一种用于体内示踪和人工清除CAR‑T细胞的标签和应用的制作方法

本发明属于医学生物领域，具体涉及一种生物标签，尤其涉及一种用于体内示踪和人工清除car-t细胞的标签。此外，本发明还涉及该标签的应用。
背景技术：
：肿瘤免疫治疗的理论基础是免疫系统具有识别肿瘤相关抗原、调控机体攻击肿瘤细胞(高度特异性的细胞溶解)的能力。1950年代，burnet和thomas提出了“免疫监视”理论，认为机体中经常会出现的突变的肿瘤细胞可被免疫系统所识别而清除，为肿瘤免疫治疗奠定了理论基础[burnetfm.immunologicalaspectsofmalignantdisease.lancet,1967；1:1171-4]。随后，各种肿瘤免疫疗法包括细胞因子疗法、单克隆抗体疗法、过继免疫疗法、疫苗疗法等相继应用于临床。2013年一种更先进的肿瘤免疫疗法---car-t疗法成功用于临床，并表现了前所未有的临床疗效。car-t，全称是chimericantigenreceptort-cellimmunotherapy，嵌合抗原受体t细胞免疫疗法。该疗法是通过转基因的手段，将启动子、抗原识别区、共刺激因子、效应区等共同组成的嵌合分子，导入t细胞基因组内，从而使t细胞对靶细胞的识别、信号转导、杀伤等功能融为一体，实现了对靶细胞的特异性杀伤[eleanorj.cheadle,etal.cartcells:drivingtheroadfromthelaboratorytotheclinic.immunologicalreviews2014.vol.257:91–106]。car-t疗法在临床上最领先的有诺华的clt019，采用clt019治疗复发难治急性淋巴细胞白血病患者，六个月的肿瘤无进展生存率达到67％，其中最长的应答时间达到两年多。总部位于中国上海的上海优卡迪生物医药科技有限公司与医院合作，截止到2017年2月，共治疗复发难治急性淋巴细胞白血病患者36例，其中完全24例，缓解比例达到66.6％。这是抗癌研究的颠覆性突破。car-t细胞疗法可能是最有可能治愈癌症的手段之一，并被《science》杂志评为2013年度十大科技突破之首。car-t目前在在治疗b-淋巴细胞白血病等几种类型的血液肿瘤方面疗效显著，但是，目前针对car-t细胞的进入体内后的变化以及人工调控还是一片空白。首先，car-t细胞进入体内以后的去向，目前没有合适的手段进行示踪；其次，car-t细胞回输后，不同时间点提取的样本中，很难分离出单独的car-t细胞群体进行各种类型的检测；再次，一旦car-t细胞出现失控的时候，目前没有合适的针对性的手段进行控制；最后，car-t细胞制备的过程中，会有较低的概率混入肿瘤细胞，一旦这种肿瘤细胞被转入car基因后，car基因的表达产物会在肿瘤细胞内部封闭原有抗原，导致肿瘤细胞表达不表达相应抗原，最终导致car-t治疗无效。因此，在car-t细胞治疗中急需要一种可靠的，可以进行体内示踪、体外分离、人工清除的控制方法。cd117是一种细胞因子受体表达于造血干细胞及其它类型细胞的表面。这种受体的不同剪接体可能与某些类型的癌症有关[edlingce,hallbergb(2007)."c-kit--ahematopoieticcellessentialreceptortyrosinekinase".int.j.biochem.cellbiol.39(11):1995–8]。cd117是一种受体酪氨酸激酶iii，它与干细胞因子(一种促进某些类型细胞生长的物质)结合，这种干细胞因子也被称为“钢铁因子”或“c–kit配体”。当受体与干细胞因子(scf)结合时，它会形成一个二聚体，激活其固有的酪氨酸激酶活性，进而磷酸化，激活信号转导分子，在细胞中传播信号。cd117通路传递的信号在细胞存活、增殖和分化中起着重要作用。cd117(c-kit)可以作为三阴乳腺癌(tnbc)的一种重要标志物(kanapathypillaietal.triple-negativebreastcancerisassociatedwithegfr,ck5/6andc-kitexpressioninmalaysianwomen.bmcclinicalpathology2012,12:18)，在未来数年中将会在三阴乳腺癌(tnbc)的car-t治疗上起到重要作用。三阴乳腺癌(tnbc)定义为缺乏雌激素受体(er)、孕激素受体(pr)及her2过度表达或基因扩增的乳腺癌亚型。tnbc预后极差，5年生存率不足15％，且复发迅速，诊断后5年内是死亡高峰。患者脑转移发生率高，可迅速出现远处转移而导致死亡。tnbc的标志物表达情况如下表1所示：表1目前，尚未有克服上述缺点针对cd117的可以进行体内示踪、体外分离、人工清除car-t细胞治疗的相关报道。技术实现要素：本发明要解决的技术问题之一是提供一种用于体内示踪和人工清除car-t细胞的标签，使得car-t细胞在不影响肿瘤杀伤效果的前提下，能够对car-t细胞进行可控的体内示踪、体外分离、人工清除，能极大的提高car-t细胞治疗的安全性，能够为更深入的解析car-t细胞治疗的过程提供有力的工具。本发明要解决的技术问题之二是提供一种包括上述标签的car-t治疗载体。本发明要解决的技术问题之二是提供该载体的构建方法。本发明要解决的技术问题之三是提供该标签的应用。为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：在本发明的一方面，提供一种用于体内示踪和人工清除car-t细胞的标签，包括：如seqidno.18所示序列的示踪铰链trace-linker1、如seqidno.19所示序列的示踪铰链trace-linker2、如seqidno.20所示序列的示踪铰链trace-linker3。该标签可以广泛用于细胞治疗中，效应细胞的体内示踪、体外分离和抗体依赖的人工清除。作为本发明优选的技术方案，所述示踪铰链trace-linker1、trace-linker2、trace-linker3片段，所对应的的抗体药物为利妥昔单抗(rituximab)，所对应的靶点为b-lymphocyteantigen(cd20)。在本发明的第二方面，提供一种car-t治疗载体，包括慢病毒骨架质粒、人ef1α启动子、car嵌合受体结构域；所述慢病毒骨架质粒包括：用于目的菌株大量扩增的含氨苄青霉素抗性基因ampr序列，如seqidno.1所示；用于质粒复制的原核复制子pucori序列，如seqidno.2所示；用于增强真核细胞内的复制的病毒复制子sv40ori序列，如seqidno.3所示；用于慢病毒包装的慢病毒包装顺式元件；zsgreen1绿色荧光蛋白，如seqidno.11所示；ires核糖体结合序列，如seqidno.12所示；用于增强转基因的表达效率的ewpre增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件，如seqidno.13所示；所述人ef1α启动子的序列如seqidno.14所示；所述car嵌合受体结构域包括：如seqidno.15所示的cd8leader嵌合受体信号肽、如seqidno.16所示的cd117单链抗体轻链vl、如seqidno.17所示的cd117单链抗体重链vh、权利要求1所述的任意一种示踪铰链(优选为如seqidno.19所示序列的示踪铰链trace-linker2)、如seqidno.21所示的cd8hinge嵌合受体铰链、如seqidno.22所示的cd8transmembrane嵌合受体跨膜区、如seqidno.25所示的tcr嵌合受体t细胞激活域以及嵌合受体共刺激因子区域；所述嵌合受体共刺激因子区域选自4-1bb、icos、cd27、ox40、cd28、myd88、il1r1、cd70、tnfrsf19l、tnfrsf27、tnfrsf1od、tnfrsf13b、tnfrsf18、cd134等肿瘤坏死因子超家族中的任意一种或多种的组合。作为本发明优选的技术方案，所述慢病毒包装顺式元件采用第二代慢病毒载体或第三代慢病毒载体；所述第二代慢病毒载体包括：如seqidno.5所示的慢病毒5terminalltr、如seqidno.6所示的慢病毒3terminalself-inactivatingltr、如seqidno.7所示的gag顺式元件、如seqidno.8所示的rre顺式元件、如seqidno.9所示的env顺式元件、如seqidno.10所示的cppt顺式元件；所述第三代慢病毒载体包括：如seqidno.5所示的慢病毒5terminalltr、如seqidno.6所示的慢病毒3terminalself-inactivatingltr、如seqidno.7所示的gag顺式元件、如seqidno.8所示的rre顺式元件、如seqidno.9所示的env顺式元件、如seqidno.10所示的cppt顺式元件，以及如seqidno.4所示的rsv启动子。作为本发明优选的技术方案，所述ewpre增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件有6个核苷酸的增强突变，具体为：g.396g>a、g.397c>t、g.398t>c、g.399g>a、g.400a>t、g.411a>t。