一株产不饱和脂肪酸的变红镰孢菌(Fusariumincarnatum)A17的制作方法

本发明属于微生物技术领域，更具体地，涉及一株产不饱和脂肪酸的变红镰孢菌(fusariumincarnatum)a17及其应用。

背景技术：

不饱和脂肪酸是碳链未完全被氢原子所饱和的含有一个或多个双键的一类物质，它们不仅具有加强细胞膜的相对流动性、胆固醇的酯化、降低血液粘稠度等生理功能，而且还参与体内脂肪的合成，为人体必需的一类物质。目前，不饱和脂肪酸商业来源主要来自于鱼类和一些农作物原料的提取。但是，这类来源的不饱和脂肪酸生产易受到原料的限制，且提取费用高等缺陷，导致使用成本高。另一方面，有些酵母菌、霉菌、细菌和藻类等微生物在生长代谢过程中，可以利用碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂作为碳源、氮源、辅以无机盐产生并储存油脂，且微生物具有生长快、转化效率高、生产易于管理等优点，已成为获取油脂的重要途径。但是，目前可用于开发的产不饱和脂肪酸的微生物种类偏少，能高产的菌株更是少之又少。因此，迫切需要不断筛选产不饱和脂肪酸微生物，尤其是从特殊生境中寻找。

海洋由于其环境的特殊性与多变性，赋予了海洋微生物不仅在种类丰富，而且在基因组成和功能上也具有其自身的特殊性。因此是获取产量高、组成成份特殊优良菌株的重要来源。南海作为中国最广阔的海域，属于热带海洋性季风气候，以往的研究表明，这里蕴藏着丰富的微生物资源。

技术实现要素：

本发明提供了一株产不饱和脂肪酸的变红镰孢菌(fusariumincarnatum)a17。

本发明同时提供变红镰孢菌(fusariumincarnatum)a17在产不饱和脂肪酸中的应用。

本发明利用选择性培养基及苏丹黑染色方法，从南海徐闻海域马尾藻中筛选高产油脂真菌，并对高产菌株进行鉴定及油脂组成气相色谱法分析(gc)检测，为该菌株产油脂的开发与利用提供一定的参考依据。

本发明的技术目的通过以下技术方案实现：

一株产不饱和脂肪酸的变红镰孢菌(fusariumincarnatum)a17，所述变红镰孢菌(fusariumincarnatum)a17于2016年12月15日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctccno：m2016757。

所述变红镰孢菌fusariumincarnatuma17的its基因序列如seqidno：1所示。

本发明同时保护上述变红镰孢菌(fusariumincarnatum)a17在产不饱和脂肪酸中的应用。

本发明同时提供一种产不饱和脂肪酸的方法，包括如下步骤：

s1.将变红镰孢菌fusariumincarnatuma17接种于种子培养基中，发酵得到种子液；

s2.将s1中种子液接种到发酵培养基中进行发酵培养；

s3.将s2中经过发酵培养的物质离心，去除上清液，收集湿菌体，干燥后得到干菌体；

s4.将s3中干菌体加入盐酸浸泡，水浴后，冷却，加入三氯甲烷，震荡，离心去有机层，加入氯化钠溶液，再次离心，收集不饱和脂肪酸；

所述变红镰孢菌(fusariumincarnatum)a17于2016年12月15日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctccno：m2016757。

优选地，所述s1中发酵为在180r/min摇床震荡，28℃连续培养2天。

优选地，s2中将种子液按4～6％的接种量接种到发酵培养基中。

优选地，s1中所述种子培养基的配置为：将马铃薯200g，葡萄糖20g加入蒸馏水1000ml中。

优选地，s2中发酵培养基的配置为：将葡萄糖150g，酵母膏0.5g，磷酸二氢钾2g，硫酸铵2g，柠檬酸钠0.1g，硫酸锌2g和蒸馏水1000ml混合，ph值为5.8。

优选地，s2中发酵培养的条件为在180r/min摇床震荡，28℃连续发酵5天。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

