新型嗜热耐碱兼性厌氧菌株和用于降解牲畜尸体的包含上述菌株的微生物剂的制作方法

本公开内容涉及以下方法：使用嗜热耐碱兼性厌氧细菌或微生物剂将感染的牲畜尸体在高温和高速下处理成堆肥，同时降低牲畜尸体处理期间温室气体的产生。

在本公开内容中，将含有嗜热耐碱兼性厌氧菌嗜热脱氮地芽胞杆菌(geobacillusthermodenitrificans)op4(kccm11668p)、嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌(aneurinibacillusthermoaerophilus)op11(kccm11669p)、芽孢杆菌al2(kccm11667p)或它们的混合物的微生物剂经口或肛门注入到牲畜尸体或者将微生物剂与饲料混合并在屠宰之前提供给感染的牲畜以便促进牲畜尸体的降解。

本公开内容提供以下方法：将已经施用微生物剂的牲畜尸体埋葬在堆填区的堆肥层中以及在ph8.5-10的碱性条件下、在40-70℃的高温下迅速降解牲畜尸体以抑制产生甲烷的细菌的活性，从而高速降解牲畜尸体同时使牲畜尸体降解期间的温室气体甲烷的产生最小化。

作为环境技术开发项目/先进环境产业开发项目的一部分，本公开内容已经提交专利申请。详情如下。

提供资金：环境部

赞助：韩国环境工业技术研究所

项目名称：使用嗜热微生物和甲烷氧化细菌在感染的牲畜尸体处理期间同时减少恶臭和温室气体的技术

研究(管理)：崇实大学产学合作基金会(soongsiluniversityfoundationofuniversity-industrycooperation)

研究(委托)：绿色环境综合体(greenenvironmentalcomplex)

项目编号：2014000110009

背景技术：

在通过埋葬处理牲畜尸体的一般方法中，在尸体降解期间温度保持在5-30℃。因为在该温度范围病原微生物仍然活着，所以在埋葬地点应该形成生石灰层。为此，嗜常温菌用于降解埋葬的感染的牲畜。当添加生石灰时，因为降解微生物的活性被抑制，它们表现出缓慢的降解速率，需要长达4-5年的时间来完全降解尸体。因此，埋葬地点附近渗漏的渗滤液可引起二次环境污染，如土壤污染、地下水污染等。另外，缓慢降解阻止埋葬地点的土壤长时间使用。

如果牲畜的尸体(carcassofalivestock)(在下文中称为牲畜尸体(livestockcarcass))在ph8-10的碱性条件下在高温(40-70℃)下降解，不仅可以破坏影响牲畜的传染性病原体(高致病性禽流感、口蹄疫病毒等)，而且还可以破坏常见病原体(大肠杆菌(e.coli)、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、诺如病毒等)。而且，由于快速的生长和代谢速率，嗜热细菌将能够迅速降解牲畜尸体。

本公开内容的发明人一直致力于分离嗜热耐碱兼性厌氧微生物，其可以在ph8-10的碱性条件下在高温(40-70℃)下生长，并且可以迅速降解牲畜的蛋白质和脂肪。因此，他们已经通过向堆肥供应猪脂肪和蛋白质作为唯一碳源进行富集培养而分离了嗜热脱氮地芽胞杆菌op4、嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌op11和芽孢杆菌al2菌株，并且已经确认这些菌株表现出针对牲畜尸体的高生物降解能力。

下面引用的专利文献例示现有技术，并且将其整体并入本公开内容。

相关领域的参考文献

专利文献

(专利文献1)美国专利公开第2004-0079698号(2004年4月29日)。

公开内容

技术问题

本公开内容涉及提供嗜热耐碱兼性厌氧菌株嗜热脱氮地芽胞杆菌op4(登录号：kccm11668p)、嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌op11(登录号：kccm11669p)和芽孢杆菌al2(登录号：kccm11667p)，这些菌株可以在ph8-10的碱性条件下在高温(40-70℃)下生长并且可以促进牲畜尸体的蛋白质和脂肪的降解。