作为本发明优选的技术方案，所述嵌合受体共刺激因子区域采用如seqidno.23所示的cd28嵌合受体共刺激因子以及如seqidno.24所示的cd134嵌合受体共刺激因子组合。作为本发明优选的技术方案，由所述人ef1α启动子启动整个car结构基因表达，所述cd8leader嵌合受体信号肽位于car编码序列的n端，用于引导car蛋白定位于细胞膜；所述cd117单链抗体轻链vl、cd117单链抗体重链vh，用于识别相应靶抗原；所述cd8hinge嵌合受体铰链用于将scfv锚定于细胞膜外侧；所述cd8transmembrane嵌合受体跨膜区用于将整个嵌合受体固定于细胞膜上；所述cd28嵌合受体共刺激因子用于刺激t淋巴细胞体外激活和体内肿瘤细胞杀伤作用；cd134嵌合受体共刺激因子用于促进t淋巴细胞增殖和因子分泌，增强肿瘤免疫，有利于记忆t细胞的长期存活[helenem.finneyetal.(2004).activationofrestinghumanprimarytcellswithchimericreceptors:costimulationfromcd28,induciblecostimulator,cd134,andcd137inserieswithsignalsfromthetcrζchain.thejournalofimmunology,2004,172:104–113.]；所述tcr嵌合受体t细胞激活域用于激活下游信号通路的表达；当抗原识别区域与靶抗原结合时，信号通过嵌合受体传递至细胞内，从而产生t细胞增殖、细胞因子分泌增加、抗细胞凋亡蛋白分泌增加、细胞死亡延迟、裂解靶细胞等系列生物学效应。作为本发明优选的技术方案，所述的cd117单链抗体轻链vl、cd117单链抗体重链vh均经过人源化改造。在本发明第三方面，提供一种所述的car-t治疗载体的构建方法，包括以下步骤：(1)将如seqidno.1所示的含氨苄青霉素抗性基因ampr序列、如seqidno.2所示的原核复制子pucori序列、如seqidno.3所示的病毒复制子sv40ori序列、用于慢病毒包装的慢病毒包装顺式元件、如seqidno.11所示的zsgreen1绿色荧光蛋白、如seqidno.12所示的ires核糖体结合序列、如seqidno.13所示的ewpre增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件存储于慢病毒骨架质粒上；(2)将如seqidno.14所示的人ef1α启动子、所述car嵌合受体结构域组合成car嵌合受体设计方案，经过酶切、连接、重组反应克隆至慢病毒骨架质粒中，得到第三代car设计的重组慢病毒质粒；(3)将得到的重组慢病毒质粒分别与慢病毒包装质粒ppac-gp、ppac-r以及膜蛋白质粒penv-g共同转染hek293t/17细胞，在hek293t/17细胞中进行基因转录表达后，包装成功重组慢病毒载体会释放到细胞培养上清中，收集包含的重组慢病毒载体的上清液；(4)将得到的重组慢病毒上清采用抽滤、吸附、洗脱的柱纯化方式进行纯化，分别得到重组慢病毒病毒载体。作为本发明优选的技术方案，步骤(4)中，所述抽滤步骤要控制上清体积在200ml～2000ml，控制真空度在-0.5mpa～-0.9mpa，防止由于堵孔带来的载体损失；所述吸附步骤要控制溶液的ph值在6～8，防止ph的变化导致载体失活；所述洗脱步骤要控制洗脱液的离子强度在0.5m～1.0m，防止离子强度的变化导致洗脱不完全或者载体失活。在本发明第四方面，提供所述的标签在制备car-t治疗载体和治疗三阴乳腺癌的药物中的应用。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：嵌合抗原受体(car)是car-t的核心部件(如图1所示)，赋予t淋巴细胞hla非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，这使得经过car改造的t细胞相较于天然t细胞表面受体tcr能够识别更广泛的目标。car的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原(tumor-associatedantigen，taa)结合区(通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scfv段)，一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号转导区。scfv段的设计对于car的特异性、有效性以及基因改造t细胞自身的安全性来是关键的决定因素。本发明所采用的载体骨架可以应用于第三代慢病毒载体结构上，也可以应用于第二代慢病毒载体结构上。第二代和第三代慢病毒载体在结构上的区别如图2b所示。本发明优选第三代慢病毒载体(如图2a所示)，3’sinltr去除了u3区域，消除了慢病毒载体自我复制的可能性，大大提高了安全性；增加了cppt和wpre元件，提高了转导效率和转基因的表达效率；采用rsv启动子保证了慢病毒载体包装时核心rna的持续高效转录；采用人自身的ef1α启动子，使car基因能够在人体内长时间持续表达；本发明采用的scfv段的trace-linker设计，经过蛋白质结构生物信息学数据库(https://www.predictprotein.org/)的分析，通过对蛋白质二级结构、溶剂可接触性、蛋白质柔韧性、二硫键桥、结合位点等蛋白质特性的比较，优选得出。通过流式检测试验以及杀伤效率试验证明，可以有效被相应的抗体药物识别，从而起到体内示踪、体外分离、人工清除的作用。本发明中trace-linker1～trace-linker3片段很短且无需单独表达在细胞表面，有效避免了文献中报道的[michaelc.jensenandstanleyr.riddell.designandimplementationofadoptivetherapywithchimericantigenreceptor-modifiedtcells.immunolrev.2014january；257(1):127–144.]，使用egfr截断体示踪引起的car-t治疗载体宝贵空间被占用以及慢病毒载体转导效率降低的问题。本发明中，cd117单链抗体轻链vl、cd117单链抗体重链vh经过人源化改造，能有效减少体内人抗鼠抗(humananti-mouseantibodies，hama)的产生，延长scfv的半衰期和作用效果，增加car-t细胞的存在时间。本发明采用的转基因载体是重组后的复制缺陷型慢病毒载体，能将外源片段整合入宿主基因，一次性使用，无法复制和增殖，安全可靠。本发明中使用的共刺激因子的一种或若干种组合，能够增加转导后细胞的增殖速率、存活时间、杀伤效率、免疫记忆等特性。本发明采用的car-t细胞由gmp级别的车间生产后，可用于人体临床实验。本发明所采用的car-t细胞标签设计，是在目前传统car-t细胞治疗的基础上，通过对嵌合抗原受体(car)结构的抗原识别区(scfv)的innerlinker区域进行优化改造，使得car-t细胞在不影响肿瘤杀伤效果的前提下，能够对car-t细胞进行可控的体内示踪、体外分离、人工清除，能极大的提高car-t细胞治疗的安全性，能够为更深入的解析car-t细胞治疗的过程提供有力的工具。本发明的示踪铰链trace-linker带有示踪和细胞毒性调控的标签，首先，可以通过含有相应标签抗体的磁珠从样本中分离car-t细胞，用于基因测序、细胞亚型等各种类型检测；其次，可使用含有相应标签抗体的磁珠，在体内通过核磁共振进行car-t实时追踪；再次，可通过相应的抗体药物，通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity，adcc)，对人工改造的car-t细胞进行清除，有力保障细胞治疗的安全性。本发明所采用的针对cd117抗原的car-t技术，是一种综合了肿瘤单克隆抗体的免疫治疗和肿瘤的过继免疫治疗优点的靶向治疗新技术。本发明的重组慢病毒载体可以实现在人t淋巴细胞上表达cd117的靶向嵌合抗原受体，引导并激活t淋巴细胞对cd117阳性细胞的杀伤作用，在临床上可用于治疗三阴性乳腺癌(triple—negativebreastcancer，tnbc)。可见，本发明所述的car-t细胞将给肿瘤细胞治疗提供可靠的保障。附图说明图1是本发明所述的car嵌合受体的示意图，包含了单链抗体scfv、示踪铰链trace-linker、嵌合受体铰链hinge、嵌合受体跨膜区transmembrane、嵌合受体共刺激因子子、嵌合受体t细胞激活域tcr的示意图。图2本发明所述的慢病毒载体结构示意图；其中图2a是本发明采用的第三代慢病毒载体结构示意图，图2b是第二代和第三代慢病毒载体结构比较示意图；图3为本发明实施例1中构建本发明所述的重组慢病毒载体的构建流程图。