蜜蜂幼虫芽孢杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法与流程

本发明属于蜜蜂幼虫芽孢杆菌检测技术领域，尤其涉及一种蜜蜂幼虫芽孢杆菌taqman荧光定量pcr检测方法。

背景技术：

美洲幼虫腐臭病(americanfoulbrood，afb)是由幼虫芽孢杆菌(paenibacilluslarvae，p.larvae)引起的蜜蜂幼虫和蛹的一种细菌性、急性、毁灭性传染病，其典型症状为封盖后死亡的幼虫巢房盖变潮湿、下陷、颜色发暗并显油光，大部分巢房盖穿孔，挑取虫体可拉出长10cm～15cm的胶体状细丝，患病幼虫虫体变软，失去正常白色和光泽，逐渐变成淡褐色至棕黑色。这种芽孢杆菌有7层结构包围，特殊的结构使其极具生命力，在恶劣环境下仍可存活35年以上。afb一旦在蜂场发生，极易造成幼虫死亡和蜂群群势衰弱，且很难彻底清除，给养蜂业造成重大经济损失。世界动物卫生组织(oie)将其列为法定报告动物疫病，我国将其列为二类动物疫病和进境动物检疫疫病。目前，afb主要根据临床症状进行诊断，易造成误诊，实验室诊断主要是以病原形态学、病原分离培养、生理生化特征、pcr方法等，确诊需要4d～6d，而且由于p.larvae的生长需要复杂的营养，在普通培养基上不能萌发也不能形成芽孢。近年来，因荧光定量pcr技术具有特异性强、灵敏度高、稳定性好等优点逐渐应用于各种病原体的定性和定量检测。han等建立了p.larvae的微流体芯片定量pcr方法，该方法只需7.9min完成30个循环，即可检测出16srrna基因，并可以进行熔解曲线分析，此方法是目前世界上最快的实时荧光定量分析方法。martinez等针对p.larvae16srrna基因设计引物，建立了sybrgreen荧光定量pcr检测方法，该方法用时2h，最低可检出3.75个细菌/ml和10个芽孢/ml。已报道的上述两种荧光定量pcr方法中，微流体芯片定量pcr专用仪器设备、试剂、耗材昂贵，检测成本较高，目前还不利于普及和推广应用；sybrgreen荧光定量pcr虽检测成本低，但pcr反应中的非特异性扩增或引物二聚体也会产生荧光，通常本底较高，引起假阳性，特异性较差。

综上所述，现有技术存在的问题是：

1.微流体芯片定量pcr检测速度快，但检测成本高，目前还不利于普及和推广应用；

2.sybrgreen荧光定量pcr检测成本低，但检测结果假阳性率高，特异性较差。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种蜜蜂幼虫芽孢杆菌taqman荧光定量pcr检测方法。

本发明是这样实现的，一种蜜蜂幼虫芽孢杆菌taqman荧光定量pcr检测方法，所述蜜蜂幼虫芽孢杆菌taqman荧光定量pcr检测方法根据p.larvae16srrna基因序列，设计了一对特异性引物和一条taqman荧光探针，建立了蜜蜂美洲幼虫腐臭病病原菌taqman荧光定量pcr检测方法。具体的检测流程：

1.dna抽提：采用ctab法或煮沸法或其它常规dna抽提方法提取样品、阳性对照、阴性对照中的dna；

2.对照设置：幼虫芽孢杆菌或含有目的dna片段的阳性质粒作为阳性对照、健康蜜蜂幼虫dna作为阴性对照，同时设立无模板空白对照；

3.pcr反应体系配置：在pcr管中加入10×pcrbuffer2.5μl，mgcl2(25mmol)1.5μl，dntps(2.5mmol)2μl，上下游引物(10μmol)各1μl，特异性探针(10μmol)0.5μl，taqdna聚合酶(5u/μl)0.5μl，模板dna1μl，加灭菌ddh2o15.0μl，使反应总体积为25.0μl；

