三七MYB转录因子基因PnMYB2及其应用的制作方法

本发明涉及分子生物学以及基因工程相关研究领域，特别是一种三七myb转录因子基因pnmyb2及其应用。

背景技术：

植物在生长发育过程中，会不断地遭遇来自外界的各种自然灾害和病虫害，从而导致粮食作物、经济作物以及药用植物等生长发育不良，减产甚至绝收的现象。植物病害分为非侵染病害和侵染病害。侵染病害由真菌、细菌、病毒等生物因素引起，具有传染性，危害大，持续时间长。植物病原菌种类繁多，防治特别困难。病害防治的传统方法主要是使用农药和培育优良品种。但是在使用农药的过程中，人畜的安全问题和环境污染的问题很难解决。培育优良品种使用的传统育种方法，时间长、见效慢、投入巨大、抗病资源难以获得。这两种方法都不能很好的解决植物病害问题。而基因工程利用分子生物学技术可以快速培育抗病害植物品种，安全、便捷，是增强植物抗病能力的新方法。

在自然选择和生物进化的过程中，植物形成特有的调控基因表达的分子机制。调控机制分为三个水平，分别为转录水平的调控；转录后水平的调控和翻译水平的调控。转录因子（transcriptionfactor，tf）是一类能够结合在基因上游特异序列，并调控基因转录的蛋白质。植物体内有bhlh、bzip、zinc-finger、myb等多种转录因子蛋白家族，其中myb作为最大的一类转录因子备受瞩目。

植物转录因子myb是一类调控植物生长发育，参与细胞周期、代谢以及对生物、非生物胁迫应答活动的转录因子。植物中第1个myb基因是1987年从单子叶植物玉米(zeamays)中分离鉴定出来的zmmybci基因。myb在植物中普遍存在，因其结构上有一段保守的dna结合区，即myb得名。这个保守结构域由1到3个不完全相同的r(r1、r2、r3)结构域串联组成。根据保守结构域的不同组成将myb转录因子分为4类：1r-myb/myb-related；r2r3-myb；3r-myb；4r-myb（薛英喜,魏建华,姜廷波等.植物次生生长相关myb转录因子研究进展.安徽农业科学,2012,40(13):7650-7655）。r结构包含的保守氨基酸以螺旋-转角-螺旋(helix-turn-helix,hth)的形式参与基因的转录。

myb转录因子参与植物生长发育、次生代谢、生物和非生物胁迫防御反应、响应植物激素处理（牛义岭,姜秀明,许向阳.植物转录因子myb基因家族的研究进展.分子植物育种,2016,14(8):2050-2059）。将来自青蒿(artemisiaannua)的myb基因aamyb1转入野生青蒿过量表达，结果转基因阳性植株的青蒿素含量较野生型显著提高，毛状体的增殖也很明显（matías-hernándezl,jiangw,yangketal.aamyb1anditsorthologueatmyb61affectterpenemetabolismandtrichomedevelopmentinartemisiaannuaandarabidopsisthaliana.plantjournal,2017,90(3):520-534）。将t-dna插入拟南芥mybh基因，得到mybh1突变体，结果突变体叶片的衰老较野生型出现延迟现象（huangck，lopc，huanglf,etal.asingle-repeatmybtranscriptionrepressor,mybh,participatesinregulationofleafsenescenceinarabidopsis.plantmolecularbiology,2015,88(3):269-286）。利用转基因技术将来自麻疯树(jatrophacurcas)的jcmyb2转入拟南芥(arabidopsisthaliana)过量表达，分别对转基因和野生型株系进行盐胁迫和低温胁迫处理，结果转基因株系的存活率均高于野生型，即jcmyb2的过表达提高了拟南芥的耐盐性和耐低温性（pengx，liuh，wangd,etal.genome-wideidentificationofthejatrophacurcasmybfamilyandfunctionalanalysisoftheabioticstressresponsivegenejcmyb2.bmcgenomics,2016,17:251）。从菊花(chrysanthemummorifolium)中分离出cmmyb19，并采用real-timepcr检测菊花在受到蚜虫(macroaiphoniellasanborni)取食后cmmyb19的表达水平变化，结果在蚜虫取食后6h,9h以及24hcmmyb19的表达水平较之正常植株有不同程度的上调（wangy，shengl，zhanghetal.cmmyb19over-expressionimprovesaphidtoleranceinchrysanthemumbypromotingligninsynthesis.internationaljournalofmolecularsciences,2017,18(3):619）。

