水稻BR信号正调控因子OsWRKY53基因及其编码蛋白的制作方法

本发明涉及水稻br信号正调控因子oswrky53基因及其编码蛋白。

背景技术：

水稻是一种重要的粮食作物，世界上一半以上的人口以其为主食，提高水稻作物产量对提高粮食安全和稳定经济发展具有重要意义。而水稻株型是影响水稻作物产量的一个重要因素，水稻叶夹角又是水稻株型的一个重要组成部分。叶夹角增大，更加利于叶片捕获光，进而提高光合速率，在一定程度上提高作物产量；而叶夹角小，叶片处于直立状态，可以在一定程度上提高种植密度，进而也能够提高作物产量。所以，系统的研究水稻的叶夹角对塑造水稻株型和提高作物产量具有重要的理论和应用价值。在短期内实现林木性状改良的需求，通过转基因手段对其进行遗传改良具有很大意义。

技术实现要素：

本发明提供一种白桦基因及其编码蛋白和应用。

本发明水稻br信号正调控因子oswrky53基因的核苷酸序列如序列表中seqidno：1所示。

本发明编码水稻br信号正调控因子oswrky53基因的蛋白的氨基酸序列如序列表中seqidno：2所示。

br，即油菜素内酯，是一种重要的甾醇类植物激素，参与对植物叶夹角的调控，水稻br缺陷型突变体如d61-2、d11、bzr1-rnai、osgsk2-oe等，叶夹角显著变小；而br功能获得性突变体如m107、bzr1-d、osgsk2-rnai等，叶夹角显著增大，充分表明br与植物叶夹角调控之间存在着直接的关系。

本发明公开了水稻br信号正调控因子oswrky53基因及其编码蛋白，本发明利用pcr方法从水稻中克隆出水稻转录因子oswrky53基因。本发明获得的oswrky53基因编码区全长序列与ricegenomeannotationproject中公布的loc_os05g27730.1相对应。本发明通过遗传转化手段，将oswrky53基因在水稻中过量表达，并且发现oswrky53基因过表达转基因水稻叶夹角显著增大、种子增大，表现出br信号增强的表型；通过crispr/cas9敲除技术获得oswrky53基因敲除突变体，oswrky53突变体表现出叶夹角变小、种子变小、株高变矮等一系列br信号缺陷的表型。br生物合成基因检测、外源br对叶夹角敏感性分析实验以及oswrky53对外源br处理的响应实验，都充分表明oswrky53能够正向调控br信号。

本发明首次发现水稻转录因子oswrky53基因能够正向调控br信号及水稻株型。水稻转录因子oswrky53作为br信号正调控因子的发现，在一定程度上丰富和完善了水稻br信号转导通路，对改造水稻株型，进而提高作物产量提供重要理论依据，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为oswrky53基因过表达转基因水稻总体形态图；其中wt为野生型水稻，oswrky53-oe为oswrky53基因过表达转基因水稻；

图2为oswrky53基因过表达转基因水稻叶夹角形态图；其中wt为野生型水稻，oswrky53-oe为oswrky53基因过表达转基因水稻；

图3为oswrky53基因过表达转基因水稻叶夹角大小统计结果；其中wt为野生型水稻，oswrky53-oe为oswrky53基因过表达转基因水稻；

图4为oswrky53基因过表达转基因水稻种子形态图；其中wt为野生型水稻，oswrky53-oe-1、oswrky53-oe-2、oswrky53-oe-3均为oswrky53基因过表达转基因水稻；

图5为oswrky53基因过表达转基因水稻种子粒长统计结果图；其中wt为野生型水稻，1、2和3均为oswrky53基因过表达转基因水稻；

图6为oswrky53基因过表达转基因水稻种子粒宽统计结果图；其中wt为野生型水稻，1、2和3均为oswrky53基因过表达转基因水稻；

图7为3个br生物合成基因d2、osdwf4、d11在oswrky53基因过表达转基因水稻及野生型的表达量检测结果；其中a为野生型水稻，b、c和d均为oswrky53基因过表达转基因水稻；