其中，(a)图是慢病毒骨架质粒plenti-3gbasic的结构示意图；(b)图是3个car质粒的示意图；(c)图是ppac-gp质粒的结构示意图；(d)图是ppac-r质粒的结构示意图；(e)图是penv-g包装质粒的结构示意图；图4是本发明实施例1中car结构的元件顺序示意图，其中，图4a是第三代car的结构示意图，图4b是示踪car结构的质粒编号(carsymbol)的具体元件及顺序列表；图5是本发明实施例1中重组慢病毒质粒pcarl1～pcarl3的酶切预测及酶切琼脂糖凝胶电泳图；其中图5a是pcarl1的酶切预测示意图，图5b是pcarl1的酶切琼脂糖凝胶电泳图；图5c是pcarl2的酶切预测示意图，图5d是pcarl2的酶切琼脂糖凝胶电泳图；图5e是pcarl3的酶切预测示意图，图5f是pcarl3的酶切琼脂糖凝胶电泳图；其中，图5a中lane1是1kbdnaladdermarker：条带从上到下依次为：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp；图5a中lane2是pcarl1的psti酶切预测：条带从上到下依次为：9366bp、1427bp、1000bp、336bp；图5b中lane1是1kbdnaladdermarker的电泳结果；图5b中lane2是pcarl1的psti酶切电泳结果。图5c中lane1是1kbdnaladdermarker：条带从上到下依次为：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp；图5c中lane2是pcarl2的sacii酶切预测：条带从上到下依次为：11276bp、893bp；图5d中lane1是1kbdnaladdermarker的电泳结果；图5d中lane2是pcarl2的sacii酶切电泳结果；图5e中lane1是1kbdnaladdermarker：条带从上到下依次为：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp；图5e中lane2是pcarl3的kpni酶切预测：条带从上到下依次为：8356bp、3869bp；图5f中lane1是1kbdnaladdermarker的电泳结果；图5f中lane2是pcarl3的kpni酶切电泳结果；图6是本发明实施例1中重组慢病毒载体的滴度检测结果示意图；图7为本发明实施例1中所述的car-t细胞构建的步骤流程图，包含分离培养、激活、基因转导、octs-car-t细胞鉴定等阶段；图8是本发明实施例2中car-t细胞的支原体检测结果示意图，其中，lane1为dl2000marker，从上到下条带条带从上到下依次为：2kb、1kb、750bp、500bp、250bp、100bp；lane2为阳性对照；lane3为阴性对照；lane4为pbs；lane5为裂解液；lane6为去离子水；lane7为carl1-t细胞；lane8为carl2-t细胞；lane9为carl3-t细胞；图9为本发明实施例2中流式检测car-t细胞的转导效率结果示意图；其中，图9a表示carl1-t细胞的用一抗和二抗标记后流式检测的转导效率结果；图9b表示carl1-t细胞的仅用二抗标记后流式检测的转导效率结果；图9c表示carl2-t细胞的用一抗和二抗标记后流式检测的转导效率结果；图9d表示carl2-t细胞的仅用二抗标记后流式检测的转导效率结果；图9e表示carl3-t细胞的用一抗和二抗标记后流式检测的转导效率结果；图9f表示carl3-t细胞的仅用二抗标记后流式检测的转导效率结果；图10为本发明实施例3中不同效靶比条件下，carl1-t～carl3-t细胞对cd117+靶细胞杀伤效率比较示意图。图11为本发明实施例4中抗体标记的磁珠为carl1-t～carl3-t细胞的分离效率比较示意图。具体实施方式下面结合具体实施例进一步阐述此发明。应理解的是，在此描述的特定实施方式通过举例的方式来表示，并不作为对本发明的限制。在不偏离本发明范围的情况下，本发明的主要特征可以用于各种实施方式。材料1、慢病毒骨架质粒plenti-3gbasic，慢病毒包装质粒ppac-gp、ppac-r以及膜蛋白质粒penv-g，hek293t/17细胞，同源重组酶，oligoannealingbuffer，支原体检测试剂盒，内毒素检测试剂盒，cd117+k562、k562细胞购自世翱(上海)生物医药科技有限公司；慢病毒骨架质粒plenti-3gbasic的具体制备方法已经公开在发明名称为“一种基于复制缺陷性重组慢病毒的car-t转基因载体及其构建方法和应用”，专利申请号为201610008360.5的专利申请说明书中；2、人新鲜外周血由健康供者提供；3、carl1～carl3dna序列组合由上海优卡迪公司设计(参见图4b)，交给上海捷瑞生物工程有限公司合成，并以寡核苷酸干粉或者质粒形式保存；4、工具酶psti、sacii、clai、ecori、kpni、t4dna连接酶均购自neb公司；5、0.22μm-0.8μmpes滤器购自millipore公司；6、d-pbs(-)、0.4％台盼蓝、筛网、各类型细胞培养皿、培养袋、培养板均购自corning公司；7、opti-mem、pen-srep、hepes、fbs、aim-v、rpmi1640、dmem、lipofectamine3000购自invitrogen公司；8、biotinylatedproteinl购自genescript公司；9、ldh检测试剂盒购自promega公司；10、ficoll淋巴细胞分离液购自ge公司；11、20％人血白蛋白注射液购自杰特贝林公司；12、cryopremium冻存液、分选缓冲液来自上海优卡迪公司；13、ril-2，ril-7，，ril-15，ril-21购自peprotech公司；14、cd3单克隆抗体，cd28单克隆抗体，cd3/cd28磁珠cd4/cd8磁珠购自德国miltenyi公司；15、goatanti-humaniggfc(fitc)购自abcam公司16、dynabeadstmantibodycouplingkit、磁力架、冷冻离心机购自美国thermoscientific公司；17、facs流式细胞仪购自thermo公司；18、rituximab购自哈尔滨嘉美大药房；19、荧光倒置显微镜购自olympus公司；20、0.9％生理盐水购自今迈公司；21、primestar、retronectin购自takara公司；22、phycoerythrin(pe)-conjugatedstreptavidin购自bdbioscience公司；23、质粒抽提试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒均购自mn公司；24、感受态细胞top10购自tiangen公司；25、nacl、kcl、na2hpo4.12h2o、kh2po4、trypsin、edta、cacl2、naoh、peg6000均购自上海生工；26、dneasy试剂盒购自上海捷瑞公司；27、sa-hrp购自上海翊圣公司；28、引物：根据引物设计原则设计扩增dna片段和靶位点所需的引物，该引物由上海生物公司合成，具体为：ef1α-f：5’-attcaaaattttatcgatgctccggtgcccgtcagt-3’(seqidno.26)ef1α-r：5’-tcacgacacctgaaatggaaga-3’(seqidno.27)car-f：catttcaggtgtcgtgaggatccgccaccatggcgctgccggtgac(seqidno.28)car-r：gtaatccagaggttgattgtcgacttagcgcggcggca(seqidno.29)wpre-qpcr-f：5’-cctttccgggactttcgcttt-3’(seqidno.30)wpre-qpcr-r：5’-gcagaatccaggtggcaaca-3’(seqidno.31)actin-qpcr-f：5’-catgtacgttgctatccaggc-3’(seqidno.32)actin-qpcr-r：5’-ctccttaatgtcacgcacgat-3’(seqidno.33)29、本发明中，所述seqidno.1，seqidno.2，seqidno.3，seqidno.4，seqidno.5，seqidno.6，seqidno.7，seqidno.8，seqidno.9，seqidno.10，seqidno.11，seqidno12，seqidno.13，seqidno.14，seqidno.15，seqidno.16，seqidno.17，seqidno.18，seqidno.19，seqidno.20，seqidno.21，seqidno.22，seqidno.23，seqidno.24，seqidno.25所示dna片段由上海捷瑞生物工程有限公司根据本发明人提供的序列合成；实施例1car-t细胞构建一、重组慢病毒载体lvcarl1～lvcarl3的构建、纯化、检测方法。