分别用不同浓度的盐(salt)、水杨酸(salicylicacid，sa)和茉莉酸甲酯(methyljasmonate，meja)处理甜樱桃(prunusavium)幼苗后检测pacmyba的表达水平，qpcr结果表明盐胁迫处理后1hpacmyba被诱导表达并在处理后的6h表达量达到最高，是未处理对照组的5.5倍。另外sa和meja处理后pacmyba的表达水平在整个取样期间都呈现逐步升高的趋势，在处理后12hpacmyba的表达量分别是对照组的5.2倍和8.7倍。以上数据证明pacmyba响应盐、水杨酸和茉莉酸甲酯胁迫处理。利用基因工程的方法将pacmyba转入拟南芥进行异源表达。用250mmnacl分别处理转基因和野生型拟南芥7天后发现植株生活状态出现明显差异，野生型拟南芥叶片萎蔫，生长完全被抑制，而转基因拟南芥生长状态良好，表明外源pacmyba提高了拟南芥对盐胁迫的耐受性。用细菌病原体pseudomonassyringepv.tomato(pst)的模式菌株dc3000孢子悬液处理野生型和转基因拟南芥，pacmyba的过表达抑制了细菌的生长；台盼蓝染色结果显示野生型株系叶片的病害症状更加明显。正常条件下转基因株系中过氧化物酶的活性比野生型要高，病原菌处理后氧化物酶的活性都升高，转基因株系的酶活性依旧较野生型高。综上，pacmyba的过表达提高了转基因拟南芥植株对pstdc3000的抗性（shenx，guox，guoxetal.pacmyba,asweetcherryr2r3-mybtranscriptionfactor,isapositiveregulatorofsaltstresstoleranceandpathogenresistance.plantphysiologyandbiochemistry,2017,112:302-311）。

本发明中myb基因pnmyb2来自三七(panaxnotoginseng)，三七是云南省的重要中药资源，具有“生打熟补”的功效。三七生长周期长，性喜温暖阴湿，病害严重，特别是根腐病、黑斑病、圆斑病等真菌病害，严重危害三七产量和药材的品质。因此，对于三七抗病相关基因的克隆、功能分析和应用研究尤为迫切。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种三七myb转录因子基因pnmyb2及其pnmyb2的应用，即在提高烟草对葡萄座腔菌(botryosphaeriadothidea)、茄腐镰刀菌(fusariumsolani)、尖孢镰刀菌(f.oxysporum)、轮枝镰刀菌(f.verticillioides)、人参链格孢(alternariapanaxwhetz)抗性中的应用。

本发明从三七中克隆获得的具有抗真菌活性的myb转录因子基因pnmyb2的全长基因，pnmyb2的核苷酸序列如seqidno：1所示，该基因全长为1209bp，包含一个864bp的开放阅读框、151bp的5′非翻译区(untranslatedregion,utr)及194bp的3′utr，编码如seqidno：2所示氨基酸序列的蛋白质。

本发明所述myb转录因子基因pnmyb2的编码区是序列表seqidno：1中第152-1015位所示的核苷酸序列。

本发明分离克隆三七的一个抗真菌相关基因的完整cdna片段，通过根癌农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)介导将目的基因转入受体植物中过量表达，并通过进一步实验验证该基因是否具有抗真菌的活性，为后期利用该基因改良烟草及其他植物抵御真菌病害的能力奠定基础；发明人将这个基因命名为pnmyb2。