本公开内容还涉及提供降解牲畜尸体的微生物剂，其含有单独的嗜热脱氮地芽胞杆菌op4(登录号：kccm11668p)、嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌op11(登录号：kccm11669p)和芽孢杆菌al2(登录号：kccm11667p)或以上的组合。

本公开内容还涉及提供使用嗜热脱氮地芽胞杆菌op4(登录号：kccm11668p)、嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌op11(登录号：kccm11669p)和芽孢杆菌al2(登录号：kccm11667p)菌株或微生物剂处理牲畜尸体的方法。

本公开内容还涉及提供以下微生物剂，其呈经口或肛门注入到牲畜尸体的液体制剂的形式，或者与饲料混合并在屠宰之前立即提供给感染的牲畜以促进牲畜尸体的降解。

技术方案

本公开内容提供嗜热耐碱兼性厌氧菌株嗜热脱氮地芽胞杆菌op4(登录号：kccm11668p)，其可以在ph8-10的碱性条件下在高温(40-70℃)下生长并且可以促进肉类的蛋白质和脂肪的降解。

本公开内容还提供嗜热耐碱兼性厌氧菌株嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌op11(登录号：kccm11669p)，其可以在ph8-10的碱性条件下于高温(40-70℃)下生长并且可以促进肉类的蛋白质和脂肪的降解。

本公开内容还提供嗜热耐碱兼性厌氧菌株芽孢杆菌al2(登录号：kccm11667p)，其可以在ph8-10的碱性条件下在高温(40-70℃)下生长并且可以促进肉类的蛋白质和脂肪的降解。

本公开内容还提供降解牲畜尸体的微生物剂，其含有嗜热脱氮地芽胞杆菌op4(登录号：kccm11668p)菌株或其培养物作为活性成分。

本公开内容还提供降解牲畜尸体的微生物剂，其含有嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌op11(登录号：kccm11669p)菌株或其培养物作为活性成分。

本公开内容还提供降解牲畜尸体的微生物剂，其含有芽孢杆菌al2(登录号：kccm11667p)菌株或其培养物作为活性成分。

本公开内容还提供降解牲畜尸体的微生物剂，其含有嗜热脱氮地芽胞杆菌op4(登录号：kccm11668p)菌株或其培养物作为活性成分，其还含有嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌op11(登录号：kccm11669p)菌株。

本公开内容还提供降解牲畜尸体的微生物剂，其含有嗜热脱氮地芽胞杆菌op4(登录号：kccm11668p)、嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌op11(登录号：kccm11669p)菌株或其培养物作为活性成分，其还含有芽孢杆菌al2(登录号：kccm11667p)菌株。

本公开内容还提供降解牲畜尸体的微生物剂，其含有嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌op11(登录号：kccm11669p)菌株或其培养物作为活性成分，其还含有芽孢杆菌al2(登录号：kccm11667p)菌株。

本公开内容还提供使用微生物剂处理牲畜尸体的方法。

本公开内容还提供以下微生物剂：其呈经口或肛门注入到牲畜尸体的液体制剂的形式，或者与饲料混合并在屠宰之前立即提供给感染的牲畜以促进牲畜尸体的降解。

有益效果

根据本公开内容，可以使用新型嗜热耐碱兼性厌氧菌株提供降解牲畜尸体的微生物剂，所述新型嗜热耐碱兼性厌氧菌株可以在碱性条件下在高温下生长并且表现出优异的降解牲畜的脂肪和蛋白质的能力。

附图简述

图1显示使用堆肥作为分离源对降解脂肪和蛋白质的需氧和厌氧菌株进行富集培养的结果。

图2显示pcr样品的电泳结果。

图3a和3b显示根据ph和温度的变化分离菌株的相对生长速率。

图4显示使用分离菌株降解瘦猪肉和猪脂肪的结果。

图5显示传代培养的富集培养的菌株的降解蛋白质和脂肪的能力。

图6显示对照组(大肠杆菌)和显示优异的蛋白质/脂肪-降解能力的菌株的透明区和晕圈形成。

最佳方式

在下文中，更详细地描述本公开内容。

本公开内容提供嗜热耐碱兼性厌氧菌株嗜热脱氮地芽胞杆菌op4(登录号：kccm11668p)、嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌op11(登录号：kccm11669p)和芽孢杆菌al2(登录号：kccm11667p)，其可以在碱性条件下在高温下生长并且可以促进肉类的蛋白质和脂肪的降解。