图8为oswrky53突变体敲除类型；其中wt为野生型水稻，oswrky53-1、oswrky53-2均为oswrky53基因敲除突变体；

图9为oswrky53突变体总体形态图；其中wt为野生型水稻，oswrky53-1、oswrky53-2均为oswrky53基因敲除突变体；

图10为oswrky53突变体叶夹角形态图；其中wt为野生型水稻，oswrky53-1为oswrky53基因敲除突变体；

图11为oswrky53突变体叶夹角大小统计结果；其中a为野生型水稻，b为oswrky53基因敲除突变体；

图12为oswrky53突变体种子形态图；其中wt为野生型水稻，oswrky53-1、oswrky53-2均为oswrky53基因敲除突变体；

图13为oswrky53突变体种子粒长统计结果；其中wt为野生型水稻，1和2为oswrky53基因敲除突变体；

图14为oswrky53突变体种子粒宽统计结果；其中wt为野生型水稻，1和2为oswrky53基因敲除突变体；

图15为oswrky53突变体株高统计结果；其中wt为野生型水稻，1和2为oswrky53基因敲除突变体；

图16为外源br对oswrky53基因过表达转基因水稻叶夹角的敏感性分析实验的图片；其中wt为野生型水稻，oswrky53-oe为oswrky53-oe基因过表达转基因水稻；

图17为外源br对oswrky53基因过表达转基因水稻叶夹角的敏感性分析实验的统计结果；其中a为野生型水稻，b为oswrky53-oe基因过表达转基因水稻；

图18为外源的br对oswrky53突变体叶夹角敏感性分析实验的图片；其中wt为野生型水稻，oswrky53为oswrky53基因敲除突变体；

图19为外源的br对oswrky53突变体叶夹角的敏感性分析实验的统计结果；其中a为野生型水稻，b为oswrky53基因敲除突变体；

图20为转录水平上，oswrky53基因对br响应的表达特征分析；其中b为oswrky53基因，c为osdwf4基因；

图21为蛋白水平上，oswrky53对br响应的表达特征分析。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式水稻br信号正调控因子oswrky53基因的核苷酸序列如序列表中seqidno：1所示。

本实施方式公开了水稻br信号正调控因子oswrky53基因及其编码蛋白，本实施方式利用pcr方法从水稻中克隆出水稻转录因子oswrky53基因。本实施方式获得的oswrky53基因编码区全长序列与ricegenomeannotationproject中公布的loc_os05g27730.1相对应。本实施方式通过遗传转化手段，将oswrky53基因在水稻中过量表达，并且发现oswrky53基因过表达转基因水稻叶夹角显著增大、种子增大，表现出br信号增强的表型；通过crispr/cas9敲除技术获得oswrky53基因敲除突变体，oswrky53突变体表现出叶夹角变小、种子变小、株高变矮等一系列br信号缺陷的表型。br生物合成基因检测、外源br对叶夹角敏感性分析实验以及oswrky53对外源br处理的响应实验，都充分表明oswrky53能够正向调控br信号。

本实施方式首次发现水稻转录因子oswrky53基因能够正向调控br信号及水稻株型。水稻转录因子oswrky53作为br信号正调控因子的发现，在一定程度上丰富和完善了水稻br信号转导通路，对改造水稻株型，进而提高作物产量提供重要理论依据，具有广阔的应用前景。

具体实施方式二：本实施方式编码水稻br信号正调控因子oswrky53基因的蛋白的氨基酸序列如序列表中seqidno：2所示。

通过以下实验验证本发明的效果：

实施例1、

1、水稻br信号正调控因子oswrky53基因的克隆及测序：

一、以野生水稻品种日本晴为实验材料，按照invitrogen公司的trizol试剂盒的操作手册，提取叶片总rna；

二、采用dnaseⅰ处理步骤一所提取的总rna；

三、取1μg步骤二处理后的总rna用于cdna的合成，cdna的合成操作按照购买自bdbiosciencesclontech公司的bdsmart^tmracecdnaamplificationkit试剂盒的使用手册进行，获得cdna；