本发明涉及分离包含pnmyb2的dna片段并鉴定其功能，其中所述dna片段如序列表所示，pnmyb2全长cdna为1209bp，包含一个864bp的开放阅读框、151bp的5′非翻译区(untranslatedregion,utr)及194bp的3′utr，其中orf编码一个具有287个氨基酸的蛋白质。blastn分析结果显示pnmyb2的部分序列与牵牛(ipomoeanil)转录阻遏基因(xm_019328930)具有86%的相似性，与茶树(camelliasinensis)的转录因子蛋白基因(hq660373.1)具有84%的相似性，与巨桉(eucalyptusgrandis)的转录阻遏基因(xm_010063679)具有82%的相似性。蛋白质同源性分析表明pnmyb2编码的蛋白质序列与黄瓜(daucuscarota)、茶树的转录因子蛋白分别具有69%和64%的相似性。pnmyb2编码的蛋白质序列具有myb超家族的保守结构域，这表明其属于三七中的myb蛋白。超表达序列表seqidno：1所示序列可以增强烟草对葡萄座腔菌、茄腐镰刀菌、尖孢镰刀菌、轮枝镰刀菌、人参链格孢的抗性。

上述pnmyb2基因可以应用于提高烟草的抗真菌特性，具体操作如下：

(1)采用扩增pnmyb2的特异引物，从接种茄腐镰刀菌后12h的三七根中提取总rna，通过逆转录-聚合酶链式反应(reversetranscription-polymerasechainreaction，rt-pcr)扩增出pnmyb2的全长编码区，然后将其连接到pgem-t载体上，经测序获得具有目的基因的克隆；

(2)用限制性内切酶ecori和bamhi酶切pgem-t-pnmyb2载体和植物表达载体pcambia2300s，通过胶回收得到目的基因片段和载体大片段；再将所获得pnmyb2基因片段与pcambia2300s载体片段连接，构建植物超表达载体；之后将所构建的重组载体通过根癌农杆菌介导转入烟草中表达；

(3)重组载体t-dna上具有卡那霉素抗性基因，用添加卡那霉素的分化培养基筛选转化子，并通过pcr以及rt-pcr检测得到真正的转基因植株，分析转基因植株对于植物病原真菌的抗性，最后筛选出对真菌抗性明显增强的转基因植株。

本发明为提高植物对真菌病害的抗性提供了一种新的方法，通过基因工程手段培育抗病植物可以克服传统育种的不足，不仅育种周期缩短，而且操作简单，容易获得高抗材料；本发明中来自三七的pnmyb2基因能增强植物对几种病原真菌的抗性，将该基因导入烟草中，可以产生具有真菌抗性的新品种和新材料。利用基因工程技术培育抗性植物品种和材料具有明显的优势和不可取代的重要性。它不仅可以为大规模生产作物、花卉、药用植物等提供方便，减少化学农药的使用，还可以为农业生产节约成本、减少环境污染，因此本发明具有广阔的市场应用前景。

附图说明

图1是本发明中部分pnmyb2转基因烟草基因组dna的pcr检测结果，其中marker：dl2000dnamarker(大连宝生物)，由2,000bp、1,000bp、750bp、500bp、250bp以及100bp六条dna片段组成；阳性对照：质粒pgem-t-pnmyb2为模板的pcr反应；wt：非转基因烟草(野生型)总dna为模板进行的pcr；

图2是本发明中部分阳性pnmyb2转基因烟草中pnmyb2转录水平的表达分析结果图，其中marker：dl2000dnamarker(大连宝生物)；wt：非转基因烟草总rna逆转录cdna为模板的pcr产物；阳性对照：质粒pgem-t-pnmyb2为模板的pcr产物；

图3是本发明中pnmyb2转基因烟草体外抗真菌活性的抑菌效果图；其中a、b、c、d、e图示中的真菌分别是尖孢镰刀菌、轮枝镰刀菌、葡萄座腔菌、茄腐镰刀菌、人参链格孢；wt为野生型烟草的总蛋白；buffer为空白对照，即无蛋白对照(用于提取蛋白的缓冲液)。

具体实施方式

下面通过附图和实施例对本发明进一步说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，本实施例中方法如无特殊说明的均按常规方法操作，所用试剂如无特殊说明的采用常规试剂或按常规方法配置的试剂。

实施例1：pnmyb2全长cdna克隆以及序列分析

用茄腐镰刀菌接种三七的根，用接种后12h的根提取总rna，用液氮将处理过的三七的根研磨成粉末，然后转入离心管中，采用异硫氰酸胍法提取总rna；采用m-mlv逆转录酶(promega)以总rna为模板合成cdna第一链，反应体系和操作过程为：取5μg总rna，依次加入50ngoligo(dt)、2μldntpmix(2.5mmeach)，用depc水将反应体积补齐至14.5μl；混匀后，70℃加热变性5min后迅速在冰上冷却5min，然后依次加入4μl5×first-standbuffer、0.5μlrnasin(200u)、1μlm-mlv(200u)，混匀并简短离心，42℃温浴1.5h，取出后70℃加热10min，终止反应；cdna第一链合成后置于-20℃保存备用。

