培养基里加入抗人巨细胞病毒卵黄抗体igy(浓度为0.05mg/ml),96小时在显微镜下观察如图3所示，仍有相当数量的细胞存活。

由上述抗人巨细胞病毒卵黄抗体igy在体外细胞培养抗hcmv效果实验结果显示：本发明制备的抗人巨细胞病毒卵黄抗体具备抵抗hcmv对人包皮细胞hffs侵袭的功效。

本发明还提供了一种抗人巨细胞病毒卵黄抗体的用途，所述抗人巨细胞病毒卵黄抗体在制备女性生殖道健康护理凝胶的应用。

本发明提供了一种含有所述的抗人巨细胞病毒卵黄抗体的女性生殖道健康护理凝胶，其组分包括抗hcmv天然提取物、小分子团水、抗hcmv卵黄抗体、保湿剂、皮肤调理剂、增稠剂、ph调节剂以及清凉剂。

其中，抗hcmv天然提取物是天然的中草药提取物，其能够针对病毒粘附并侵入人体细胞信号传导途径的一些特殊靶点发挥封闭或抑制作用，其抗病毒作用具有普遍性，即对局部潜伏的hcmv、hpv及其它病毒均有一定作用。而抗hcmv卵黄抗体，则可以特异性地抵抗hcmv在作用部位的感染。

与现有技术相比，本发明的女性生殖道健康护理凝胶具有以下优点：

本发明的女性生殖道健康护理凝胶通过将抗hcmv天然提取物广谱抗病毒的特性与特殊制备的抗hcmv卵黄抗体的特异性抗hcmv特性结合起来，通过作用于病毒入侵人体细胞信号通道各水平的干预，阻止病毒的入侵或与正常细胞dna的整合，达到抑制病毒生长繁殖的作用，同时对正常人体细胞无害，从而达到高效抗hcmv作用，起到局部清洁、抑制病原体生长和抗病毒功效，从而为育龄女性及孕妇建立健康屏障，降低孕妇宫内病毒感染几率继而减低新生儿出生缺陷发病率，降低女性生殖道癌肿的发病率；且无毒，育龄女性、孕妇及婴幼儿均适用，针对性强，作用直接，效果优于传统的口服或注射给药。

优选的，所述女性生殖道健康护理凝胶，按照各个组分在该女性生殖道健康护理凝胶中的质量百分含量计，包括：

抗hcmv天然提取物，含量为5％～20％；

小分子团水，含量为30％～70％；

抗hcmv卵黄抗体，含量为5％～20％；

保湿剂，含量为8％～20％；

皮肤调理剂，含量为6％～9％；

增稠剂，含量为1％～3％；

ph调节剂，含量为0.05％～0.15％；

清凉剂，含量为0.02％～0.2％。

优选的，所述保湿剂为甘油、丙二醇或者丁二醇中的一种或者两种以上的混合物；所述皮肤调理剂为甘油聚甲基丙烯酸酯、乙醇、氢氧化铵、n-丁醇、异丙醇、苦参根提取物、鱼腥草提取物或者透明质酸中的一种或者两种以上的混合物；所述增稠剂为羟乙基纤维素或者聚丙烯酸钠接枝淀粉中的一种或者两种的混合物。

优选的，所述清凉剂为冰片或者薄荷醇中的一种或者两种的混合物；所述ph调节剂为柠檬酸。

优选的，所述抗hcmv天然提取物为田七提取物，所述田七提取物中含有总黄酮类物质和总皂苷类物质，所述田七提取物的制备方法以及在抗hcmv方面的作用请参见专利号为cn102166238b，名称为“一种田七提取物及其应用”的中国发明专利，在此不再赘述。应当说明的是所述抗hcmv天然提取物还可以是其它提取物，例如蒲公英、大青叶、金银花和鱼腥草等植物提取物。

优选的，所述抗hcmv天然提取物的ph值为9.5。

本发明的女性生殖道健康护理凝胶的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、将抗hcmv天然提取物、抗hcmv卵黄抗体以及皮肤调理剂、清凉剂依次添加到小分子团水中，至完全溶解，混合均匀得到第一混合物；

