本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及用于牙髓干细胞提取的源齿筛选方法。
背景技术：
：间充质干细胞来源于多种组织，如骨髓、牙髓、胎盘、脐带和脂肪等，其中来自乳牙牙髓的间充质干细胞具有强大的干性和生物学活性，无排异反应，免疫调节能力强，是非常优秀的生物治疗细胞来源之一。由于来自乳牙牙髓的间充质干细胞取材方便，适宜于大规模培养，因此为牙髓干细胞的产业化奠定了良好基础。由于我国国民产值的不断提高，生活方式不断改善，如今的儿童食谱与过去相比减少了很多较硬的成人食谱成分，因此咀嚼过程对乳牙的影响大为削弱，导致如今儿童的乳牙相对过去不容易正常脱落替换，而易于发生滞留，因此往往需要到医院进行拔除。在过去，拔除的乳牙作为医疗废弃物被大量丢弃，而牙髓干细胞的发现和研究进展，使得这些废弃物作为牙髓干细胞的重要来源而获得再利用机会，为牙髓干细胞产业化提供了资源保证。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是如何选择合适的源齿以保证牙髓干细胞提取的成功率，获得足量和优质的牙髓干细胞。为解决上述技术问题，本发明首先提供了源齿作为提取或制备牙髓干细胞的原料中的应用：所述源齿满足如下1)和2)所述的条件：1)ii度松动以内；2)无龋坏或龋坏程度在中龋以下。本发明还提供了满足上述条件的源齿在提取或制备牙髓干细胞中的应用。上述应用中，所述ii度松动以内包括i度松动和ii度松动。ⅰ度松动是指牙齿颊舌方向(内外方向)的动度在1mm以内，其他方向没有动度；ii度松动有两种情况：一为牙齿颊舌方向(内外方向)的动度在1-2mm之间，二为牙齿存在颊舌方向(内外方向)及近远中方向(左右方向)两个方向的动度。上述应用中，所述源齿为乳牙。所述源齿具体可为如下a1)-a5)中至少一种：a1)i度松动且牙根吸收1/3的源齿；a2)i度松动且牙根吸收1/2的源齿；a3)ii度松动且牙根吸收1/2的源齿；a4)ii度松动且牙根吸收2/3的源齿；a5)ii度松动且牙根完全吸收但髓室底完整存在的源齿。在实际应用中，选择i度松动至ii度松动的牙齿作为源齿，通过目视判断源齿有无龋坏及龋坏程度，当源齿无龋坏或龋坏程度在中龋以下时，对源齿进行采集，并在采集后立即放入充满保存液的容器中，然后密封容器，放入低温环境下进行保存或运输。其中，优选地，所述源齿为ii度松动且牙根吸收2/3的乳牙或ii度松动且牙根完全吸收但髓室底完整存在的乳牙。其中，优选地，在采集源齿之前，还包括用消毒剂对源齿外表进行消毒的步骤。所述消毒的方法具体可为用碘伏等消毒液擦拭牙冠或复方氯己定等含漱液含漱。其中，优选地，在源齿采集后置于(2-4)℃环境下进行保存或运输。其中，优选地，在源齿采集后的10秒内将源齿放入充满保存液的容器中。其中，优选地，所述容器是采购自北京泰盛生物科技有限公司的源齿采集管，所述保存液是采购自北京泰盛生物科技有限公司的源齿采集保存液。所述源齿还可以为恒牙或智齿，当源齿为恒牙或智齿时，源齿不包括判断其松动度的步骤，其他步骤与源齿为乳牙时相同。在采集源齿前，还包括对源齿进行筛选的步骤，对源齿进行筛选是保证牙髓干细胞提取成功的关键，应尽量避免选择龋坏(含继发龋)、存在填充体的牙齿作为源齿；如果有龋坏或存在充填体，建议拍摄根尖片判断原龋坏深度。若原龋坏为浅龋或中龋，进行牙髓活力测试有活性，去除龋坏组织后可尝试进行干细胞储存；若原龋坏为深龋，则不建议储存，感染风险大，提取成功率低。为解决上述技术问题，本发明还提供了用于牙髓干细胞提取的源齿的筛选方法。