一种锌指蛋白转录因子基因RkMSN4及其应用的制作方法

本发明属于生物技术领域和遗传工程领域，涉及一种锌指蛋白转录因子基因rkmsn4及其重组表达载体，具体涉及从红冬孢酵母（rhodosporidiumkratochvilovae）ym25235中克隆的锌指蛋白转录因子基因rkmsn4及将该基因连接到载体转入到酵母菌中，并对其调节酵母菌生产多不饱和脂肪酸的能力进行研究，为多不饱和脂肪酸的大规模生产提供参考。

背景技术：

多不饱和脂肪酸（polyunsaturatedfattyacids，pufas）是指含有两个或两个以上c=c且碳链长度为18～22个碳原子的脂肪酸。根据第一个c=c出现在从甲基原子数起第3个或第6个碳原子上，通常分为n-3和n-6系列。多不饱和脂肪酸具有多种重要的生理功能，包括可降低冠心病、神经退行性疾病的风险。此外，pufas还可以作为很多具有生物活性物质的前体物质，如前列腺素、白三烯和血栓素，这些生物活性物质可以有效缓解炎症、疼痛和发烧。

长期以来人们都在研究如何从动植物油脂中提取pufas，但因为动植物的生长随着季节、地理位置等的影响而不断发生变化，所以pufas含量和构成也随之而变，况且从动植物中提取pufas的成本高，周期长，不能适应市场的需要。另外动植物油脂资源含油量及不饱和脂肪酸类型、比例均受到一定的限制。因此，近年来人们一直在探索利用pufas的新来源---即利用微生物技术来生产pufas。微生物具有发酵周期短、油脂含量高、培养成本低、不受原料控制、对环境的适应性强、生物转化率高等优点。近年来对于脂质积累的研究主要集中于单细胞微生物，如酵母和微藻。

锌指蛋白msn4是一类转录因子，很多研究表明，不同环境胁迫条件下其能促进宿主细胞中胁迫适应相关基因的转录，从而促进宿主对高盐、高渗透压等环境胁迫适应性，但是目前没有锌指蛋白msn4低温条件下促进多不饱和脂肪酸合成的研究报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种锌指蛋白转录因子基因rkmsn4，其参与调节低温环境下红冬孢酵母ym25235抗低温环境关键酶rkd12脂肪酸脱氢酶的活性，使酵母大量产生多不饱和脂肪酸抵御低温环境。该基因是从红冬孢酵母（rhodosporidiumkratochvilovae）ym25235中分离得到，该基因核苷酸序列如seqidno：1所示，该基因序列长为2625bp（碱基），该基因编码的氨基酸序列如seqidno：2所示的多肽或其片段，共编码874个氨基酸。

本发明另一目的是提供一种含有锌指转录因子rkmsn4的重组表达载体，是将seqidno：1所示基因直接与原核表达载体prh2034连接所构建的重组载体prh2034rkmsn4。

本发明另一目的是将锌指蛋白转录因子基因rkmsn4应用在低温下生产多不饱和脂肪酸中。

本发明从红冬孢酵母（rhodosporidiumkratochvilovae）ym25235的总rna基因中分离得到调控红冬孢酵母抗低温环境锌指蛋白转录因子基因rkmsn4，该基因全长2625bp。研究表明锌指转录因子rkmsn4在低温下能提高红冬孢酵母ym25235中催化油酸转化为亚油酸和亚麻酸的δ^12/15-脂肪酸脱氢酶基因rkd12基因的mrna转录水平的提高，从而引起细胞脂中pufas的合成量显著增加；本研究结果有助于阐明产油酵母-红冬孢酵母ym25235中pufas低温合成调节机制，为揭示微生物低温适应性的机制提供参考，将有助于通过基因工程手段对其进行改造来提高多不饱和脂肪酸-亚油酸（la）和α-亚麻酸（ala）的含量，对多不饱和脂肪酸的工业化生产提供有良好的应用前景和经济效益，为大规模商业化生产多不饱和脂肪酸奠定基础。