以合成的第一链cdna为模板，扩增目的基因pnmyb2，所用上下游引物序列分别为5’gagctagaagaaattgacgacgatg3’及5’gagtacagttctattcattttcccaac3’。采用advantage^tm2pcrenzyme(clontech)扩增出目的基因。pcr反应条件：95℃1min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，32个循环；72℃5min。反应体系(20μl)为1μlcdna、2μl10×advantage2pcrbuffer、1.8μldntpmix(10mmeach)、0.2μl正向引物(10μm)、0.2μl反向引物(10μm)、0.2μladvantage2pcrpolymerasemix、14.6μlpcr-gradewater。pcr结束后，取8μl进行琼脂糖凝胶电泳，用以检测扩增产物的特异性以及大小。

所得到pcr产物只有一条dna带，直接对pcr产物进行ta克隆，使用的试剂盒为pgem-tvectorkit(promega)，反应体系和操作过程为：取1.5μlpcr产物，依次加入1μlpgem-tvector(50ng/μl)和2.5μl2×ligationsolutioni，混匀后置于16℃过夜反应。通过热激转化法将连接产物转入大肠杆菌dh5α感受态中。用含有氨苄青霉素(ampicillin，amp)的lb固体培养基筛选阳性克隆。挑选若干个单菌落，摇菌后用扩增pnmyb2的特异引物检测多克隆位点插入pnmyb2的克隆。将得到的阳性克隆进行测序，最终获得的pnmyb2全长cdna为1209bp，通过ncbiorffinder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)分析发现其包含一个864bp的开放读码框(见序列表)。pnmyb2编码一个含287个氨基酸的蛋白质pnmyb2，其分子量约为32.6kda，等电点为9.16。借助生物信息学软件signalp4.1分析pnmyb2编码的蛋白序列，检测其是否具有n端信号肽。结果显示在pnmyb2中没有信号肽，因此推测pnmyb2蛋白不是分泌蛋白。

实施例2：植物超表达载体构建

采用sanprep柱式质粒dna小量抽提试剂盒(上海生工)提取插入pnmyb2的大肠杆菌质粒pgem-t-pnmyb2以及植物表达载体pcambia2300s质粒，取1μl用于琼脂糖凝胶电泳以检测所提取质粒的完整性及浓度高低。用限制性内切酶bamhi和ecori分别对质粒pgem-t-pnmyb2和pcambia2300s进行双酶切(100μl体系)，反应体系和操作过程为：分别取20μlpgem-t-pnmyb2和pcambia2300s质粒、依次加入10μl10×hbuffer、5μlecori、5μlbamhi、60μlddh2o，混匀后短时离心，置于37℃过夜反应。将所有酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后使用试剂盒对pnmyb2片段和pcambia2300s载体大片段分别进行胶回收，取1μl回收产物通过琼脂糖凝胶电泳检测回收片段的大小以及浓度，置于-20℃保存备用。

利用t4dnaligase(takara)，将回收的pnmyb2dna片段和pcambia2300s载体片段连接起来，反应体系(20μl)和操作过程为：取10μlpnmyb2dna片段依次加入2μlpcambia2300s载体dna、2μl10×t4dnaligasebuffer、1μlt4dnaligase、5μlddh2o，混匀后短时离心，然后16℃水浴过夜反应。接着采用热激转化法将连接产物转入大肠杆菌dh5α中，用含有50mg/l卡那霉素(kanamycin，km)的固体培养基筛选阳性克隆。挑选单菌落摇菌，以菌液为模板用扩增pnmyb2的特异引物进行pcr，挑选出pnmyb2与pcambia2300s成功连接的克隆，在得到的阳性菌株中加入甘油并置于-80℃保存备用。