本公开内容的菌株可以在ph8-10下在40-70℃的高温下生长并且可以促进肉类的脂肪和蛋白质的降解。

牲畜尸体的主要组分为蛋白质和脂肪。当它们腐烂时，产生各种恶臭气体作为降解产物。因此，本公开内容旨在得到能够使蛋白质和脂肪降解期间恶臭降解产物的产生最小化的微生物资源，并利用所述微生物资源处理感染的牲畜。在本公开内容中，通过下述实施例中所述的富集培养获得能够迅速降解牲畜尸体并减少温室气体产生的嗜热菌株。

在下文中，通过实施例进一步详述本公开内容。

下述实施例仅旨在说明本公开内容，并不旨在限制本公开内容的范围。

材料和方法

1)菌株分离源和培养基

堆肥用作分离嗜热菌株的分离源。堆肥为在农场准备的牲畜粪便堆肥。猪的脂肪和瘦肉分别用作脂肪和蛋白质来源。在分别添加150g脂肪和瘦肉之后，将堆肥在55℃培养箱中保持5天，使得可以激活降解蛋白质和脂肪的菌株。在需氧和厌氧条件下进行实验。5天之后，在埋葬地点附近取出100g堆肥并将其用作富集培养样品。在将100g样品悬浮于0.8l无机盐培养基并通过沉淀去除固体之后，将上清液用于接种。无机盐培养基的组成为4.765g/lna2b4o7·10h2o、1.352g/lnaoh、3g/lna2hpo4·12h2o和1g/lkh2po4，并且无机盐培养基的ph为9.5。

2)富集培养物和纯菌株的分离

如下进行降解蛋白质和脂肪的菌株的富集培养。降解蛋白质的需氧菌株通过以下培养：将50g瘦猪肉作为蛋白质来源添加至在500ml烧瓶中的含有无机盐培养基的悬浮液(200ml)中，然后在55℃和150rpm下在振荡培养箱中温育10天。降解蛋白质的厌氧菌株通过以下培养：将50g瘦猪肉作为蛋白质来源添加至在1l血清瓶中的含有无机盐培养基的悬浮液(200ml)中，然后在55℃下在振荡培养箱温育10天。类似地，使用50g猪脂肪，在相同条件下，将降解脂肪的需氧菌株和降解脂肪的厌氧菌株培养10天。将培养10天的菌株以5％(v/v)的浓度接种至新鲜培养基中，并通过传代培养3-4代获得富集培养的菌株。在富集培养期间，使用2nnaoh将ph保持在9或更高。用无菌水稀释富集培养的菌株，并通过在营养琼脂培养基上铺板在培养箱中培养来分离纯菌株(单菌落)。

3)分离菌株降解蛋白质和脂肪的能力的评价

使用含有3％明胶的明胶琼脂培养基通过测量透明区来评价富集培养的菌株和分离菌株降解蛋白质的能力。明胶琼脂培养基的组成为23g/l营养琼脂、30g/l猪明胶和30g/l牛明胶。将富集培养的菌株和分离菌株铺板于明胶琼脂培养基上，然后在55℃培养1-2天用于评价。

使用含有wesson油(3％v/v)的酒清蓝琼脂培养基通过分析晕圈形成来评价富集培养的菌株和分离菌株降解脂肪的能力。酒清蓝琼脂培养基的组成为35g/l蓝琼脂和30ml/lwesson油。将蓝琼脂和wesson油分别在121℃灭菌15分钟。将蓝琼脂冷却之后，在凝固之前，将其与wesson油混合，然后倒入培养皿上。将菌株铺板于制备的酒清蓝琼脂培养基中，并在55℃培养1-2天时观察晕圈形成。