参见图3，本发明所述重组慢病毒载体的构建方法如下：1、将人ef1α启动子、car结构【carl1、carl2、carl3】(carl1、carl2、carl3分别是含有如seqidno.18所示序列的示踪铰链trace-linker1、如seqidno.19所示序列的示踪铰链trace-linker2、如seqidno.20所示序列的示踪铰链trace-linker3的car序列，如图4所示)、克隆至慢病毒骨架质粒plenti-3gbasic，分别得到重组慢病毒质粒pcarl1～pcarl3。(1)将慢病毒骨架质粒plenti-3gbasic使用clai和ecori限制性内切酶进行双酶切，产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳，确认5823bp的片段v1，并割胶回收置于eppendorf管内，用mn公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表2)，并测定产物的纯度和浓度；1、溶胶按200μlnti/100mggel比例加入溶胶液，50℃水浴放置5-10分钟。2、结合dna11000g离心30秒，弃去滤液。3、洗膜加入700μlnt3，11000g离心30秒，弃去滤液。4、洗膜重复第三步一次5、晾干11000g离心1分钟，换新的收集管，室温放置1分钟。6、洗脱dna加入15-30μlne，室温放置1分钟，11000g离心1分钟，收集滤液。表2琼脂糖凝胶回收步骤(2)用引物ef1α-f和ef1α-r以合成的seqidno.14为模板，使用表3中的体系，pcr循环条件为：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃2min)*35cycle，72℃10min。产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳，确认1208bp的片段a，并割胶回收置于eppendorf管内，用mn公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表2)，并测定产物的纯度和浓度；试剂体积(μl)h2o32.55×buffer(withmg2+)10dntp(各2.5mm)4primer1(+)(10μm)1primer2(－)(10μm)1template1primestar0.5表350μlpcr反应体系(3)用引物car-f和car-r以合成的carl1为模板，使用表3中的体系，pcr循环条件为：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃5min。产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳，确认1665bp的片段b，并割胶回收置于eppendorf管内，用mn公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表1)，并测定产物的纯度和浓度；(4)用引物car-f和car-r以合成的carl2为模板，使用表3中的体系，pcr循环条件为：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃5min。产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳，确认1632bp的片段c，并割胶回收置于eppendorf管内，用mn公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表1)，并测定产物的纯度和浓度；(5)用引物car-f和car-r以合成的carl3为模板，使用表3中的体系，pcr循环条件为：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃5min。产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳，确认1635bp的片段d，并割胶回收置于eppendorf管内，用mn公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表1)，并测定产物的纯度和浓度；(6)将重组慢病毒质粒dna片段组合(见表4)以5μl总体积且摩尔比1:1:1的比例加入eppendorf管内，加入同源重组酶反应液15μl，混匀后在42℃孵育30分钟，转移至冰上放置2-3分钟，将反应液加入50μltop10中，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟，将管放到预加温到42℃的恒温水浴锅中热激90秒，快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2-3分钟，每管加900μllb培养液，然后将管转移到37℃摇床上，温育1小时使细菌复苏，取100μl的转化菌液涂布于amplb琼脂平板上，倒置平皿，于恒温培养箱中37℃培养，16小时。重组慢病毒质粒片段组合pcarl1v1、a、bpcarl2v1、a、cpcarl3v1、a、d表4重组慢病毒质粒dna片段组合挑取克隆进行菌落pcr鉴定，鉴定正确的克隆即为重组慢病毒质粒pcarl1～pcarl3，对正确的克隆进行酶切鉴定(见图5)，并送测序复核结果。2、重组慢病毒载体lvcarl1～lvcarl3的包装。(1)完全培养基：取出预热好的新鲜培养基，加入10％fbs+5mlpen-srep，上下颠倒混匀即可；(2)1xpbs溶液：称量nacl8g，kcl0.2，na2hpo4.12h2o3.58g，kh2po40.24g置于1000ml烧杯中，加入900mlmilli-qgrade超纯水溶解，溶解完成后，使用1000ml量筒定容至1000ml，121℃高温湿热灭菌20min；(3)0.25％trypsin溶液:称量trypsin2.5g，edta0.19729g置于1000ml烧杯中，加入900ml1xpbs溶解，溶解完成后，使用1000ml量筒定容至1000ml，0.22μm过滤除菌，长期使用可保存至-20℃冰箱；(4)0.5mcacl2溶液：称量36.75gcacl2用400mlmilli-qgrade超纯水溶解；用milli-qgrade超纯水将总体积定容至500ml，混匀；0.22μm过滤除菌，分装保存到50ml离心管中，每管45ml左右，4℃保存。(5)2xhbs溶液：称量4.09gnacl，0.269gna2hpo4，5.96ghepes，用400mlmilli-qgrade超纯水溶解；校准ph仪后，用2mnaoh溶液将hbs溶液的ph调到7.05。调整每瓶hbs的ph消耗2mnaoh为3ml左右；(6)从液氮罐中取出冻存的hek293t/17细胞，迅速转移到37℃水浴中，1～2min后转移到超净台中，无菌操作将冻存管中的液体全部转移至10cm2培养皿中，补足含10％fbs的dmem至8ml/10cm2dish，24h后显微镜观察细胞，细胞汇合的程度大于80％进行传代；(7)选择细胞状态良好、无污染的hek293t/17细胞，每2-6个培养皿为一组，将细胞胰酶消化后，用电动移液器吸取4-12ml完全培养基，向每个消化后的培养皿中加2ml，避免培养皿变干；使用1ml移液器将所有细胞吹打成单细胞悬液，转移到培养基瓶中；(8)将上述2-6个培养皿中的剩余细胞转移到培养基瓶中，并用培养基再冲洗一便培养皿；(9)盖紧培养基瓶盖，上下颠倒10次左右充分混匀细胞悬液，将细胞传到8-24个10cm2培养皿中，每皿的细胞密度应当约4×106个/10ml完全培养基左右。如果细胞密度和预期的相差较大，则需要对细胞进行计数，然后按照4×106个/皿的量接种；(10)每6个培养皿整理为一摞，注意保持上下皿之间的配合。将培养皿左右，前后晃动数次，使细胞充分铺开，然后放入5％co2培养箱。剩余细胞做同样处理；(11)检查所传代细胞，细胞汇合度应当为70-80％，轮廓饱满，贴壁良好，在细胞培养皿中均匀分布；(12)为细胞换液，将培养基替换为新鲜完全培养基,每皿9ml，并将培养箱的co2浓度设定值提高到8％；(13)按照n+0.5配dna/cacl2溶液。每皿hek293t/17细胞转染质粒量按照下列比例使用：重组慢病毒质粒(20μg),ppac-gp(15μg)，ppac-r(10μg),penv-g(7.5μg)。取一个新的5ml离心管，加入0.5mcacl2：0.25ml，重组慢病毒质粒20μg：ppac-gp15μg：ppac-r10μg：penv-g7.5μg，补充超纯水至0.5ml盖上盖子，充分混匀；(14)另取一支5ml离心管，加入0.5mldna/cacl2溶液。打开涡旋振荡器，一只手拿住5ml离心管的上端，使管底接触振荡头，使液体在管壁上散开流动，另一只手拿一把1ml移液枪，吸取0.5ml2×hbs溶液，缓慢滴加进入离心管，控制流速，以半分钟滴完为宜。2×hbs加入后，继续振荡5秒钟，停止振荡，可直接加入需要转染的细胞中；(15)取一皿细胞，将离心管中的1ml钙转液滴加进去，尽可能使钙转试剂分布到整个培养皿中；(16)钙转液加入后，在皿盖上做好标记，将培养皿放还到另一个5％co2培养箱中。