采用试剂盒提取并纯化上述大肠杆菌dh5α中的pcambia2300s-pnmyb2质粒。随后用液氮冻融法将上述构建的植物表达载体pcambia2300s-pnmyb2转入所制备的根癌农杆菌lba4404感受态细胞中。操作步骤为：取0.2μgpcambia2300s-pnmyb2质粒加入含有200μl感受态细胞的离心管中，轻轻混匀后冰浴5min，随后转入液氮中冷冻1min，然后迅速置于37℃水浴5min，再冰浴2min，之后加入500μllb液体培养基于28℃振荡培养4h。将活化后的农杆菌涂于含有50mg/lkm的lb固体培养基上，28℃倒置培养。挑选单菌落摇菌，再用扩增pnmyb2的特异性引物进行pcr反应，检测pcambia2300s-pnmyb2是否转入农杆菌中。对于阳性克隆，加入甘油后置于-80℃保存备用。

实施例3：农杆菌介导的植物遗传转化以及转基因植物筛选

本实验的转基因受体是烟草(nicotianatabacum)。将烟草种子用75%的酒精浸泡30s，无菌水洗涤后用0.1%的hgcl2浸泡8min，然后再用无菌水洗涤若干次，播种于1/2ms培养基上，28℃暗培养5-8d，发芽后转至光照培养箱(25℃，16h/d光照)，以后每月用ms培养基继代一次。

从-80℃冰箱中取出保存的含有pcambia2300s-pnmyb2质粒的农杆菌lba4404菌种，取20μl接种于5ml含有50mg/lkm和20mg/l利福平的lb液体培养基中，28℃培养至培养基浑浊。吸取1ml浑浊的菌液至含有50mg/lkm的lb固体培养基上，28℃培养48h。随后将lb固体培养基上的农杆菌刮下适量接种于附加有20mg/l的乙酰丁香酮的mgl液体培养基中，28℃振荡培养5-8h以活化农杆菌。

取烟草无菌苗幼嫩叶切成约1cm²的叶盘，完全浸泡于上述含有活化农杆菌的mgl液体培养基中，25℃浸染15min。用无菌滤纸吸干叶盘表面的菌液，将叶盘置于共培养基上，22℃无光条件下共培养2天。烟草转化的共培养基为ms+0.02mg/l6-ba+2.1mg/lnaa+30g/l蔗糖+6g/l琼脂。

将共培养后的叶盘转到加有抗生素的ms筛选培养基中分化成苗，同时筛选转基因植株。烟草筛选培养基为ms+0.5mg/l6-ba+0.1mg/lnaa+30g/l蔗糖+6g/l琼脂+50mg/lkm+200mg/l头孢霉素(cefotaximesodiumsalt，cef)；筛选培养时将培养瓶转移至光照培养箱培养(25℃，16h/d光照，8h/d黑暗)。待烟草长出芽后用含有50mg/lkm和200mg/lcef的ms培养基(ms+30g/l蔗糖+6g/l琼脂+)继代培养。

采用ctab法提取转基因烟草植株叶片的基因组dna，取1μl所得基因组dna进行琼脂糖凝胶电泳检测其完整性和浓度。以转基因植株的基因组dna为模板用pnmyb2的特异引物进行pcr反应。pcr结束后，取8μl产物用于琼脂糖凝胶电泳以检测阳性转基因植株。部分烟草转基因植株的扩增结果如图1所示，pnmyb2转基因烟草共筛选到51株阳性转基因植株。

实施例4：转基因烟草中pnmyb2的表达分析以及转基因植株抗真菌活性分析

分别取阳性转基因植株以及非转基因烟草(野生型)的嫩叶提取总rna，逆转录生成cdna第一链，并以此为模板用扩增pnmyb2的特异引物进行pcr，根据pcr结果分析各转基因植株中pnmyb2转录水平的表达量。总rna提取以及rt-pcr的方法与实施例1中相同。pcr结束之后，取8μl用于琼脂糖凝胶电泳，部分单株的检测结果如图2所示，共检测到38个转基因单株中pnmyb2在转录水平大量表达，这些单株的编号为1～38。