本发明提供了一株a17菌株，其代谢产物中不饱和脂肪酸含量高达60.76％，其中主要的成分是油酸和亚油酸。其开发和利用价值高，应用前景可观。

附图说明

图1为苏丹黑染色筛选产油脂菌株。

图2为菌株a17的菌落的形态。

图3为菌株a17的显微形态。

图4为菌株a17的系统进化树。

图5为标准样品gc谱图。

图6为菌株a17代谢产物油脂气质色谱图。

具体实施方式

下面通过实施例和附图对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，但不能理解为对本发明保护范围的限制。

除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

实施例1：

1、菌株来源与培养基

全缘马尾藻采集于广东湛江徐闻县海域，装入无菌袋中，低温送至实验室。

所用的主要试剂和仪器为：马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda)购自北京陆桥技术有限责任公司；种子培养基(g/l)：将马铃薯200g，葡萄糖20g，加入蒸馏水1000ml中；发酵培养基(g/l)：葡萄糖150，酵母膏0.5，磷酸二氢钾2，硫酸铵2，柠檬酸钠0.1，蒸馏水1000ml，ph值5.8。itspcr扩增采用通用引its1(tccgtaggtgaacctgcgg)和its4(tcctccgcttattgatatgc)，由上海英俊生物技术有限公司合成。mghtyampdnapolymerasever.2与2×mightyampbufferver购自生物工程(大连)有限公司；苏丹黑购于上海迈坤化工有限公司。

2、全缘马尾藻共附生真菌的分离

取新鲜全缘马尾藻10g，用无菌海水震摇30min后10倍梯度稀释，选取适当浓度的稀释液0.1ml均匀涂布于pda平板，28℃培养3d，挑取形态不同的菌落进行纯培养。将纯化好的菌株斜面保存，同时保存在20％的甘油中，-20℃保存，备用。

3、产油脂菌的筛选

采用苏丹黑染色法对分离纯化的菌株进行产脂菌的筛选，挑取少许菌涂片固定，用0.3％苏丹黑染色15min，二甲苯冲洗，洗脱液无色后再用番红复染，水洗干燥后显微镜观察，若油脂粒呈蓝黑色，菌体呈红色的为产油脂菌。

菌株分离结果：

采用pda培养基平板对徐闻马尾藻进行菌株分离，共筛选到17株菌株。其中菌株a2、a5、a8、a9、a11、a16及a17经苏丹黑染色均不同程度出现蓝黑色，表明为产油脂菌株，而菌株a17着色最深、黑色脂粒最大且较密集，是7株菌中产油脂最高的一株菌(图1)。

4、菌株a17鉴定

4.1形态学鉴定：参考《常见与常用真菌》方法，对目标菌株进行菌落、显微形态等进行观察鉴定。

在pda培养基生长，菌落扩展速度，5d后可达6.1cm，气生菌丝棉絮状，初期白色至淡粉红色，菌落背面粉色，后期菌落变为浅驼色至褐色，基物表面茶褐色，菌落背面深褐色(如图2所示)。

对合成低营养琼脂(sna)培养基上生长7d的孢子进行镜检，结果表明，气生菌丝上产生的大小孢子之间没有明显的界限，大型分生孢子镰刀形、纺锤形，弯曲而近于直，较宽，顶端细胞弯曲(图3，a)。厚壁孢子稀少，呈球形，壁光滑，单顶生或串生于菌丝中间(图3，b、c)，鉴定结果与booth，孔华忠对变红镰孢(fusariumincarnatum)的形态学描述一致。

4.2itsdna序列测定及系统发育树建立：采用真菌its扩增通用引物its1、its4作为正、反向引物，使用mightyampdnapolymerase进行菌落pcr，pcr反应体系与反应条件按照如下方法：pcr反应体系(30ul)：用接种针挑取少量单菌落，2×mightyampbuffer15μl，mightyampdnapolymerase0.75μl，its1(10μmol/μl)0.75μl，its4(10μmol/μl)0.75μl，ddh2o12.75μl。反应条件：98℃预变性2min；98℃变性10sec，55℃退火15sec，68℃延伸1.5min，40个循环；10℃保存10min。1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，将确认的目标产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

根据测得的its基因序列，从cbs和nrrl数据库进行同源性搜索，下载相似性高的模式菌株的相应基因序列，用maxiumlikelihood方法构建系统发育树，并用bootstrap的方法统计所构建系统发育树的可靠性。