确保培养皿水平放置，每摞培养皿不要超过6个。在5％co2培养箱中放置(6–8h)；(17)将第一个培养箱的co2浓度设定值调回到5％；(18)24小时后，检查细胞状态。细胞汇合度应当为80–85％左右，状态良好。将培养基吸走，更换10ml新鲜的dmem完全培养基；(19)48小时后，观察转染效率。绝大多数细胞仍然是贴壁的。可以看到超过95％细胞都会带有绿色荧光。将同一个病毒包装上清液收集到一起，并向培养皿中继续添加10ml新鲜培养基；(20)72小时后，再次将同一个病毒上清液收集到一起，两次收集的病毒可以放在一起，丢弃培养皿；此时收集的上清里包含了重组慢病毒载体lvcarl1～lvcarl3。3、离子交换色谱法纯化重组慢病毒载体；(1)将收集的上清液使用thermo真空泵，经0.22μm-0.8μm的pes滤器抽滤，除去杂质；(2)按1:1～1:10的比例往上清中加入1.5mnacl250mmtris-hcl(ph6-8)；(3)将2个离子交换柱串联放置，用4ml1mnaoh、4ml1mnacl、5ml0.15mnacl25mmtris-hcl(ph6-8)溶液依次过柱；(4)将步骤2中获得的溶液通过蠕动泵以1-10ml/min的速度给离子交换柱上样；(5)全部上清液过柱后，使用10ml0.15mnacl25mmtris-hcl(ph6-8)溶液清洗一遍；(6)根据上样量使用1-5ml1.5mnacl25mmtris-hcl(ph6-8)进行洗脱，收集洗脱液；(7)将洗脱液分成25到50μl一管，冻存到-80℃冰箱，进行长期保存；4、重组慢病毒载体滴度测定；(1)取24孔板接种293t细胞。每孔细胞为5×104个，所加培养基体积为500ul,不同种类的细胞生长速度有所差异，进行病毒感染时的细胞融合率为40％-60％；(2)准备3个无菌ep管，在每个管中加入90ul的新鲜完全培养基(高糖dmem+10％fbs)接种细胞24小时后，取两个孔的细胞用血球计数板计数，确定感染时细胞的实际数目，记为n；(3)取待测定的病毒原液10ul加入到第一个管中，轻轻混匀后，取10ul加入到第二个管中，然后依次操作直到最后一管；在每管中加入410ul完全培养基(高糖dmem+10％fbs),终体积为500ul；(4)感染开始后20小时，除去培养上清，更换为500μl完全培养基(高糖dmem+10％fbs)，5％co2继续培养48小时；(5)72小时后，观察荧光表达情况，正常情况下，荧光细胞数随稀释倍数增加而相应减少,并拍照；(6)用0.2ml0.25％胰酶-edta溶液消化细胞，在37℃放置1分钟。用培养基吹洗整个细胞面，离心收集细胞。按照dneasy试剂盒的说明抽提基因组dna。每个样品管中加入200μl洗脱液洗下dna并定量；(7)准备目的dna检测qpcrmix总管ⅰ(qpcr引物序列为seqidno.30---seqidno.31)：n＝numberofreactions.例如：总反应数为40，将1ml2×taqmanuniversalpcrmastermix，4μlforwardprimer，4μlreverseprimer，4μlprobe和788μlh2o混和。震荡后放在冰上；(8)准备内参dna检测qpcrmix管ⅱ(qpcr引物序列为seqidno.32---seqidno.33)：2×taqmanmastermix25μl×n10×rnasepprimer/probemix2.5μl×nh2o17.5μl×nn＝numberofreactions.例如：总反应数为40，将1ml2×taqmanuniversalpcrmastermix，100μl10×rnasepprimer/probemix和700μlh2o混和。震荡后放在冰上；(9)在预冷的96孔pcr板上完成pcr体系建立。从总管ⅰ中各取45μl加入到a-d各行的孔中，从总管ⅱ中各取45μl加入到e-g各行的孔中。(10)分别取5μl质粒标准品和待测样品基因组dna加入到a-d行中，每个样品重复1次。另留1个孔加入5μl的水做为无模板对照(no-templatecontrol)。(11)分别取5μl基因组标准品和待测样品基因组dna加入到e-g行中，每个样品重复1次。另留1个孔加入5μl的水做为无模板对照(no-templatecontrol)。(12)所使用定量pcr仪为abiprism7500定量系统。循环条件设定为：50℃2分钟，95℃10分钟，然后是95℃15秒，60℃1分钟的40个循环。数据分析：测得的dna样品中整合的慢病毒载体拷贝数用基因组数加以标定，得到每基因组整合的病毒拷贝数。滴度(integrationunitsperml，iuml-1)的计算公式如下：iuml-1＝(c×n×d×1000)/v其中：c＝平均每基因组整合的病毒拷贝数n＝感染时细胞的数目(约为1×105)d＝病毒载体的稀释倍数v＝加入的稀释病毒的体积数(13)重组慢病毒载体lvcarl1～lvcarl3的滴度结果(如图6所示)；二、carl1-t～carl3-t细胞构建参见图7，本发明所述carl1-t～carl3-t细胞的构建方法如下：1、分离pbmc。(1)抽取健康供者新鲜外周血50ml；(2)将采血袋喷拭酒精两遍，并擦干。(3)用50ml注射器将袋中的血细胞吸出来移至新50ml管中。(4)400g，20℃离心10min。(5)将上层血浆移到新的50ml离心管中，56℃，30min灭活血浆，恢复至室温，2000g，离心30min，取上清到50ml离心管中待用。(6)用d-pbs(-)补至50ml，拧紧盖子，颠倒混匀。(7)取2个新50ml离心管，每管加入15mlficoll淋巴细胞分离液。(8)向每管ficoll上小心加入血细胞稀释液25ml。800g，20℃离心20min。(9)离心管中液体分为四层，从上至下分别为：黄色的血浆层(回收待用)、白膜层、无色透明的ficoll层、红黑色的混合细胞层。(10)小心吸取白膜层到新50ml离心管中，补加d-pbs(-)至50ml，颠倒混匀后500g，20℃离心10min。(11)加入25ml5％人血白蛋白并重悬细胞，400g，20℃离心10min。(12)弃上清，加入25ml5％人血白蛋白重悬细胞沉淀，并过70um筛网，计数。(13)取1份含1.25x108cells用于激活；剩余细胞悬液400g，20℃离心10min，加cryopremium并冻存。2、cd4/cd8阳性t细胞分选。(1)将获得的pbmc计数，以80ul/107cells的比例加入分选缓冲液，重悬细胞沉淀。(2)再以20ul/107cells的比例加入cd4/cd8磁珠，吹打混匀后放入4℃中孵育15min。(3)取出磁珠-细胞混合液，以2ml/107cells的比例加入分选缓冲液，颠倒混匀后，250g，4℃离心10min。(4)以500ul/108cells的比例加入分选缓冲液，重悬细胞沉淀。(5)用镊子夹取ls分离柱到磁力架上。(6)同时准备2个15ml离心管，分别标记：cd4-/cd8-细胞液(a管)、cd4+/cd8+细胞液(b管)。(7)用3ml分离缓冲液润洗ls,并用a管接缓冲液。(8)加入细胞-磁珠混合液，滴完后加入3ml缓冲液冲洗柱子(每次无液体残留时再加入新的液体)，总共三次，收集得到cd4/cd8-细胞。(9)ls分离柱与磁力架分离，用b管接细胞悬液，加入5ml缓冲液，将并用柱子内塞稍用力冲洗，收集为cd4+/cd8+细胞，取样计数。(10)按1x106/ml-4x106/ml的细胞密度用aim-v培养基重悬细胞沉淀，并加入2×105～1×106u/lifn-γ因子。3、t细胞激活。(1)提前一天将1×103ug/l～1×104ug/lcd3单克隆抗体和1×103ug/l～1×104ug/lcd28单克隆抗体加入24孔板，封口膜封口，4℃过夜包被。(2)取出包被的t75瓶，倒掉包被液，用d-pbs(-)洗涤一次，并将分选得到的细胞悬液接种到t75瓶中，摇匀，放入37℃、5％co2培养箱中培养。4、car基因转导及carl1-t～carl3-t细胞诱导培养。(1)提前一天包被1×103ug/l～1×104ug/lretronectin于24孔板内，封口膜封口，4℃过夜包被。(2)往24孔板中，根据每孔5×105细胞量，按moi＝5～20的量，分别加入lvcarl1～lvcarl3慢病毒转基因载体，同时添加含2×105～5×105u/lril-2，5×103ng/l～1×104ng/lril-7，5×103ng/l～1×104ng/lril-15，5×103ng/l～1×104ng/lril-21和含10％自体血清的aim-v培养基37℃、5％co2继续培养。5、car-t细胞体外扩增。(1)每2天等量补加含2×105～5×105u/lril-2，5×103ng/l～1×104ng/lril-7，5×103ng/l～1×104ng/lril-15，5×103ng/l～1×104ng/lril-21和含10％自体血清的aim-v培养基，使ph值维持在6.5～7.5之间，细胞密度维持在5×105～2×106/ml之间，37℃、5％co2继续培养10-14天。