四、以上述获得的cdna为模板，参照takara公司的hsdnapolymerase操作说明书，用正向引物f1与反向引物r1扩增oswrky53基因。pcr反应条件如下：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸90s，共38循环；72℃终延伸10min。最后，将pcr产物在abi3130测序仪(abi公司)上进行测序，测序结果表明，水稻br信号正调控因子oswrky53基因由1464个碱基组成，其核苷酸序列如序列表中的seqidno：1所示。编码具有序列表中seqidno：2的氨基酸序列的蛋白质。

正向引物f1：5'-atggcgtcctcgacgggg-3'

反向引物r1：5'-ctagcagaggagcgactcgacg-3'

2、oswrky53基因过表达转基因水稻的获得

一、载体构建：以日本晴cdna为模板，参照takara公司的hsdnapolymerase操作说明书，以正向引物f2与反向引物r2为扩增引物，扩增oswrky53基因的编码区，并将扩增片段克隆进入植物过表达载体pc1390u，形成一个ubiquitin启动子驱动的oswrky53基因过表达载体。

正向引物f2：5'-gttacttctgcactaggtaccatggcgtcctcgacgggg-3'

反向引物r2：5'-tcttagaattcccggggatccctagcagaggagcgactcgacg-3'

二、目的载体转化农杆菌eha105：将eha105感受态从-80℃冰箱取出，置于冰上融化；将500ng～1μg的目的质粒加入100uleha105感受态中，冰上放置30min；迅速置于液氮中5min；从液氮中取出，迅速置于37℃水预锅中水浴5min；冰上2min；加入800ul液体lb培养基，置于全温震荡器(购自mkn公司)中，28℃，120rpm孵育4～5h；离心，弃大部分上清，将剩余菌液涂抹于含有卡那霉素(50ug/ml)(购自amresco)和利福平(50ug/ml)(购自amresco)的lb固体培养基上，28℃培养3天左右。

三、待长出菌落后，进行菌落pcr鉴定，鉴定出阳性克隆；挑取阳性克隆至加有相应抗生素和利福平的液体lb培养基中，28℃，180rpm培养16h左右，此时的菌液可以用30％的甘油按1:1的体积比进行保存，存至-80℃冰箱，侵染愈伤组织时，从-80℃取出进行活化即可。

四、农杆菌侵染水稻愈伤组织：从-80℃冰箱取出目的存菌，按1:100的比例加入含有卡那霉素(50ug/ml)和利福平(50ug/ml)的液体lb培养基中，180rpm，28℃培养过夜；将菌液培养至肉眼看上去像橙汁一样的颜色(od＝1.0左右)，方可从培养箱中取出；取500ul左右菌液至1.5ml离心管中，5000rpm，28℃，离心3min，弃上清，可以看到管底有白色的菌团；用300ul含有20ug/ml的乙酰丁香酮(购自aldrich)的液体共培培养基轻轻吹打管底菌团，使其均匀的悬浮在液体培养基中；挑选生长状态良好的愈伤组织至50ml离心管中，大约至离心管刻度5ml左右；加入20ml含有20ug/ml的乙酰丁香酮的液体共培培养基，然后将上述悬浮好的300ul菌液全部加入到50ml离心管中；持续轻柔混匀2～3min，以进行侵染。将液体共培培养基倒掉，然后将侵染好的愈伤组织转移至铺有滤纸的培养皿中，吸附多余的培养基，这一过程大约需要1min左右；在固体共培培养基上铺一层滤纸，使滤纸浸透，然后将上述侵染好的愈伤组织转移至此固体培养基上；28℃暗培养2～3天。

五、被侵染水稻愈伤组织的恢复培养：被侵染的愈伤暗培养2～3天后，将愈伤颗粒转移至50ml离心管中；用含有400ug/ml羧卞青霉素(购自amresco)的无菌水清洗愈伤组织4～5遍，每次持续1min左右，进行除菌；再用无菌水清洗愈伤组织2～3遍，转移至铺有滤纸的培养皿上，吸干多余水分；将上述愈伤组织转移至含有400ug/ml羧卞青霉素的恢复培养基上，28℃人工气候培养箱(24h光培养)恢复培养4～5天。