为了评价降解蛋白质的菌株降解脂肪的能力，通过将鉴定了降解蛋白质能力的分离菌株培养在酒清蓝琼脂中来评价其降解脂肪的能力。另外，通过将它们培养在明胶琼脂中评价降解蛋白质的能力，以评价降解脂肪的菌株降解蛋白质的能力。另外，将需氧菌株在厌氧条件下培养，并评价其降解蛋白质和脂肪的能力以鉴定其兼性厌氧性。

实施例1：降解菌株的富集培养和活性

使用堆肥作为分离源(图1)对降解脂肪和蛋白质的需氧和厌氧菌株进行富集培养。在控制到55℃的高温和ph为9或更高的培养基条件下，脂肪和蛋白质在需氧和厌氧条件下均迅速被降解。4天之后，降解进行至其形状不再可识别的程度。将富集培养的菌株以5％(v/v)的浓度接种至新鲜培养基中，然后传代培养3-4代。

分别使用营养明胶培养基和酒清蓝琼脂培养基来评价传代培养的富集培养的菌株的降解蛋白质和脂肪的能力(图5)。从图5中可以看出，富集培养的菌株显示良好的降解蛋白质和脂肪的能力。富集培养的降解蛋白质的菌株形成透明区，以及降解脂肪的菌株清晰地形成晕圈。

实施例2:分离菌株降解蛋白质和脂肪的能力的评价

使用营养琼脂培养基，将通过富集培养获得的降解菌株分离为纯菌株，并评价分离菌株降解蛋白质和脂肪的能力。分离出9种需氧蛋白质-降解菌株(op1、op2、op3、op4、op5、op6、op7、op11、op12)、5种厌氧蛋白质-降解菌株(apj1、apj2、apj3、apj4、apj5)、4种需氧脂肪-降解菌株(ol1、ol2、ol11、ol12)和10种厌氧脂肪-降解菌株(als21、als22、alj1、alj2、als1、als3、als12、al1、al2、al3)作为纯菌株。

使用明胶琼脂培养基(3g/l牛肉膏、5g/l蛋白胨、120g/l明胶)评价分离菌株降解蛋白质的能力，并使用酒清蓝琼脂培养基(10g/l酪蛋白酶水解产物、5g/l酵母提取物、0.15g/l酒清蓝、17g/l琼脂)评价降解脂肪的能力。分离菌株的蛋白质-降解能力和脂肪-降解能力总结于表2中。在需氧降解菌株中，7种菌株(op11,op12,op3,op4,op5,op6,op7)显示出优异的蛋白质-降解能力。其中，op11、op12、op3和op4菌株显示出优异的降解脂肪和蛋白质的能力。而且，在表现出脂肪-降解能力的ol菌株中，2种菌株(ol11、ol12)显示出优异的脂肪-降解能力，但它们的蛋白质-降解能力弱。

在厌氧降解菌株中，菌株(apj4、apj5)显示出优异的蛋白质-降解能力。apj4菌株还显示出优异的脂肪-降解能力。而且，在从富集培养的脂肪-降解菌株中分离的al菌株中，al2菌株显示出优异的降解蛋白质和脂肪的能力。

表2

对照组(大肠杆菌)和显示出优异的蛋白质/脂肪-降解能力的菌株的透明区和晕圈形成总结于图6中。

在高温和碱性条件下，分离了总共28种菌株，即14种蛋白质-降解菌株(9种需氧菌株和5种厌氧菌株)和14种脂肪-降解菌株(4种需氧菌株和10种厌氧菌株)。其中，6种菌株(apj4、al2、op11、op12、op3、op4)显示出优异的降解蛋白质和脂肪的能力，apj5菌株显示出优异的降解蛋白质的能力，以及ol12菌株显示出优异的降解脂肪的能力。

实施例3:op4、op11、al2和apj4菌株的鉴定(菌落pcr)