(2)第7天左右，冻存培养的carl1-t～carl3-t细胞用于后续检测。实施例2carl1-t～carl3-t细胞病原检测和表达检测。一、内毒素检测；(1)、内毒素工作标准品为15eu/支；(2)、鲎试剂灵敏度λ＝0.25eu/ml,0.5ml/管(3)、内毒素标准品稀释：取内毒素标准品一支，分别用bet水按比例稀释成4λ和2λ的溶解，封口膜封口，震荡溶解15min；稀释时每稀释一步均应在漩涡混合器上混匀30s；(4)、加样：取鲎试剂若干支，每支加入bet水0.5ml溶解，分装至若干支无内毒素试管中，每管0.1ml。其中2支为阴性对照管，加入bet水0.1ml；2支为阳性对照管，加入2λ浓度的内毒素工作标准品溶液0.1ml；2支为样品阳性对照管，加入0.1ml含2λ内毒素标准品的样品溶液(稀释20倍的待测样品1ml+4λ的内毒素标准品溶液1ml＝2ml含2λ内毒素标准品的稀释40倍样品)。样品管中加入0.1ml样品，稀释比例见表5，37±1℃水浴(或培养箱)保温60±1min；表5内毒素稀释比例及对应内毒素含量(5)、carl1-t～carl3-t细胞的内毒素检测结果(如表6所示)，所有细胞的内毒素含量均小于2.5eu/ml，符合《中华人民共和国药典》中小于10eu/ml的标准；表6稀释倍数原液510204080160对应eu/ml0.251.252.55102040carl1-t(+)(-)(-)(-)(-)(-)(-)carl2-t(+)(-)(-)(-)(-)(-)(-)carl3-t(+)(+)(-)(-)(-)(-)(-)二、支原体检测；(1)在实验前三日，细胞样品用无抗生素培养基进行培养；(2)收集1ml细胞悬浮液(细胞数大于1*105)，置于1.5ml离心管中；(3)13000g离心1min，收集沉淀，弃去培养基；(4)加入500ulpbs用枪头吹吸或涡旋振荡，重悬沉淀。13000g离心5min；(5)步骤4重复一次；(6)加入50μlcelllysisbuffer，用枪头吹吸，充分混匀后,在55℃水浴中孵育20min；(7)将样品置于95℃中加热5min；(8)13000g离心5min后，取5μl上清作为模板，25μlpcr反应体系为：ddh206.5μl、mycomix1μl、2xtaqplusmixmaster(dyeplus)12.5μl、模板5μl；pcr循环条件为：95℃30sec，(95℃30sec，56℃30sec，72℃30sec)*30cycle，72℃5min。(9)支原体检测结果显示(如图8所示)，carl1-t～carl3-t细胞中均不含支原体。三、carl1-t～carl3-t基因转导效率检测；(1)收集经病毒转导后的t细胞，用含1～4％人血白蛋白的d-pbs(-)溶液重悬细胞并调整为1×106/ml。(2)向离心管中加入含1～4％人血白蛋白的d-pbs(-)溶液1ml并混匀，350g离心5min，弃上清。(3)重复步骤2一次。(4)用0.2ml的含1～4％人血白蛋白的d-pbs(-)溶液重悬细胞，并向离心管中加入1ul的1ug/ulrituximab(对照孔不加)，1ul1ug/ulgoatanti-humaniggfc(fitc)，混匀，4℃孵育45min。(5)向离心管中加入1ml含1～4％人血白蛋白的d-pbs(-)溶液并混匀，350g离心5min，弃上清。(6)重复步骤5两次。(7)用0.2ml含1～4％人血白蛋白的d-pbs(-)溶液重悬细胞，并向离心管中加入0.2ulpe-sa，混匀，37℃避光孵育15min。(8)向离心管中加入1ml含1～4％人血白蛋白的d-pbs(-)溶液重并混匀，350g离心5min，弃上清。(9)用1mld-pbs(-)溶液重悬细胞沉淀，350g离心5min，弃上清。(10)重复步骤9两次。(11)用0.4mld-pbs(-)溶液重悬细胞沉淀，流式细胞仪进行检测。(12)carl1-t～carl3-t基因转导效率检测结果如图9所示，制备的carl1-t～carl3-t细胞的感染效率位于50％～80％之间，其中carl2-t细胞的感染效率最高，接近80％，可以作为优先选择的示踪标签。实施例3carl1-t～carl3-t细胞的功能检测。一、靶细胞杀伤效果评估。(1)分别培养靶细胞[cd117+k562、k562细胞]和效应细胞[carl1-t～carl3-t细胞]；(2)收集靶细胞4x105cells和carl1-t～carl3-t细胞2.8x106cells，800g，6min离心，弃上清；(3)用1mld-pbs(-)溶液分别重悬靶细胞和效应细胞，800g，6min离心，弃上清；(4)重复步骤3一次；(5)用700ul培养基(aim-v培养基+1～10％fbs)重悬效应细胞，用2ml培养基(aim-v培养基+1～10％fbs)重悬靶细胞；(6)设置效靶比为1:1、5:1、10:1的实验孔，并设置对照组(k562细胞)，每组3个复孔；(7)250g，5min平板离心；(8)37℃，5％co2培养箱中培养4小时；(9)250g，5min平板离心；(10)取每个孔的50ul上清到新96孔板中，并且每孔加入50ul底物溶液(避光操作)；(11)避光孵育25min；(12)每孔加入50ul终止液；(13)酶标仪检测490nm吸光度；(14)将3个复孔取平均值；将所有实验孔、靶细胞孔和效应细胞孔的吸光值减去培养基背景吸光值的均值；将靶细胞最大值的吸光值减去体积校正对照吸光值的均值。(15)将步骤14中获得的经过校正的值带入下面公式，计算每个效靶比所产生的细胞毒性百分比结果如图10所示，carl1-t～carl3-t对靶细胞均有较好的杀伤效果，其中carl2-t细胞的杀伤效率最高；杀伤效率＝(实验孔-效应细胞孔-靶细胞孔)/(靶细胞最大孔-靶细胞孔)x100％(16)上述实验结果表明，示踪标签linker并不会影响car-t细胞的杀伤作用，进而不会影响到car-t在体内的肿瘤治疗效果，为car-t细胞的体内示踪、体外分离、人工清除的提供了前提条件。实施例4carl1-t～carl3-t细胞的示踪标签测试。一、磁珠分离效果评估(根据dynabeadstmantibodycouplingkit试剂盒中提供的步骤制作分离磁珠)。(1)取试剂盒中dynabeadsm-270epoxy60mg置于15ml离心管中，加入1mlc1充分混匀5min；(2)将含有磁珠的离心管置于磁力架上，使磁珠完全吸附于管壁上，弃去上清液；(3)加入600ul1ug/ulrituximab,和2400ulc1与磁珠充分混匀5min；(4)加入3000ulc2进入离心管与溶液充分混匀5min；(5)将离心管置于混匀器上，37℃反应16h～24h。确保管中液体混匀良好，确保磁珠悬浮于溶液中；(6)反应完成1600ulhb充分混匀5min，将离心管置于磁力架上，使磁珠完全吸附于管壁上，弃去上清液；(8)加入1600ullb充分混匀5min，将离心管置于磁力架上，使磁珠完全吸附于管壁上，弃去上清液；；(9)加入1600ulsb充分混匀5min，将离心管置于磁力架上，使磁珠完全吸附于管壁上，弃去上清液；(10)重复步骤9一次；(11)加入1600ulsb充分混匀5min，将离心管室温下置于混匀器上15min，随后将离心管置于磁力架上，使磁珠完全吸附于管壁上，弃去上清液；；(12)将磁珠悬浮于6000ulsb中，抗体标记的磁珠浓度为10mg/ml，4℃保存待用，加入终浓度0.03％的proclin300用于防腐；(13)取carl1-t～carl3-t细胞各1x107cells置于5ml离心管中，分别加入100ul抗体标记的磁珠，吹打混匀后放入4℃中孵育15min；(14)将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附于管壁上，弃去上清；(15)加入1mlpbs重悬磁珠，充分混匀后，将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附于管壁上，弃去上清；(16)重复步骤15一次；(17)加入1mlpbs重悬磁珠，并用血球计数板计数；(18)结果如图11所示，分离效率＝(实际分离细胞量)/(理论分离细胞量)x100％抗体标记的磁珠对carl1-t～carl3-t细胞均有较好的分离效果，其中针对carl2-t细胞的分离效率最高，因此trace-linker2可作为示踪标签应用于car-t细胞治疗中，使用rituximab标记的磁珠通过核磁共振进行体内示踪，使用rituximab标记的磁珠对含car-t细胞的样本进行体外分离car-t细胞，使用rituximab在体内通过adcc对car-t细胞进行人工清除。