将实验室保存的几种真菌接种于pda固体培养基(200g/l马铃薯，15g/l琼脂，20g/l葡萄糖)上，28℃暗培养，待菌落生长至直径约为2~3cm时添加蛋白，分析转基因植株体外抗真菌活性。为了防止其它杂菌污染所提取的蛋白，整个植物蛋白提取过程均是无菌操作。首先取1g转基因烟草单株(编号分别为5、9、16、27)及野生型叶片放入研钵中，加入1ml蛋白提取液(1mnacl，0.1m乙酸钠，1%pvp，ph6.0)，充分研磨。转入1.5ml离心管中，混匀后4℃静置过夜。4℃离心30min(12,000g/min)，取上清于新的1.5ml离心管中，并取适量用紫外分光光度仪测定总蛋白浓度。将转基因和野生型植株的总蛋白浓度调整至0.2μg/μl，然后分别取20μl滴于各真菌培养基的无菌滤纸上。在每个真菌的平板上除了添加不同转基因烟草植株的总蛋白，同时平行添加野生型烟草的总蛋白和空白对照(蛋白提取液)。28℃培养几天后观察真菌生长的情况，并据此来评价pnmyb2转基因烟草的体外抗真菌活性，结果如图3所示，pnmyb2转基因烟草蛋白对葡萄座腔菌、茄腐镰刀菌、尖孢镰刀菌、轮枝镰刀菌、人参链格孢的生长具有明显的抑制作用。

序列表

<110>昆明理工大学

<120>三七myb转录因子基因pnmyb2及其应用

<160>4

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1209

<212>dna

<213>panaxnotoginseng

<220>

<221>mrna

<222>(1)..(1209)

<220>

<221>5'utr

<222>(1)..(151)

<220>

<221>cds

<222>(152)..(1015)

<220>

<221>3'utr

<222>(1016)..(1209)

<400>1

gctttctttcagtcttatctctatatcatcaacaatctacaacagtacacataaggccgc60

ttatccatttactctctctatatatctctcttcctttaagctgtatatatattacagaga120

aaaattaaggagctagaagaaattgacgacgatgggccgttcaccttgctgcgagaaagc180

tcataccaacaaaggcgcctggaccaaagaagaagatcaacgcctcatcaactatatccg240

gcttcacggcgaaggctgctggcgttccctccccaagtccgccggattattgagatgcgg300

gaagagttgcagattacggtggataaactacctccggccagacctcaagagagggaattt360

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ccacatcaaacggaaactcatcagccgtggactcgacccgcaaactcaccggccgctaaa540

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agatggaaactgcagtagcagcacaactgaagaaacacagcaacatcaacaacagcagca720

tcaacaacaatatttcgccaaattccaaaacagtcaagttctagacctcgagttatcgat780

aggactcccgacttcacggactcagactaatgattcctcgttatccgtaaactcaatcga840

gtctaatgttcggcgcgagttcatgatggtggctccgccgttgccagttctgtcaacgac900

ggtggccccacggatgtgtttgtgttggaagttagggtttcagaaaggaggtcagcagca960

gcagcagttgtgtagtaattgcaaaagcacaagtgggttttacagatgttgttgactgtt1020

gggaaaatgaatagaactgtactctagttgttaggttttagatatttaatgtttttattt1080

cttactattactcctaccatcagaatccaccgaatgtaatcaatccatttgcacaccaat1140

atttaatagacaaattataaatagagtggtgaaactaatttctcttaaaaaaaaaaaaaa1200

aaaaaaaaa1209

<210>2

<211>287

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<213>panaxnotoginseng

<400>2

metglyargserprocyscysglulysalahisthrasnlysglyala

151015

trpthrlysglugluaspglnargleuileasntyrileargleuhis

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glygluglycystrpargserleuprolysseralaglyleuleuarg

354045

cysglylyssercysargleuargtrpileasntyrleuargproasp

505560

leulysargglyasnphethrgluglugluaspgluleuileilelys

65707580

leuhisserleuleuglyasnlystrpserleuilealaglyargleu

859095

proglyargthraspasngluilelysasntyrtrpasnthrhisile

100105110

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115120125

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130135140

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145150155160

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165170175

serthrthrglugluthrglnglnhisglnglnglnglnhisglngln

180185190

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195200205

serileglyleuprothrserargthrglnthrasnaspserserleu

210215220

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225230235240

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245250255

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260265270

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275280285

<210>3

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

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<210>4

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

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