六、被侵染水稻愈伤组织的筛选培养：恢复培养4～5天后，将恢复培养基上的愈伤组织转移至含有400ug/ml羧卞青霉素和50ug/ml潮霉素(购自roche)的筛选培养基上；将其转移至28℃人工气候培养箱(24h光培养)中培养30天左右。

七、抗性水稻愈伤组织的分化培养：将筛选培养基上的抗性愈伤转移至分化培养基上，每瓶移至一簇愈伤；将其置于28℃人工气候培养箱(24h光培养)中培养30天左右，即可分化出转基因苗。

八、转基因苗的鉴定：待分化出转基因苗后，需对其进行鉴定，排除假阳性。首先进行水稻dna的粗提；用以上粗提的dna为模板，按照全式金公司的easytaqdnapolymerase说明书，用潮霉素引物(f3和r3)进行扩增。

正向引物f3：5'-tgcgcccaagctgcatcat-3'

反向引物r3：5'-tgaactcaccgcgacgtctgt-3'

如图1所示，是oswrky53基因过表达转基因水稻的总体形态图，可以看到过表达转基因水稻呈现出br信号增强的表型；其叶夹角显著增大，其剑叶的叶夹角超过100°，而野生型的叶夹角仅为30°左右(如图2、3所示)；并且过表达转基因水稻的种子显著增大，测量其粒长粒宽发现，与野生型相比两者都显著变长(如图4、5和6所示)，oswrky53基因极有可能正向调控br信号。

3、br生物合成基因的表达量检测

一、以oswrky53基因过表达转基因水稻及其对照为实验材料，培养至两周大小，取相同部位的叶片，参照购买自invitrogen公司的trizol试剂盒的操作手册提取叶片总rna；

二、采用dnaseⅰ处理步骤一提取的总rna；

三、取1μg步骤二处理后的总rna用于cdna的合成，cdna的合成操作按照购买自bdbiosciencesclontech公司的bdsmart^tmracecdnaamplificationkit试剂盒的使用手册进行；

四、以获得的cdna为模板通过3个br生物合成基因引物：d2基因(正向引物f4与反向引物r4)、osdwf4基因(正向引物f5与反向引物r5)和d11基因(正向引物f6与反向引物6)，水稻内参actin(正向引物f7与反向引物r7)，采用sybrgreenpcrmastermix(transstart)进行quantitativereal-timepcr；数据从bio-radchromo4real-timepcrdetector上获得；用2^-△△ct方法分析倍数变化。

正向引物f4：5'-tcgctgacggagctgatg-3'

反向引物r4：5'-acttgaggtgggaggacttg-3'

正向引物f5：5'-ctccaccttctccgctcag-3'

反向引物r5：5'-gccgctccgtctcttcc-3'

正向引物f6：5'-tggcgacattgagaagattgc-3'

反向引物r6：5'-cagaaggcgatgacattgacc-3'

正向引物f7：5'-agaccttcaacacccctgctatg-3'

反向引物r7：5'-tcacgcccagcaaggtcg-3'

如图7所示，是3个br生物合成基因d2、osdwf4、d11在oswrky53基因过表达转基因水稻及其对照中的表达特征。结果显示，与对照野生型相比，过表达转基因水稻中3个br生物合成基因的表达量均显著降低，说明在过表达转基因水稻中其内源的br信号是增强的，初步说明oswrky53基因能够正向调控br信号。

4、oswrky53突变体的获得

一、将oswrky53基因的cds序列输入crisprprimerdesigner软件，设计2对靶位点引物(f8和r8；f9和r9)，用于后续敲除载体的构建。

正向引物f8：5'-ggcattccagtcgtacctctgagc-3'

反向引物r8：5'-aaacgctcagaggtacgactggaa-3'

正向引物f9：5'-gccgagctggaggacgggtacaac-3'

