一种百合总RNA提取方法与流程

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种rna的提取方法，特别是涉及一种优化的植物百合总rna提取方法。

背景技术：

从植物中提取总rna，是开展植物研究工作的重要前提。高质量的rna是后续rt-pcr以及基因克隆、表达的基础。目前比较成熟的总rna提取方法有trizol法、ctab法和试剂盒法。

trizol法和试剂盒法提取rna试验操作简单，是各种物种提取rna的首选方法。但对于富含多糖和多酚的物种材料，以trizol法提取rna存在污染，而试剂盒法提取的rna则浓度过低。同样，采用ctab法也存在操作复杂耗时、容易污染的不足，不能用于后续基因表达分析及基因克隆等。

百合各组织中富含多糖和多酚物质。由于多糖的许多理化性质与rna很相似，从而在沉淀rna时，往往会产生富含多糖的凝胶状沉淀。这种含有多糖的rna沉淀难溶于水或溶解后产生黏稠状的溶液；而如果采用重复操作去杂的话，在去除多糖的同时，rna也容易被带走，造成rna得率的减少。因此，百合中存在的大量多糖影响了提取rna的质量和浓度。

事实上，富含多糖和多酚物质组织的rna提取都存在此种问题，或者提取方法费时费工，rna容易污染，或者获得的rna量太少，不能满足后续研究的需求。因此，需要开发一种针对含有多糖多酚材料的总rna提取方法，以满足从包括百合在内的、富含多糖多酚器官中提取高质量rna的需求。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种百合总rna提取方法，该方法适合于包括百合在内的、富含多糖多酚器官的总rna提取。

本发明所述的百合总rna提取方法包括：

1）取百合样品置于液氮中，研磨成细粉，以每ml裂解液加0.1g样品的比例加入裂解液中，震荡3min，离心，取上清静置，使核酸蛋白复合物完全分离；

2）在上清中加入所述上清体积20%的氯仿，室温静置3min后，剧烈震荡离心，取上清液，再加入氯仿，重复3次；

3）取上清，加入上清体积50%的异丙醇，室温静置10min后，颠倒混匀后离心，弃除上清，保留底部沉淀；

4）在沉淀中加入等体积的75%乙醇，颠倒混匀，充分洗涤，离心，再加入75%乙醇洗涤1次，自然干燥；

5）将干燥的沉淀以不少于30μl的depc-ddh2o溶解，得到rna提取液。

其中，所述的百合样品是将百合样品离体后置于冰上，液氮速冻后置于-80℃冰箱保存的样品。

本发明上述提取方法中，所述裂解液可以是genstar的trigene、takara的rnaisoplus等各种常规trizol法所使用的裂解液。

在trizol提取法的操作说明书中，使用氯仿提纯样品的操作以及对rna沉淀的洗涤过程均只进行一次，没有重复。因此，完成整个rna提取过程仅需要3h。但是，完全按照trizol说明书方法提取百合的rna后发现，该方法所获得的rna不仅纯度不够，而且污染严重。

而试剂盒法提取rna的过程将样品的裂解与提纯去杂步骤合并在了一起，由此导致一次处理样品的数量减少，虽然用时较短，只有约2h，但每1.5ml管只能获得20ng左右的rna，这样的量不足以满足后续研究的需要。

本发明通过改良的trizol法提取百合总rna，该提取方法中，第2步利用氯仿对样品提纯去杂3次，第4步对rna沉淀洗涤2次，不仅更好地去除了rna样品中的杂质，而且每1.5ml管可以获得100ng左右的rna。

本发明提取方法操作简单、效率高、使用试剂简单，提取rna质量高、浓度高，可用于提取百合各个品种、各个器官的高质量rna。

附图说明

图1是实施例1提取百合总rna的电泳图。

图2是实施例2提取百合总rna的电泳图。

图3是比较例1提取百合总rna的电泳图。

图4是比较例2提取百合总rna的电泳图。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明进行进一步的详细说明。