本发明提供的用于牙髓干细胞提取的源齿的筛选方法包括选取满足如下1)和2)所述条件的源齿：所述源齿满足如下1)和2)所述的条件：1)ii度松动以内；2)无龋坏或龋坏程度在中龋以下。上述方法中，所述源齿为乳牙。所述源齿具体可为如下a1)-a5)中至少一种：a1)i度松动且牙根吸收1/3的源齿；a2)i度松动且牙根吸收1/2的源齿；a3)ii度松动且牙根吸收1/2的源齿；a4)ii度松动且牙根吸收2/3的源齿；a5)ii度松动且牙根完全吸收但髓室底完整存在的源齿。在实际筛选中，选择i度松动至ii度松动的牙齿作为源齿，通过目视判断源齿有无龋坏及龋坏程度，当源齿无龋坏或龋坏程度在中龋以下时，对源齿进行采集，并在采集后立即放入充满保存液的容器中，然后密封容器，放入低温环境下进行保存或运输。其中，优选地，所述源齿为ii度松动且牙根吸收2/3的乳牙或ii度松动且牙根完全吸收但髓室底完整存在的乳牙。其中，优选地，在采集源齿之前，还包括用消毒剂对源齿外表进行消毒的步骤。所述消毒的方法具体可为用碘伏等消毒液擦拭牙冠或复方氯己定等含漱液含漱。其中，优选地，在源齿采集后置于(2-4)℃环境下进行保存或运输。其中，优选地，在源齿采集后的10秒内将源齿放入充满保存液的容器中。其中，优选地，所述容器是采购自北京泰盛生物科技有限公司的源齿采集管，所述保存液是采购自北京泰盛生物科技有限公司的源齿采集保存液。所述源齿还可以为恒牙或智齿，当源齿为恒牙或智齿时，筛选方法中不包括判断其松动度的步骤，其他步骤与源齿为乳牙时相同。所述筛选方法还包括尽量避免选择龋坏(含继发龋)、存在填充体的牙齿作为源齿的步骤。如果有龋坏或存在充填体，建议拍摄根尖片判断原龋坏深度。若原龋坏为浅龋或中龋，进行牙髓活力测试有活性，去除龋坏组织后可尝试进行干细胞储存；若原龋坏为深龋，则不建议储存，感染风险大，提取成功率低。上述方法在提取或制备牙髓干细胞中的应用也属于本发明的保护范围。对源齿牙髓干细胞提取的情况统计分析发现：牙根吸收1/3的源齿32颗，牙髓干细胞提取成功30颗，成功率93.75％；牙根吸收1/2的源齿35颗，牙髓干细胞提取成功32颗，成功率91.42％；牙根吸收2/3的源齿59颗，牙髓干细胞提取成功54颗，成功率91.53％；牙根完全吸收但髓室底完整的源齿37颗，牙髓干细胞提取成功34颗，成功率91.89％；自然脱落的乳牙10颗，牙髓干细胞提取成功0颗。除自然脱落的乳牙采集成功率低，其它采集成功率差异无明显统计学意义。对源齿采集后牙齿异位萌出的情况统计分析发现：牙根吸收1/3的源齿继承恒牙异位萌出12颗，恒牙萌出平均时间为2.19±0.18；牙根吸收1/2的源齿继承恒牙异位萌出11颗，恒牙萌出平均时间为1.89±0.13；牙根吸收2/3的源齿继承恒牙异位萌出8颗，恒牙萌出平均时间为1.42±0.12，牙根完全吸收但髓室底完整的源齿继承恒牙异位萌出2颗，恒牙萌出平均时间为1.03±0.15。本发明的研究结果表明：自然脱落的乳牙为无牙髓的牙齿，无干细胞；乳牙在ii度松动以内，牙根吸收2/3以上或牙根完全吸收但髓室底完整存在的情况下，牙髓干细胞提取成功率高，且对恒牙的萌出无太大影响，为最佳的乳牙源齿采集时机。本发明为今后临床乳牙牙髓干细胞源齿的采集时机提供理论基础。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中的乳牙滞留是指继承恒牙已经萌出，未能按时脱落的乳牙；或者恒牙未萌出，保留在恒牙列中的乳牙。下述实施例中的源齿是指为提取口腔干细胞的种子细胞而拔除的健康乳牙或恒牙或智齿(源齿采集的最佳年龄6-20岁)。牙齿根据松动程度分为如下三种：一度松动(ⅰ度)、二度松动(ii度)和三度松动(ⅲ度)。