反向引物r9：5'-aaacgttgtacccgtcctccagct-3'

二、将100μm上下游引物各取1μl加入到98μl的0.5×te溶液中，90℃热激30s，形成打靶接头，移至室温冷却完成退火。

三、将这2个打靶接头分别连接到各grna表达盒上。

pcr程序为：37℃5min，20℃5min，5个循环。

四、通过巢式pcr的方法扩增grna表达盒

第一轮pcr扩增

pcr程序：98℃2min；98℃10s，60℃10s，72℃20s，共25个循环；72℃5min。第二轮pcr扩增：

pcr程序：98℃2min；98℃10s，60℃10s，72℃30s，25个循环；72℃5min。

本步骤操作所涉及到的通用引物序列为：

u-f:5'-ctccgttttacctgtggaatcg-3'

grna-r:5'-cggaggaaaattccatccac-3'

b1':5'-ttcagaggtctctctcgcactggaatcggcagcaaagg-3'

b2:5'-agcgtgggtctcgtcagggtccatccactccaagctc-3'

b2':5'-ttcagaggtctctctgacactggaatcggcagcaaagg-3'

bl:5'-agcgtgggtctcgaccgggtccatccactccaagctc-3'

五、将上述巢式pcr获得的片段，连接入pylcrspr/cas9-mt载体骨架上，即完成敲除载体的构建。

程序：37℃，15min；随后，在上述体系基础上加入连接酶，连接体系为：

t4dna酶(neb)0.1μl

10xdnaligasebuffer(neb)1.5μl

pcr程序：37℃5min，10℃5min，20℃5min，共15个循环。

六、连接产物的转化、阳性克隆的鉴定、测序、质粒的提取；

七、目的载体转化农杆菌eha105；

八、采用农杆菌介导的遗传转化方法获得oswrky53基因敲除突变体。

如图8所示，是两种oswrky53基因敲除突变体oswrky53-1和oswrky53-2的测序结果，wt的序列为：5'-atcccggctcagaggtacgactggaag-3'，oswrky53-1(-cagaggt)的序列为：5'-atcccggct-------acgactggaag-3'，oswrky53-2(+a)的序列为：5'-atcccggctacagaggtacgactggaag-3'，分别是缺失7bp和插入1bp，均造成后续移码突变，使表达出的氨基酸发生改变，oswrky53蛋白功能丧失。如图9所示，是oswrky53突变体的总体形态图，从图中可以看到突变体呈现出一系列br信号缺失的表型；首先，oswrky53突变体叶夹角变小，其剑叶的叶夹角仅为18°左右，而对照的叶夹角为38°左右(如图10、11所示)；其次，oswrky53突变体的种子显著变小，测量其粒长粒宽发现，与野生型相比两者都显著变短(如图12、13和14所示)；再次，oswrky53突变体株高变矮(如图15所示)。oswrky53突变体的表现再次说明，oswrky53能够正向调控br信号。

5、外源br对叶夹角的敏感性分析

一、种子消毒：选用oswrky53基因过表达转基因水稻及其对照为实验材料，种子剥皮，用70％乙醇浸泡1min；然后用30％的次氯酸浸泡两次，每次15min；最后用无菌水清洗5～7遍；

二、将消毒种子转移至1/2ms固体培养基(1％蔗糖，4％phytagel，ph5.8)上，30℃暗培养8天左右；

三、选取第二个叶的叶夹角(包含叶片、叶鞘各1cm)，用不同浓度24-epibl(sigma,e1641)在30℃培养箱中暗培养48h；

四、观察结果，并用imagej软件进行叶夹角的测量。

如图16所示，是oswrky53基因过表达转基因水稻及其对照在不同浓度24-epibl(sigma,e1641)中处理48h后的照片，图17是不同浓度24-epibl处理过程中叶夹角角度统计结果。结果显示，用10nm24-epibl处理后，过表达转基因水稻的叶夹角达到130°左右，而对照仅为60°左右；并且，随着24-epibl处理浓度的提高，叶夹角增大的表型更加明显，用1μμ24-epibl处理后，过表达转基因水稻的叶夹角甚至达到230°左右，说明oswrky53过表达转基因水稻叶夹角对外源的br处理超敏感。相反的，oswrky53突变体叶夹角对外源的24-epibl处理不敏感(如图18、19所示)，即使用1μμ24-epibl处理后，oswrky53突变体的叶夹角仅达到50°左右，而对照达到140°左右。进一步为oswrky53基因正向调控br信号提供实验证据。