4.pcr反应程序：94℃预变性2min；94℃变性15s、56℃退火延伸45s，共45个循环，在56℃时收集荧光信号；

5.结果判定：阴性对照和空白对照无ct值并且无扩增曲线，阳性对照的ct值应≤33，并且出现典型的扩增曲线，说明试验为有效试验，否则试验无效；在试验有效的情况下，待测样品无ct值，并且无扩增曲线，表示样品中无幼虫芽孢杆菌；待测样品ct值≤33，并且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在幼虫芽孢杆菌；待测样品ct值>33的样品重复检测，重复检测结果无ct值表示样品中无幼虫芽孢杆菌，重复检测结果有ct值表示样品中存在幼虫芽孢杆菌。

进一步，所述特异性引物的序列为：seqidno：1和seqidno：2。

进一步，所述探针的序列为：seqidno：3。

本发明的优点及积极效果为：为建立蜜蜂幼虫芽孢杆菌(p.larvae)荧光定量pcr检测方法，根据genbank中幼虫芽孢杆菌(p.larvae)16srrna基因保守序列设计特异性引物和探针，经反应体系及条件优化，建立了检测p.larvaetaqman荧光定量pcr方法。本发明与其它病原无交叉反应；最低可检出1.3×10拷贝/μl的阳性质粒，比普通pcr灵敏度高100倍；重复试验显示该方法的批内和批间变异系数均小于3％。应用本发明对50份实验室模拟样品和100份临床样品进行了检测，与预期结果一致。

本发明建立的方法可用于美洲幼虫腐臭病(afb)的早期快速检测及p.larvae定量分析；本发明建立的taqman荧光定量pcr方法，为afb的早期诊断、防控及在分子流行病学研究等方面提供一种新的技术手段。

附图说明

图1是本发明实施例提供的阳性模板的扩增示意图；

图中：m：dl2000dnamarker；1：pcrproduct；2：negativecontrol。

图2是本发明实施例提供的荧光定量pcr标准曲线示意图；

图中：1-7：pxt-16srecombinantplasmiddilutedfrom1.3×10⁷copies/μl-1.3×10¹copies/μl。

图3是本发明实施例提供的荧光定量pcr特异性试验扩增曲线示意图；

图中：1：p.larvae；2：negative；3：m.pluton；4：n.apis；5：a.apis；6：blankcontrast。

图4是本发明实施例提供的荧光定量pcr(a)与普通pcr(b)敏感性试验示意图；

图中：1-8：1.3×10⁷copiesto1.3×10⁰copies；9：negativecontrol。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。

本发明实施例提供的蜜蜂幼虫芽孢杆菌taqman荧光定量pcr检测方法包括以下步骤：

1.dna抽提：采用ctab法或煮沸法或其它常规dna抽提方法提取样品、阳性对照、阴性对照中的dna；

2.对照设置：幼虫芽孢杆菌或含有目的dna片段的阳性质粒作为阳性对照、健康蜜蜂幼虫dna作为阴性对照，同时设立无模板空白对照；

3.pcr反应体系配置：在pcr管中加入10×pcrbuffer2.5μl，mgcl2(25mmol)1.5μl，dntps(2.5mmol)2μl，上下游引物(10μmol)各1μl，特异性探针(10μmol)0.5μl，taqdna聚合酶(5u/μl)0.5μl，模板dna1μl，加灭菌ddh2o15.0μl，使反应总体积为25.0μl；

4.pcr反应程序：94℃预变性2min；94℃变性15s、56℃退火延伸45s，共45个循环，在56℃时收集荧光信号；

5.结果判定：阴性对照和空白对照无ct值并且无扩增曲线，阳性对照的ct值应≤33，并且出现典型的扩增曲线，说明试验为有效试验，否则试验无效；在试验有效的情况下，待测样品无ct值，并且无扩增曲线，表示样品中无幼虫芽孢杆菌；待测样品ct值≤33，并且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在幼虫芽孢杆菌；待测样品ct值>33的样品重复检测，重复检测结果无ct值表示样品中无幼虫芽孢杆菌，重复检测结果有ct值表示样品中存在幼虫芽孢杆菌。

根据p.larvae16srrna基因序列，设计了一对特异性引物和一条taqman荧光探针，建立了蜜蜂美洲幼虫腐臭病病原菌taqman荧光定量pcr检测方法。

下面结合试验对本发明的应用效果作详细的描述。

1材料与方法

1.1菌/虫株p.larvae购自北京北纳创联生物技术研究院，蜂房蜜蜂球菌(melissococcuspluton)购自美国典型培养物保藏中心，蜜蜂微孢子虫(nosemaapis)、蜜蜂子囊球菌(asosphaeraapis)均由伊犁出入境检验检疫局综合技术服务中心分离保存。