附图说明

图1为本发明的红冬孢酵母ym25235锌指蛋白转录因子rkmsn4基因pcr扩增图；

图2为利用本发明的红冬孢酵母ym25235锌指蛋白转录因子rkmsn4基因构建的红冬孢酵母表达载体prh2034rkmsn4；

图3为本发明所构建的重组表达质粒prh2034rkmsn4的酶切分析图；其中：1为dnamaker；2为空质粒prh2034bamhi、ecorv双酶切对照；3、4为重组质粒prh2034rkmsn4bamhi、ecorv双酶切；5为rkmsn4基因pcr产物；

图4为低温条件下rkmsn4基因转化的红冬孢酵母ym25235细胞脂肪酸气相色谱分析；a:30℃培养的ym25235/prh2304；b:30℃培养的ym25235/prh2034rkmsn4；

图5为低温条件下rkmsn4基因转化的红冬孢酵母ym25235细胞脂肪酸气相色谱分析；a:15℃培养的ym25235/prh2304；b:15℃培养的ym25235/prh2034rkmsn4。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中使用的试剂和方法，如无特殊说明，均采用常规试剂和使用常规方法。

实施例1：红冬孢酵母（rhodosporidiumkratochvilovae）ym25235锌指蛋白转录因子rkmsn4基因克隆

采用omega试剂盒e.z.n.afungalrnakit提取红冬孢酵母ym25235总rna，反转录试剂盒takarafirststrandcdnasynthesiskit合成cdna。根据红冬孢酵母ym25235的转录组序列设计特异性引物（引物1和引物2）进行pcr扩增；反应所用引物、组份和扩增条件如下：

引物1：rkmsn4-f：5’-aatggatccatggcgcctgctccccgt-3’（seqidno:3）

引物2：rkmsn4-r：5’-atcgatatctcacggcatcgcccacacct-3’（seqidno:4）

（ggatcc为bamhi酶切位点，gatatc为ecorv酶切位点）

pcr扩增体系如下（50μl）：

pcr扩增条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s、64℃退火30s、72℃延伸3min进行30个循环，最后72℃延伸10min。反应完后取产物1μl，然后在浓度为1%的琼脂糖凝胶中进行电泳分析。结果如图1所示，扩增获得大约2700bp大小的片段，然后用百泰克生物技术有限公司多动能dna纯化回收试剂盒回收目的片段，然后将pcr扩增得到的目的基因连接到pmd18-t上，连接产物转化至大肠杆菌dh5α感受态细胞中，用含有氨苄青霉素（amp+）的lb固体平板进行筛选，挑取平板上的转化子进行菌落pcr筛选阳性克隆，然后送去上海生工测序。测序结果表明，获得一段2625bp长的序列，编码874个氨基酸，命名为rkmsn4，序列组成如seqidno:1所示的核苷酸序列和氨基酸序列。