6、转录水平上，oswrky53基因对br响应的表达特征分析：

一、选用野生水稻品种龙粳11为实验材料，浸种催芽后，将萌发的种子播种在剪了底的96孔pcr板中，然后浸在1/2ms液体培养基中，28℃光照培养箱(光培养14h；暗培养10h)中培养2周；

二、挑选生长状态一致的水稻幼苗，用1μm24-epibl分别处理0h、1h、3h、6h；

三、取相同部位的叶片，参照购买自invitrogen公司的trizol试剂盒的操作手册，提取叶片总rna；

四、采用dnaseⅰ处理步骤三提取的总rna；

五、取1μg步骤四处理后的总rna用于cdna的合成，cdna的合成操作按照购买自bdbiosciencesclontech公司的bdsmart^tmracecdnaamplificationkit试剂盒的使用手册进行，获得cdna；

六、以获得的cdna为模板，正向引物f10与反向引物r10为检测引物，检测oswrky53基因的表达水平。

正向引物f10：5'-agaccttcaacacccctgctatg-3'

反向引物r10：5'-tcacgcccagcaaggtcg-3'

如图20所示，是oswrky53基因转录水平上对br响应的表达特征，结果显示br能够抑制oswrky53转录水平上的表达，并且br处理时间越长，抑制程度越明显。

7、蛋白水平上，oswrky53对br响应的表达特征分析

一、选用纯合的带有myc标签的oswrky53基因过表达转基因水稻为实验材料，浸种催芽后，将萌发的种子播种在剪了底的96孔pcr板中，然后浸在1/2ms液体培养基中，在28℃培养箱(光培养14h；暗培养10h)中培养2周；

二、挑选生长状态一致的水稻幼苗，用1μμ24-epibl和dmso分别处理30min；

三、取相同部位的叶片，参照碧云天公司的sds裂解液说明书提取叶片总蛋白；

四、加入1×loadingbuffer，煮沸5min，高速离心10min；

五、上样，进行sds-page电泳；

六、电泳结束后，进行转膜，将胶上的蛋白转移至pvdf膜(bio-rad)上；

七、待转膜结束后，用myc抗体(abmart：m20002l)进行后续western杂交。

如图21所示，是蛋白水平上，oswrky53对br响应的表达特征。结果显示，br能够诱导oswrky53蛋白水平上的表达。作为br信号正调控因子，其蛋白水平上的积累越多，br信号输出越强，但植物体又存在着自我负反馈平衡调节机制，当植物体内br信号强到一定程度后，植物体又能够抑制这些br信号正调控因子转录水平上的表达，以维持植物体内br信号的平衡。

综上所述，本实施例通过遗传转化手段，将oswrky53基因在水稻中过量表达，并且发现oswrky53基因过表达转基因水稻叶夹角显著增大、种子增大，表现出br信号增强的表型；通过crispr/cas9敲除技术获得oswrky53基因敲除突变体，oswrky53突变体表现出叶夹角变小、种子变小、株高变矮等一系列br信号缺陷的表型。br生物合成基因检测、外源br对叶夹角敏感性分析实验以及oswrky53对外源br处理的响应实验，都充分表明oswrky53能够正向调控br信号。