下述各实施例提取过程中，所使用的各种器具，包括离心管、枪头、研钵、研棒、钥匙等，均要先在121℃灭菌20min。

提取过程中需要的75%乙醇，使用depc-ddh2o配置。

各实施例需要的百合样品是将采集的样品离体后置于冰上，液氮速冻后置于-80℃冰箱中保存的样品。

实施例1

本实施例使用genstar的trigene总rna提取试剂盒提取百合中的rna。

具体操作流程为：

1、在1.5ml离心管中加入1mlgenstar的trigene总rna提取试剂，置于冰上。

2、在液氮中研磨百合样品，研磨过程中样品要一直处于冰冻状态，不可解冻。取0.1g左右研好的样品加入上述离心管中，在涡旋振荡器上震荡3min。

3、4℃下12000×g离心10min，吸取上清至新的离心管中。

4、裂解产物于室温放置5min，使核酸蛋白复合物完全分离。

5、加入0.2ml氯仿，剧烈震荡15s，室温放置3min。

6、4℃下12000×g离心15min，样品分为三层：红色下层，中间薄膜层，以及颜色随样品而变的上层。

7、吸取上层至一新的离心管中，大约0.5ml。

8、再重复步骤5～7两次，其中每次吸取出的上层体积分别为0.4ml和0.3ml。

9、加入0.5ml异丙醇，颠倒混匀，室温放置10min。

10、4℃下12000×g离心10min，弃除上清，得到胶状rna沉淀。

11、加入1ml75%乙醇，颠倒混匀，洗涤沉淀。

12、4℃下7500×g离心5min，弃除上清。

13、重复步骤11～12一次。

14、用移液枪吸取离心管内残余液体，室温晾干10～20min。

15、加入30μldepc-ddh2o，移液枪吹打数次溶解rna。

16、通过rna电泳及核酸仪检测。

17、分装后-80℃保存，避免反复冻融。

以上操作流程共耗时4.5h。

图1给出了本实施例提取的百合总rna的电泳图，从图中可以看出，rna既无降解(无拖尾现象)，也无污染(点样孔无残留)。进而，以核酸仪检测本实施例得到rna的浓度为93.1ng/µl。说明本实施例方法适用于百合总rna的提取。

实施例2

本实施例使用takara的rnaisoplus裂解液替代实施例1中的trigene裂解液，具体操作流程与实施例1完全相同，步骤8中每次吸取出的上层体积分别为0.35ml和0.25ml。操作流程共耗时4.5h。

提取效果如图2所示，核酸仪检测rna浓度为143.6ng/µl。本实施例提取的rna同样既无降解(无拖尾现象)也无污染(点样孔无残留)，适用于百合总rna的提取。

比较例1（试剂盒法）

本实施例使用天根植物总rna提取试剂盒(rnapreppure)提取百合总rna，具体提取过程按照以下步骤进行。

1、取50～100mg百合植物叶片，在液氮中迅速研磨成粉末，加入450μlrl(加入β-巯基乙醇)，涡旋剧烈震荡混匀。

2、将所有溶液转移至过滤柱cs上(过滤柱cs放在收集管中)，以12000rpm离心2～5min，小心吸取收集管中上清至rnase-free的离心管中。

3、缓慢加入0.5倍上清体积的无水乙醇，混匀，将得到的溶液与沉淀一起转入吸附柱cr3中，12000rpm离心30～60s，倒掉收集管中废液，将吸附柱cr3放回收集管中。

4、向吸附柱cr3中加入350μl去蛋白液rw1，12000rpm离心30～60s，倒掉收集管中废液，将吸附柱cr3放回收集管中。

5、向吸附柱cr3中央加入80μldnasei工作液，室温放置15min。

6、向吸附柱cr3中加入350μl去蛋白液rw1，12000rpm离心30～60s，倒掉收集管中废液，将吸附柱cr3放回收集管中。

7、向吸附柱cr3中加入500μl漂洗液rw，室温静置2min，12000rpm离心30～60s，倒掉收集管中废液，将吸附柱cr3放回收集管中。

8、重复步骤7。

9、12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱cr3置于室温放置数min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

10、将吸附柱cr3放入一个新的rnase-free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30～100μlrnase-freeddh2o，室温放置2min，12000rpm离心2min，得到rna溶液。

以上提取过程时长2h。图3提供了所提取百合总rna的电泳效果图。与标记(marker)相比，rna条带亮度明显较低，表明rna浓度较低。核酸仪检测得到rna的浓度仅为33.8ng/µl左右。

比较例2（普通trizol法）

本比较例使用genstar的trigene作为裂解液，以trizol法提取百合总rna，具体提取过程按照以下步骤进行。

1、在1.5ml离心管中加入1mlgenstar的trigene总rna提取试剂，置于冰上。

2、在液氮中研磨百合样品，研磨过程中样品要一直处于冰冻状态，不可解冻。取0.1g左右研好的样品加入上述离心管中，在涡旋振荡器上震荡3min。

3、4℃下12000×g离心10min，吸取上清至新的离心管中。

4、裂解产物于室温放置5min，使核酸蛋白复合物完全分离。

5、加入0.2ml氯仿，剧烈震荡15s，室温放置3min。

6、4℃下12000×g离心15min，样品分为三层：红色下层，中间薄膜层，以及颜色随样品而变的上层。

7、吸取上层至一新的离心管中，大约0.5ml。

8、加入0.5ml异丙醇，颠倒混匀，室温放置10min。

9、4℃下12000×g离心10min，弃除上清，得到胶状rna沉淀。

10、加入1ml75%乙醇，颠倒混匀，洗涤沉淀。

11、4℃下7500×g离心5min，弃除上清。

12、用移液枪吸取离心管内残余液体，室温晾干10～20min。

13、加入30μldepc-ddh2o，移液枪吹打数次溶解rna。

14、通过rna电泳及核酸仪检测。

15、分装后-80℃保存，避免反复冻融。

以上操作流程共耗时3h。提取效果电泳图如图4所示，点样孔残留物较多，说明rna污染严重。

上述3种提取方法比较可知，普通trizol法操作简单，但提取的rna存在污染。试剂盒法虽然不污染，但提取的量不足以满足后继研究的需要。本发明提取方法虽然时长略长，但得到的rna质量高、浓度高，一方面克服了百合各组织因多糖多酚而rna提取困难的难题，另一方面，因为所需试剂简单而节省了资金。

上述实施例仅为本发明的优选技术方案，并不用于对本发明进行任何限制。对于本领域技术人员而言，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。