1.2主要试剂基因组dna提取试剂盒购自qiagen公司；taqdna聚合酶、mgcl2、dntps、dl2000marker、pxt19-tvector、胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒等均购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.3引物和探针的设计与合成根据genbank登录的p.larvae基因保守序列(x60619.1)，使用primerprimier5和primerexpress3.0软件设计上下游引物(seqidno：1f：5'-ctaatacatgcaagtcgagcgga-3'，seqidno：2r：5'–ggtattagctcacgtttccgca-3')和一条探针(seqidno：3p：5'-hex-cttgtgtttctttcgggagacgcca-bhq1-3')，预期扩增片段为129bp。引物和探针均由北京鼎国昌盛生物技术有限公司合成。

1.4细菌基因组提取及标准品制备采用基因组dna提取试剂盒从p.larvae标准菌株中提取p.larvae基因组，应用特异性引物进行普通pcr扩增，产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，切胶纯化pcr产物，克隆至pxt19-t中构建重组质粒pxt-16s，转化dh5α感受态细菌中，37℃过夜摇菌后提取质粒进行普通pcr扩增和送北京鼎国昌盛生物技术有限公司测序，将鉴定正确的重组质粒测定浓度，根据公式：拷贝数＝(质量/分子量)×6.0×10²³计算其拷贝数，作为荧光定量pcr标准品。

1.5反应体系及反应条件优化以pxt-16s标准品作为模板，采用矩阵法分别对反应体系中的引物、探针、dntps、mg²⁺浓度及反应条件中退火、延伸温度和时间进行优化。

1.6标准曲线的建立将pxt-16s标准品经微量紫外分光光度计测定浓度，使用缓冲液稀释成10倍系列梯度浓度作为模板，于-20℃保存。按优化好的体系条件进行荧光定量pcr，绘制标准曲线。

1.7特异性试验采用基因组dna提取试剂盒提取p.larvae、m.pluton、n.apis、a.apis及健康蜜蜂幼虫dna，以健康蜜蜂幼虫dna作为阴性对照模板，设立无模板空白对照，采用本发明建立的荧光定量pcr进行检测，评价该方法的特异性。

1.8敏感性试验使用缓冲液将pxt-16s标准品进行10倍系列稀释8个梯度(1.3×10⁷拷贝/μl～1.3×10⁰拷贝/μl)，分别作为模板，按优化好的体系条件进行荧光定量pcr，确定反应的最小检出量。同时进行普通pcr反应，比较两种检测方法的敏感性。

1.9重复性试验选取5个不同浓度梯度的pxt-16s标准品分别作为模板，各浓度进行4次重复检测，根据ct值计算批内变异系数；以上述5个不同浓度的标准品分别作为模板，在3个不同时间进行荧光定量pcr检测，根据ct值计算批间变异系数，评价该方法的重复性和稳定性。

1.10实验室模拟样品和临床样品检测将定量的不同稀释倍数的pxt-16s标准品掺入健康成蜂、幼虫、蜂蛹、蜂蜜、蜂胶、蜂王浆和花粉样品中制成50份实验室模拟样品；采自新疆主要养蜂区域的100份蜜蜂幼虫及蜂产品作为临床样品，应用建立的荧光定量pcr方法进行检测，并与普通pcr方法进行比较。

2结果

2.1标准品的制备将p.larvaedna进行普通pcr扩增，获得长度约为130bp的目的片段(图1)，pcr产物经测序分析，与genbank中登录序列的同源性达到100％。将目的片段克隆于pxt19-t中构建pxt-16s重组质粒标准品，经普通pcr和测序鉴定正确后，利用微量紫外分光光度计测定od260nm/od280nm＝1.86，计算其浓度为1.3×10⁷拷贝/μl。