进行16srdna分析以鉴定分离的嗜热耐碱菌株op4、op11、al2和apj4，其可以在ph8-10的碱性条件下在高温(40-70℃)下生长并且可以促进肉类的蛋白质和脂肪的降解。将各菌株的培养物进行系列稀释，并铺板于lb琼脂培养基上。在50℃温育48小时之后，使用移液管尖端将生长的菌落悬浮于30μl0.5nnaoh中。通过在95℃加热15分钟溶解菌落，搅拌，然后离心。重复该程序3次。

通过下文所述的聚合酶链式反应(pcr)扩增提取的基因组dna。扩增中使用的引物和dna样品的量描述于表4中。

表4

在表5所述的条件下进行pcr。

表5

通过blast检索分析纯菌株的部分16srdna序列。pcr样品的电泳结果显示于图2中。

作为部分16srdna序列的分析的结果，op4、op11、al2和apj4菌株分别被鉴定为嗜热脱氮地芽胞杆菌、嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌、芽孢杆菌和芽孢杆菌。菌株的基本序列分别为kp010265.1、kj913706.1、kc493201.1和kf403022.1。

将op4菌株命名为嗜热脱氮地芽胞杆菌op4并在2015年2月11日保藏在kccm(登录号kccm11668p)。将op11菌株命名为嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌op11并保藏在kccm(登录号kccm11669p)。将al2菌株命名为芽孢杆菌al2并保藏在kccm(登录号kccm11667p)。

表6

实施例4:分离菌株的生长温度和ph

将嗜热脱氮地芽胞杆菌op4(登录号：kccm11668p)、嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌op11(登录号：kccm11669p)和芽孢杆菌al2(登录号：kccm11667p)菌株在下述条件下培养以研究存活生长温度和ph。使用补充有20g/l葡萄糖、5g/l胰蛋白胨和1g/l酵母提取物的1l无机盐培养基作为生长培养基。无机盐培养基的组成为0.409g/lmgso4·7h2o、0.0265g/lcacl2·2h2o、1g/lkh2po4、1g/lnh4no3、6g/lna2hpo4·2h2o和0.0833g/lfecl3·6h2o。在将100ml生长培养基添加至250ml锥形瓶(erlenmeyerflask)并将ph调节至7-10之后，将温度从40℃变化至70℃时，将菌株在振荡培养箱中温育。通过测量660nm处培养物的吸光度来测定菌株的相对生长速率(图3a和3b)。所有3种菌株能够在范围为7至10的ph下生长，并且最佳生长ph为8-9(图3a)。而且，所有菌株能够在范围为40至70℃的温度下生长，并且最佳生长温度为60℃(图3b)。

实施例5:用含有分离菌株的微生物剂处理牲畜尸体(蛋白质和脂肪)

将嗜热脱氮地芽胞杆菌op4(登录号：kccm11668p)、嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌op11(登录号：kccm11669p)和芽孢杆菌al2(登录号：kccm11667p)菌株各自0.5ml培养物喷洒在200g瘦猪肉或猪脂肪上。在将ph调节至9.0之后，将猪肉或脂肪放入styrofoam容器中并观察它们的降解(图4)。在降解期间，将温度保持在50℃至65℃。在约5天之后，瘦肉(蛋白质)和脂肪大部分降解。确认了含有该三种菌株的微生物剂可以有效并迅速地降解牲畜尸体(蛋白质和脂肪)。

虽然已经详细描述了本公开内容，但对本领域技术人员显而易见的是，上面的描述仅作为具体示例性实施方案提供，并且本公开内容的范围不限于此。因此，应理解本公开内容的范围由所附权利要求及其等同物限定。

【登录号】

保藏机构：韩国微生物保藏中心

登录号：kccm11668p

保藏日期：2015年2月11日

保藏机构：韩国微生物保藏中心

登录号：kccm11669p

保藏日期：2015年2月11日

保藏机构：韩国微生物保藏中心

登录号：kccm11667p

保藏日期：2015年2月11日

序列表

<110>太阳生物有限公司(sunbioco.,ltd.)

<120>新型嗜热耐碱兼性厌氧菌株和用于降解牲畜尸体的包含上述菌株的微生物剂

<130>hop361-cn

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