序列表

<110>中国科学院东北地理与农业生态研究所

<120>水稻br信号正调控因子oswrky53基因及其编码蛋白

<160>28

<210>1

<211>1464

<212>dna

<213>水稻

<400>1

atggcgtcctcgacgggggggttggaccacgggttcacgttcacgccgccgccgttcatc60

acgtcgttcaccgagctgctgtcggggggcggtggggacctgctcggcgccggcggtgag120

gagcgctcgccgagggggttctccagaggcggagcgagggtgggcggcggggtgcccaag180

ttcaagtccgcgcagccgccgagcctgccgctctcgccgccgccggtgtcgccgtcgtcc240

tacttcgccatcccgccggggctcagccccaccgagctgctcgactcccccgtcctcctc300

agctcctcccatatcttggcgtccccgaccaccggtgcaatcccggctcagaggtacgac360

tggaaggccagcgccgatctcatcgcttctcagcaagatgacagccgcggcgacttctcc420

ttccacaccaactccgacgccatggccgcgcaaccggcctctttcccttccttcaaggag480

caagagcagcaagtggtcgagtcgagcaagaacggcgccgccgccgcgtcgagcaacaag540

agcggcggcggcgggaacaacaagctggaggacgggtacaactggaggaagtacgggcag600

aagcaggtgaaggggagcgagaacccgaggagctactacaagtgcacctacaacggctgc660

tccatgaagaagaaggtggagcgctcgctcgccgacggccgcatcacccagatcgtctac720

aagggcgcacacaaccaccccaagccgctctccacccgccgcaacgcctcctcctgcgcc780

accgccgccgcctgcgccgacgacctcgcggcgcccggcgcgggcgcggaccagtactcc840

gccgcgacgcccgagaactcctccgtcacgttcggcgacgacgaggccgacaacgcatcg900

caccgcagcgagggcgacgagcccgaagccaagcgctggaaggaggatgctgacaacgag960

ggcagctccggcggcatgggcggcggcgccggcggcaagccggtgcgcgagccgaggctt1020

gtggtgcagacgctgagcgacatcgacatcctcgacgacggcttccggtggaggaagtac1080

ggccagaaggtcgtcaagggcaaccccaacccaaggagctactacaagtgcacgacggtg1140

ggctgcccggtgcggaagcacgtggagcgggcgtcgcacgacacgcgcgccgtgatcacc1200

acctacgagggcaagcacaaccacgacgtcccggtcggccgcggcggcggcggcggacgc1260

gccccggcgccggcgccgccgacgtcgggggcgatccggccgtcggccgtcgccgccgcc1320

cagcaggggccctacaccctcgagatgctccccaaccccgccggcctctacggcggctac1380

ggcgccggcgccggcggcgccgcgttcccgcgcaccaaggacgagcggcgggacgacctg1440

ttcgtcgagtcgctcctctgctag1464

<210>2

<211>487

<212>prt

<213>水稻

<400>2

metalaserserthrglyglyleuasphisglyphethrphethr

151015

propropropheilethrserphethrgluleuleuserglygly

202530

glyglyaspleuleuglyalaglyglyglugluargserproarg

354045

glypheserargglyglyalaargvalglyglyglyvalprolys

505560

phelysseralaglnproproserleuproleuserpropropro

657075

valserprosersertyrphealaileproproglyleuserpro

808590

thrgluleuleuaspserprovalleuleuserserserhisile

95100105

leualaserprothrthrglyalaileproalaglnargtyrasp

110115120

trplysalaseralaaspleuilealaserglnglnaspaspser

125130135

argglyasppheserphehisthrasnseraspalametalaala

140145150

glnproalaserpheproserphelysgluglngluglnglnval

155160165

valgluserserlysasnglyalaalaalaalaserserasnlys

170175180

serglyglyglyglyasnasnlysleugluaspglytyrasntrp

185190195

arglystyrglyglnlysglnvallysglysergluasnproarg

200205210

sertyrtyrlyscysthrtyrasnglycyssermetlyslyslys

215220225

valgluargserleualaaspglyargilethrglnilevaltyr

230235240

lysglyalahisasnhisprolysproleuserthrargargasn

245250255

alasersercysalathralaalaalacysalaaspaspleuala

260265270

alaproglyalaglyalaaspglntyrseralaalathrproglu

275280285

asnserservalthrpheglyaspaspglualaaspasnalaser

290295300

hisargsergluglyaspgluproglualalysargtrplysglu

305310315

aspalaaspasngluglyserserglyglymetglyglyglyala

320325330

glyglylysprovalarggluproargleuvalvalglnthrleu

335340345

seraspileaspileleuaspaspglypheargtrparglystyr

350355360

glyglnlysvalvallysglyasnproasnproargsertyrtyr

365370375

lyscysthrthrvalglycysprovalarglyshisvalgluarg

380385390

alaserhisaspthrargalavalilethrthrtyrgluglylys

395400405