菌株a17的its基因序列与亲缘关系较近的已知菌序列进行比对并构建系统发育树(如图4所示)，发现菌株a17的位置是在fusariumincarnatum-equisetispeciescomplex这个复合种里，根据形态与分子鉴定结果，确定菌株为变红镰孢(fusariumincarnatum)。

变红镰孢菌(fusariumincarnatum)a17于2016年12月15日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctccno：m2016757，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内。其its基因序列如seqidno：1所示。

实施例2:菌株产油脂gc分析

将目标菌变红镰孢菌(fusariumincarnatum)a17接种到发酵培养基中，28℃、180r/min摇瓶发酵5d后，将发酵液于5000r/min转速下离心15min，去除上清液，收集湿菌体，称取菌丝体的质量，于80℃恒温烘箱烘干至恒量，得到干菌体。

准确称取0.5g干菌体，加入6mol/l浓度盐酸混合均匀浸泡1h，再用沸水处理5min，-20℃快速冷却20min，加入10ml三氯甲烷-甲醇溶液(体积比1∶1)，放入摇床震荡20min，3000r/min离心15min，吸取三氯甲烷层，加入等体积0.1％氯化钠溶液，混匀，3000r/min离心15min，再收集三氯甲烷层并水浴挥发三氯甲烷层。

油脂甲酯化处理：将上述0.5g干菌体提取的油脂，加入0.6mol/l氢氧化钾-甲醇溶液2ml和正己烷2ml后，剧烈震荡2min，在30℃放置15min，加入蒸馏水5ml，静置分层，取正己烷层分析脂肪酸组成与含量。

gc条件：气相色谱仪agilent7820；气相色谱柱为hp88(安捷伦，60mm×0.25mm×0.25μm)；流速0.8ml/min，分流比10:1进样量1μl程序升温：初始温度，100℃，保持2min，以10℃/min升至150℃，再以2℃/min升温至220℃，保持2min，再以10℃/min升温至230℃，保持1min；载气为氦气，流速0.8ml/min，分流比10:1，进样量1μl。

菌株a17代谢产物提取的油脂经甲酯化后的gc分析(图6)，共出现16个有效峰，根据与混标出峰时间作比较(图5)，检测到6种不饱和脂肪酸，含量占总油脂的60.76％，其中以c18不饱和脂肪酸的油酸与亚油酸为主，分别占总油脂的32.80％、26.20％(见表1)。同时，检测到含量占总油脂39.07％的10种饱和脂肪酸，其中棕榈酸与硬脂酸占36.10％。

表1：变红镰孢菌(fusariumincarnatum)a17代谢产物油脂中各脂肪酸的含量

实施例3：不饱和脂肪酸液体发酵

1.种子液制备

挑取斜面变红镰孢菌(fusariumincarnatum)a17于种子培养基中，种子培养基(g/l)：马铃薯200，葡萄糖20。180r/min摇床震荡，28℃连续培养2d。

2.不饱和脂肪酸液体发酵

按接种量5％的比例将种子液接种到发酵培养基中，发酵培养基(g/l)：葡萄糖150，酵母膏0.5，磷酸二氢钾2，硫酸铵2，柠檬酸钠0.1，硫酸锌2，蒸馏水1000ml，ph值5.8以上。180r/min摇床震荡，28℃连续下在发酵培养基中培养5d。

3菌体收集

将上述发酵好的培养物于5000r/min，离心15min，去除上清液，收集湿菌体，于80℃恒温烘箱烘干至恒量，计算生物量(g/l)，按公式(1)。

本实验结果从发酵液中移取15ml菌液，烘干后得到干菌质量0.77g，

2、油脂的提取

参照实施例2中菌株产油脂的方法，将再收集三氯甲烷层并水浴挥发三氯甲烷层后得到的油脂进行含量计算。计算公式如式(2)。

本实验中称取0.77g干菌提出油脂0.088g。

sequencelisting

<110>广东海洋大学

<120>一株产不饱和脂肪酸的变红镰孢菌（fusariumincarnatum）a17

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<160>3

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