实施例2：重组表达质粒prh2034rkmsn4的构建

采用实施例1中测cdna为模板进行pcr扩增，反应所以引物组合、反应组分和扩增条件如下：

引物1：rkmsn4-f：5’-aatggatccatggcgcctgctccccgt-3’（seqidno:3）

引物2：rkmsn4-r：5’-atcgatatctcacggcatcgcccacacct-3’（seqidno:4）

（ggatcc为bamhi酶切位点，gatatc为ecorv酶切位点）

pcr扩增体系如下（50μl）：

pcr扩增条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s、64℃退火30s、72℃延伸3min进行30个循环，最后72℃延伸10min。将上述pcr获得的基因片段和表达载体prh2034用bamhi和ecorv核酸内切酶进行双酶切，用百泰克生物技术有限公司多动能dna纯化回收试剂盒回收酶切片段，并用t4连接酶在16℃连接过夜，将片段连接到表达载体prh2304上；连接产物转化大肠杆菌dh5α，用含有壮观霉素（spectinomycin）的lb固体平板进行筛选，挑取平板上的转化子进行菌落pcr，筛选阳性克隆，同时进一步对转化子进行双酶切验证分析，结果显示，如图3第3、4泳道所示，用ecorv和bamhi双酶切，重组质粒产生两条带，小分子条带与泳道5中该基因的pcr产物大小一致，大分子条带与泳道2中用相同酶切质粒prh2034后产生的条带大小一致，这表明所构建的重组质粒正确，进一步测序分析也证明这一点；将重组表达质粒命名为prh2034rkmsn4，该质粒图谱如图2所示。

实施例3：rkmsn4基因与低温环境中合成多不饱和脂肪酸实验

1、农杆菌介导转化红冬孢酵母ym25235

采用农杆菌介导转化法将重组质粒prh2034rkmsn4转化至红冬孢酵母ym25235菌株，以含潮霉素b（hygromycinb）终浓度为150µg/ml的ypd培养基筛选转化子；提取基因组dnapcr验证转化子。

2、rkmsn4基因与红冬孢酵母脂肪酸含量变化的分析

将转基因菌株ym25235/prh2034rkmsn4及对照菌株ym25235/prh2304分别先在30℃培养24h后，一份30℃继续培养24h，另一份立即转移至15℃冷处理培养24h；分别提取冷处理后4株菌的细胞中总脂肪酸，并进行甲酯化。将样品进行气相色谱分析，利用面积归一法计算菌株脂肪酸的含量；4株菌的脂肪酸气相色谱分析图谱如图4、5所示，在图中保留时间约为11min为饱和脂肪酸c18:1油酸oa，保留时间约为12.5min为不饱和脂肪酸c18:2亚油酸la，保留时间约为15min为不饱和脂肪酸c18:3亚麻酸ala。从图4、5，我们可以发现，当转基因菌株ym25235/prh2034rkmsn4和对照菌株ym25235/prh2304在30℃条件下，油酸（oa）、la及ala的峰面积大小基本一致；而当转基因菌株ym25235/prh2034rkmsn4和对照菌株ym25235/prh2304在15℃培养后，油酸（oa）的峰面积大小均呈下降趋势，la及ala的峰面积大小均呈上升趋势，且转基因菌株ym25235/prh2034rkmsn4的la及ala的峰面积均大于对照菌株ym25235/prh2304ala的峰面积（图4a:30℃培养的ym25235/prh2304，b:30℃培养的ym25235/prh2034rkmsn4；图5a:15℃培养的ym25235/prh2304，b:15℃培养的ym25235/prh2034rkmsn4）。

根据下表中脂肪酸含量数据，我们可以计算得出，在经15℃培养后，转基因菌株ym25235/prh2034rkmsn4中la和ala含量分别为31.56%和17.32%，相对于同一菌株30℃培养条件下la和ala的含量分别为16.81%和6.14%，变化不明显，但是相比较于15℃培养条件下对照菌株ym25235/prh2304中la和ala的含量（分别为24.18%和8.73%）分别提高了1.31倍和1.98倍，而且oa的含量减少了0.58倍。这些结果表明，在红冬孢酵母ym25235菌株中过表达rkmsn4基因会引起低温条件下la及ala两种多不饱和脂肪酸含量的增加。

表1：15℃条件下rkmsn4转基因红冬孢酵母ym25235细胞总脂肪酸含量

。

序列表

<110>昆明理工大学

<120>一种锌指蛋白转录因子基因rkmsn4及其应用

<160>4

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>2625

<212>dna

<213>rhodosporidiumkratochvilovae

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ctcgacctcgtctcttcgcaaccgtaccctgcgccctccccgtccctccccgccttctcg480

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tcgagcggcatgtccggctcgccgttctcgcgcgccacgtacgcctcgacgaccggcaca600

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<213>人工序列

<400>4

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