步骤2、将保湿剂、增稠剂依次加入到步骤1中的第一混合物中，使其完全溶解，混合均匀得到第二混合物；

步骤3、将ph调节剂加入到第二混合物中，得到所述女性生殖道健康护理凝胶。

下面以三个实施例对本发明女性生殖道健康护理凝胶的组分、制备方法做进一步详细的描述。

实施例1

本实施例中的女性生殖道健康护理凝胶，按照各个组分在该女性生殖道健康护理凝胶中的质量百分含量计，包括：

抗hcmv天然提取物，含量为5％；

小分子团水，含量为70％；

抗hcmv卵黄抗体，含量为5％；

保湿剂，含量为10.75％；

皮肤调理剂，含量为6％；

增稠剂，含量为3％；

ph调节剂，含量为0.05％；

清凉剂，含量为0.2％。

本实施例中的女性生殖道健康护理凝胶的制备方法如下所示：

步骤1、将含量为5％的抗hcmv天然提取物、含量为5％的抗hcmv卵黄抗体以及含量为6％的皮肤调理剂、含量为0.2％的清凉剂依次添加到含量为70％的小分子团水中，至完全溶解，混合均匀得到第一混合物；

步骤2、将含量为10.75％的保湿剂、含量为3％的增稠剂依次加入到步骤1中的第一混合物中，使其完全溶解，混合均匀得到第二混合物；

步骤3、将含量为0.05％的ph调节剂加入到第二混合物中，得到所述女性生殖道健康护理凝胶。

实施例2

本实施例中的女性生殖道健康护理凝胶，按照各个组分在该女性生殖道健康护理凝胶中的质量百分含量计，包括：

抗hcmv天然提取物，含量为18.83％；

小分子团水，含量为30％；

抗hcmv卵黄抗体，含量为20％；

保湿剂，含量为20％；

皮肤调理剂，含量为9％；

增稠剂，含量为2％；

ph调节剂，含量为0.15％；

清凉剂，含量为0.02％。

本实施例中的女性生殖道健康护理凝胶的制备方法如下所示：

步骤1、将含量为18.83％的抗hcmv天然提取物、含量为20％的抗hcmv卵黄抗体以及含量为9％的皮肤调理剂、含量为0.02％的清凉剂依次添加到含量为30％的小分子团水中，至完全溶解，混合均匀得到第一混合物；

步骤2、将含量为20％的保湿剂、含量为2％的增稠剂依次加入到步骤1中的第一混合物中，使其完全溶解，混合均匀得到第二混合物；

步骤3、将含量为0.15％的ph调节剂加入到第二混合物中，得到所述女性生殖道健康护理凝胶。

实施例3

本实施例中的女性生殖道健康护理凝胶，按照各个组分在该女性生殖道健康护理凝胶中的质量百分含量计，包括：

抗hcmv天然提取物，含量为20％；

小分子团水，含量为48％；

抗hcmv卵黄抗体，含量为15％；

保湿剂，含量为8％；

皮肤调理剂，含量为7.8％；

增稠剂，含量为1％；

ph调节剂，含量为0.1％；

清凉剂，含量为0.1％。

本实施例中的女性生殖道健康护理凝胶的制备方法如下所示：

步骤1、将含量为20％的抗hcmv天然提取物、含量为15％的抗hcmv卵黄抗体以及含量为7.8％的皮肤调理剂、含量为0.1％的清凉剂依次添加到含量为48％的小分子团水中，至完全溶解，混合均匀得到第一混合物；

步骤2、将含量为8％的保湿剂、含量为1％的增稠剂依次加入到步骤1中的第一混合物中，使其完全溶解，混合均匀得到第二混合物；

步骤3、将含量为0.1％的ph调节剂加入到第二混合物中，得到所述女性生殖道健康护理凝胶。

最后说明的是，以上实施例仅用来说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。