hisasnhisaspvalprovalglyargglyglyglyglyglyarg

410415420

alaproalaproalaproprothrserglyalaileargproser

425430435

alavalalaalaalaglnglnglyprotyrthrleuglumetleu

440445450

proasnproalaglyleutyrglyglytyrglyalaglyalagly

455460465

glyalaalapheproargthrlysaspgluargargaspaspleu

470475780

phevalgluserleuleucys

485487

<210>3

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr引物f1的核苷酸序列。

<400>3

atggcgtcctcgacgggg18

<210>4

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr引物r1核苷酸序列。

<400>4

ctagcagaggagcgactcgacg22

<210>5

<211>39

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr引物f2的核苷酸序列。

<400>5

gttacttctgcactaggtaccatggcgtcctcgacgggg39

<210>6

<211>43

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr引物p2的核苷酸序列。

<400>6

tcttagaattcccggggatccctagcagaggagcgactcgacg43

<210>7

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr引物f3的核苷酸序列。

<400>7

tgcgcccaagctgcatcat19

<210>8

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr引物r3的核苷酸序列。

<400>8

tgaactcaccgcgacgtctgt21

<210>9

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr引物f4的核苷酸序列。

<400>9

tcgctgacggagctgatg18

<210>10

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr引物r4的核苷酸序列。

<400>10

acttgaggtgggaggacttg20

<210>11

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr引物f5的核苷酸序列。

<400>11

ctccaccttctccgctcag19

<210>12

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr引物r5的核苷酸序列。

<400>12

gccgctccgtctcttcc17

<210>13

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr引物f6的核苷酸序列。

<400>13

tggcgacattgagaagattgc21

<210>14

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr引物r6的核苷酸序列。

<400>14

cagaaggcgatgacattgacc21

<210>15

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr引物f7的核苷酸序列。

<400>15

agaccttcaacacccctgctatg23

<210>16

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr引物r7的核苷酸序列。

<400>16

tcacgcccagcaaggtcg18

<210>17

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr引物f8的核苷酸序列。

<400>17

ggcattccagtcgtacctctgagc24

<210>18

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr引物r8的核苷酸序列。

<400>18

aaacgctcagaggtacgactggaa24

<210>19

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr引物f9的核苷酸序列。

<400>19

gccgagctggaggacgggtacaac24

<210>20

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr引物r9的核苷酸序列。

<400>20

aaacgttgtacccgtcctccagct24

<210>21

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr引物f10的核苷酸序列。

<400>21

agaccttcaacacccctgctatg23

<210>22

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr引物r10的核苷酸序列。

<400>22

tcacgcccagcaaggtcg18

<210>23

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr引物u-f的核苷酸序列。

<400>23

ctccgttttacctgtggaatcg22

<210>24

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr引物grna-r的核苷酸序列。

<400>24

cggaggaaaattccatccac20

<210>25

<211>38

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr引物b1'的核苷酸序列。

<400>25

ttcagaggtctctctcgcactggaatcggcagcaaagg38

<210>26

<211>37

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr引物b2的核苷酸序列。

<400>26

agcgtgggtctcgtcagggtccatccactccaagctc37

<210>27

<211>38

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr引物b2'的核苷酸序列。

<400>27

ttcagaggtctctctgacactggaatcggcagcaaagg38

<210>28

<211>37

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pcr引物bl的核苷酸序列。

<400>28

agcgtgggtctcgaccgggtccatccactccaagctc37