2.2反应体系和条件的优化通过采用矩阵法优选引物和探针最佳浓度配比，最佳反应体系为(25μl)：10×pcrbuffer2.5μl，mgcl2(25mmol)1.5μl，dntps(2.5mmol)2μl，上下游引物(10μmol)各1μl，特异性探针(10μmol)0.5μl，taqdna聚合酶(5u/μl)0.5μl，模板dna1μl，加灭菌ddh2o至25μl。最佳反应条件：94℃2min，94℃15s、56℃45s，45个循环，在56℃时收集荧光信号。

2.3标准曲线的建立以10倍系列梯度稀释的pxt-16s标准品分别作为模板进行荧光定量pcr反应，标准品浓度从1.3×10⁷拷贝/μl～1.3×10¹拷贝/μl与ct值呈良好的线性关系，斜率为-3.34，截距为37.89，从而可以得出标准曲线回归方程式：ct＝-3.34×logco+37.89，相关系数r²＝0.998(图2)。

2.4特异性试验应用建立的荧光定量pcr方法，利用蜜蜂常见疫病病原p.larvae、m.pluton、n.apis、a.apis及健康蜜蜂幼虫dna作为模板，进行特异性试验，结果显示仅p.larvae有特异性曲线，其它病原、阴性对照及无模板空白对照检测结果均为阴性(图3)，表明建立的荧光定量pcr方法具有良好的特异性。

2.5敏感性试验用缓冲液将pxt-16s标准品10倍系列稀释8个梯度(1.3×10⁷拷贝/μl～1.3×10⁰拷贝/μl)，分别作为模板进行荧光定量pcr和普通pcr检测，结果显示荧光定量pcr最小检出量为1.3×10拷贝/μl，普通pcr最小检出量为1.3×10³拷贝/μl(图4)，表明荧光定量pcr的敏感性比普通pcr提高了约100倍。

2.6重复性试验选取5个浓度的pxt-16s标准品进行批内和批间重复性试验，根据扩增反应的ct值，计算变异系数(cv)，数据结果显示批内变异系数cv≤1.56％，批间变异系数cv≤2.37％(表1)，表明所建立的方法具有较好的重复性。

表1荧光定量pcr的重复性试验

2.7实验室模拟样品和临床样品检测应用建立的荧光定量pcr和普通pcr方法对50份实验室模拟样品和采自新疆主要养蜂区域的100份蜜蜂幼虫及蜂产品临床样品进行检测，结果显示实验室模拟样品荧光定量pcr和普通pcr方法共同检出20份阳性和10份阴性，两种检测方法的符合率为60％。其中荧光定量pcr方法检测为阳性的40份(阳性率80％)样品中，仅有20份普通pcr方法检测为阳性(阳性率40％)，荧光定量pcr能检出加入pxt-16s标准品浓度在1.3×10拷贝/μl以上的实验室模拟样品，与预期结果相一致；蜜蜂幼虫及蜂产品临床样品两种方法检测结果均为阴性。表明该荧光定量pcr具有良好的临床应用性。

目前，已报道的p.larvae荧光定量pcr检测方法有微流体芯片定量pcr和sybrgreen荧光定量pcr方法，前者检测速度快，但成本高，后者检测成本低，但特异性差。本发明根据p.larvae16srrna基因序列，设计了一对特异性引物和一条taqman荧光探针，建立了蜜蜂美洲幼虫腐臭病病原菌taqman荧光定量pcr检测方法，弥补了上述两种方法的不足。本发明建立的方法特异性好，灵敏度高，重复性好，批内和批间重复性试验ct值变异系数均小于3％；适用范围广，检测成蜂、幼虫、蜂蛹、蜂蜜、蜂胶、蜂王浆和花粉等实验室模拟样品与预期结果一致。因此，该方法可用于蜜蜂及蜂产品中afb的早期、高通量快速诊断及p.larvae定量分析。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

<110>伊犁职业技术学院、伊犁出入境检验检疫局综合技术服务中心

<120>蜜蜂幼虫芽孢杆菌taqman荧光定量pcr检测方法

<160>3

<210>23

<211>序列的长度

<212>rna

<213>人工序列

<400>核苷酸序列

5'-ctaatacatgcaagtcgagcgga-3'

<210>2

<211>22

<212>rna

<213>人工序列

<400>核苷酸序列

5'–ggtattagctcacgtttccgca-3'

<210>3

<211>25

<212>rna

<213>人工序列

5'-hex-cttgtgtttctttcgggagacgcca-bhq1-3'