其中，一度松动(ⅰ度)是指牙齿颊舌方向(内外方向)的动度在1mm以内，其他方向没有动度；二度松动(ii度)有两种情况：一为牙齿颊舌方向(内外方向)的动度在1-2mm之间，二为牙齿存在颊舌方向(内外方向)及近远中方向(左右方向)两个方向的动度；ⅲ度牙齿松动也有两种情况：一为牙齿颊舌方向(内外方向)的动度超过2mm，二为牙齿存在颊舌方向(内外方向)、近远中方向(左右方向)和垂直方向(上下方向)三个方向的动度。实施例1、以乳牙为源齿的筛选和提取一、乳牙的筛选1、筛选标准通过拍根尖x线片或曲面体层片明确173例小学生的乳牙滞留情况。结果表明：173例小学生的乳牙滞留情况均符合《儿童口腔医学》中关于乳牙滞留的诊断标准，且所有乳牙均为健康的无龋坏的乳牙，均接近替换期，恒牙已接近萌出或萌出。根据乳牙松动和牙根吸收情况的不同将选取的乳牙分为如下五种：a)ⅰ度松动，源齿为乳牙滞留，牙根吸收1/3；b)ⅰ度或ii度松动，源齿为乳牙滞留，牙根吸收1/2；c)ii度松动，源齿为乳牙滞留，牙根吸收2/3；d)ii度或ⅲ度松动，源齿为乳牙滞留，牙根完全吸收但髓室底完整存在；e)ⅲ度松动，源齿为自然脱落的乳牙。2、器械和药品(1)器械准备sta(singletoothanesthesia口腔无痛麻醉注射仪大连通达利医疗器械贸易有限公司)；专用拔牙手术包：口镜、探针、镊子、适合患牙的拔牙钳、牙挺、挖匙、消毒孔巾、敷料、骨膜分离器(备用)。(2)药品准备uitracare盐酸利多卡因表麻膏(美国皓齿公司)、阿替卡因肾上腺素注射液(法国碧兰公司)、含采集液的采集管(北京泰盛生物科技有限公司)。二、源齿的采集及运送方法(一)源齿的采集方法1、拔除牙齿前从冰箱中取出对应采集管(乳牙采用细采集管)，注意不要拧开或松动盖子。2、拔除牙齿前，用碘伏等消毒液擦拭牙冠或复方氯己定等含漱液含漱。3、按照“口腔颌面外科学第七版，人民卫生出版社出版”中记载的常规拔牙方法进行源齿拔除。4、源齿拔除后迅速拧开采集管盖，7秒内放入采集管中，迅速拧上采集管盖，确保拧紧，收集完后在采集管上做好标记，需要在采集管上粘贴条形码、使用低温记号笔填写客户姓名、采集日期等信息，并避免上下颠倒混匀收集管采集管。5、立刻将装有采集液及牙齿的采集管放入2-4℃冰箱内进行冷藏保存。6、填写《gsp采集执行记录》并粘贴条形码，该采集记录需由医生与相关操作人员共同填写并进行签字确认。(二)源齿的运送方法采集的源齿通过冷链物流运输，运输温度保持在2-4℃(在2-4℃条件下放置不超过72小时对成功提取源齿中干细胞无显著影响)。运输前检查采集管是否密封完好，有无漏液，并在北京口腔干细胞库物流人员取走源齿时填写《gsp采集执行记录》，记录时间及运输方式。在运输过程中，依据温度测量仪记录每时每刻的温度变化，对从采集到入库的整个流程进行监控和记录。三、乳牙牙根吸收情况对乳牙牙髓干细胞提取及乳牙拔除后恒牙萌出情况的影响1、牙髓干细胞的分离培养及提取成功率采用培养间充质干细胞的常规技术对源齿中牙髓干细胞进行分离培养，并在20天左右确认牙髓干细胞是否成功分离并培养扩增，统计提取成功率。牙髓干细胞的具体制备、培养和鉴定方法参照文献“shed:stemcellsfromhumanexfoliateddeciduousteeth.miuraet.al,pnas2003vol.100:5807–5812”中的步骤。结果用spss13.0软件进行统计分析，计数资料用n％表示，用x2检验，以p<0.05为差异具有统计学意义。检测结果如表1所示。