序列表<110>上海优卡迪生物医药科技有限公司<120>一种用于体内示踪和人工清除car-t细胞的标签和应用<130>hj17-13609<160>33<170>patentinversion3.5<210>1<211>861<212>dna<213>人工序列<400>1atgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcct60gtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgca120cgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgcccc180gaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcc240cgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttg300gttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaatta360tgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatc420ggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgcctt480gatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatg540cctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagct600tcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgc660tcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtct720cgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctac780acgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcc840tcactgattaagcattggtaa861<210>2<211>674<212>dna<213>人工序列<400>2cccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgc60ttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctacca120actctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttcta180gtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgct240ctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttg300gactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgc360acacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagcta420tgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagg480gtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagt540cctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcagggggg600cggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctgg660ccttttgctcacat674<210>3<211>147<212>dna<213>人工序列<400>3atcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttt60tttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgagga120ggcttttttggaggcctagacttttgc147<210>4<211>228<212>dna<213>人工序列<400>4gtagtcttatgcaatactcttgtagtcttgcaacatggtaacgatgagttagcaacatgc60cttacaaggagagaaaaagcaccgtgcatgccgattggtggaagtaaggtggtacgatcg120tgccttattaggaaggcaacagacgggtctgacatggattggacgaaccactgaattgcc180gcattgcagagatattgtatttaagtgcctagctcgatacaataaacg228<210>5<211>180<212>dna<213>人工序列<400>5ggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccac60tgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgt120gtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagca180<210>6<211>234<212>dna<213>人工序列<400>6tgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcac60acaacagacgggcacacactacttgaagcactcaaggcaagctttattgaggcttaagca120gtgggttccctagttagccagagagctcccaggctcagatctggtctaaccagagagacc180cagtacaagcaaaaagcagatcttattttcgttgggagtgaattagcccttcca234<210>7<211>353<212>dna<213>人工序列<400>7atgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattc60ggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcaggg120agctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaa180tactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatata240atacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaag300ctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaa353<210>8<211>233<212>dna<213>人工序列<400>8aggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcctcaat60gacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaattt120gctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagca180gctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcc233<210>9<211>489<212>dna<213>人工序列<400>9tggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgcta60gttggagtaataaatctctggaacagattggaatcacacgacctggatggagtgggacag120agaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagca180agaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtt240taacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggt300aggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattc360accattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaat420agaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatctcg480acggttaac489<210>10<211>119<212>dna<213>人工序列<400>10ttttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataat60agcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaatttta119<210>11<211>696<212>dna<213>人工序列<400>11atggcccagtccaagcacggcctgaccaaggagatgaccatgaagtaccgcatggagggc60tgcgtggacggccacaagttcgtgatcaccggcgagggcatcggctaccccttcaagggc120aagcaggccatcaacctgtgcgtggtggagggcggccccttgcccttcgccgaggacatc180ttgtccgccgccttcatgtacggcaaccgcgtgttcaccgagtacccccaggacatcgtc240gactacttcaagaactcctgccccgccggctacacctgggaccgctccttcctgttcgag300gacggcgccgtgtgcatctgcaacgccgacatcaccgtgagcgtggaggagaactgcatg360taccacgagtccaagttctacggcgtgaacttccccgccgacggccccgtgatgaagaag420atgaccgacaactgggagccctcctgcgagaagatcatccccgtgcccaagcagggcatc480ttgaagggcgacgtgagcatgtacctgctgctgaaggacggtggccgcttgcgctgccag540ttcgacaccgtgtacaaggccaagtccgtgccccgcaagatgcccgactggcacttcatc600cagcacaagctgacccgcgaggaccgcagcgacgccaagaaccagaagtggcacctgacc660gagcacgccatcgcctccggctccgccttgccctga696<210>12<211>575<212>dna<213>人工序列<400>12gcccctctccctcccccccccctaacgttactggccgaagccgcttggaataaggccggt60gtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgccgtcttttggcaatgtgagggccc120ggaaacctggccctgtcttcttgacgagcattcctaggggtctttcccctctcgccaaag180gaatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagac240aaacaacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcc300tctgcggccaaaagccacgtgtataagatacacctgcaaaggcggcacaaccccagtgcc360acgttgtgagttggatagttgtggaaagagtcaaatggctcacctcaagcgtattcaaca420aggggctgaaggatgcccagaaggtaccccattgtatgggatctgatctggggcctcggt480gcacatgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaacgtctaggccccccgaaccacgg540ggacgtggttttcctttgaaaaacacgatgataat575<210>13<211>592<212>dna<213>人工序列<400>13aatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgct60ccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgt120atggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttg180tggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccact240ggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccct300attgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctg360ttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctc420gcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctc480aatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtctt540cgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctg592<210>14<211>1178<212>dna<213>人工序列<400>14gctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggg60gaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtg120atgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcag180tagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacaggtaagtgccg240tgtgtggttcccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgtgccttgaatta300cttccacctggctgcagtacgtgattcttgatcccgagcttcgggttggaagtgggtggg360agagttcgaggccttgcgcttaaggagccccttcgcctcgtgcttgagttgaggcctggc420ctgggcgctggggccgccgcgtgcgaatctggtggcaccttcgcgcctgtctcgctgctt480tcgataagtctctagccatttaaaatttttgatgacctgctgcgacgctttttttctggc540aagatagtcttgtaaatgcgggccaagatctgcacactggtatttcggtttttggggccg600cgggcggcgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgttcggcgaggcggggcctgcgag660cgcggccaccgagaatcggacgggggtagtctcaagctggccggcctgctctggtgcctg720gcctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcggcaaggctggcccggtcggcaccag780ttgcgtgagcggaaagatggccgcttcccggccctgctgcagggagctcaaaatggagga840cgcggcgctcgggagagcgggcgggtgagtcacccacacaaaggaaaagggcctttccgt900cctcagccgtcgcttcatgtgactccactgagtaccgggcgccgtccaggcacctcgatt960agttctcgagcttttggagtacgtcgtctttaggttggggggaggggttttatgcgatgg1020agtttccccacactgagtgggtggagactgaagttaggccagcttggcacttgatgtaat1080tctccttggaatttgccctttttgagtttggatcttggttcattctcaagcctcagacag1140tggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtga1178<210>15<211>63<212>dna<213>人工序列<400>15atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccagg60ccg63<210>16<211>336<212>dna<213>人工序列<400>16gacatcgtgatgacccagagccccgacagcctggccgtgagcctgggcgagcgggccacc60atcaactgccgggccagcgagagcgtggacatctacggcaacagcttcatgcactggtac12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