从表中可以看出：牙根吸收1/3的源齿32颗，牙髓干细胞提取成功30颗，成功率为93.75％；牙根吸收1/2的源齿35颗，牙髓干细胞提取成功32颗，成功率为91.42％；牙根吸收2/3的源齿59颗，牙髓干细胞提取成功54颗，成功率为91.53％；牙根完全吸收但髓室底完整的源齿37颗，牙髓干细胞提取成功34颗，成功率为91.89％；自然脱落的乳牙10颗，牙髓干细胞提取成功0颗。牙根吸收1/3、1/2、2/3以及牙根完全吸收的各组牙髓干细胞提取成功的百分率进行比较，p＞0.05，无显著差异性；以上四组与自然脱落的乳牙组进行比较，p＜0.05，有显著差异性。说明自然脱落的乳牙不适宜进行乳牙牙髓干细胞提取，其他四组乳牙牙髓干细胞提取成功率均达到90％以上。表1、乳牙牙根吸收情况及乳牙牙髓干细胞提取结果的情况牙根吸收程度源齿数量提取成功数量提取成功率(百分比)牙根吸收1/3323093.75％牙根吸收1/2353291.42％牙根吸收2/3595491.52％牙根完全吸收373491.89％自然脱落的乳牙1000*2、乳牙拔除后恒牙萌出的情况乳牙拔出后，观察恒牙萌出情况是否有异常，并统计恒牙萌出异常(恒牙异位萌出)的例数及恒牙萌出平均时间。结果如表2所示。从表中可以看出：牙根吸收1/3、1/2以及2/3三组的恒牙萌出平均时间之间进行比较，p＞0.05，无显著差异性；以上三组与牙根完全吸收组和自然脱落的乳牙组比较，p＜0.05，有显著差异性。从乳牙源齿拔除后，继承恒牙萌出时间的结果显示，乳牙牙根吸收越好，拔除后继承恒牙萌出越快。表2、乳牙牙根吸收情况及乳牙拔除后恒牙萌出的情况牙根吸收程度恒牙萌出异常(例数)恒牙萌出平均时间(月)根吸收1/3122.19±0.18*根吸收1/2111.89±0.13*根吸收2/381.42±0.12*根完全吸收21.03±0.15自然脱落的乳牙40.65±0.23综合上述乳牙牙髓干细胞提取培养的成功率及乳牙拔除后恒牙萌出的情况，发现对于乳牙牙髓干细胞源齿的采集来说，乳牙在ii度松动以内，牙根吸收2/3以上或牙根完全吸收但髓室底完整存在的情况下，乳牙牙髓干细胞提取成功率高，且对恒牙的萌出无太大影响，为最佳的乳牙源齿采集时机。实施例2、以恒牙为源齿的筛选和提取一、恒牙的筛选1、筛选标准根据恒牙的龋坏程度、是否存在填充体及生长情况分为如下各组：(1)源齿为年轻恒牙，无龋坏、无充填体，为最佳齿源，可直接进行源齿采集。(2)源齿为年轻恒牙，有龋坏，建议拍摄根尖片判断原龋坏深度。若原龋坏为浅龋或中龋，进行牙髓活力测试有活性，去除龋坏组织后进行源齿的采集；若原龋坏为深龋则不进行源齿采集。(3)源齿为年轻恒牙，存在充填体，建议拍摄根尖片判断原龋坏深度。若原龋坏为浅龋或中龋，进行牙髓活力测试有活性，去除龋坏组织后进行源齿的采集；若原龋坏为深龋则不进行源齿采集。(4)源齿为多生牙，建议拍摄根尖片判断有髓腔存在，进行牙髓活力测试有活性进行源齿采集。(5)源齿为下颌阻生智齿，源齿采集时如破坏牙冠等牙体组织则不进行干细胞提取。2、器械和药品同实施例1中的器械和药品。二、源齿的采集及运送方法1、拔除牙齿前从冰箱中取出对应采集管(恒牙、智齿采用粗采集管)，注意不要拧开或松动盖子。2、拔除牙齿前，用碘伏等消毒液擦拭牙冠或复方氯己定等含漱液含漱。3、按照“口腔颌面外科学第七版，人民卫生出版社出版”中记载的常规拔牙方法进行源齿拔除。4、源齿拔除后迅速拧开采集管盖，7秒内放入采集管中，迅速拧上采集管盖，确保拧紧，采集完后在采集管上做好标记，需要在采集管上粘贴条形码、使用低温记号笔填写客户姓名、采集日期等信息，并避免上下颠倒混匀采集管。5、立刻将装有采集液及牙齿的采集管放入2-4℃冰箱内进行冷藏保存。6、填写《gsp采集执行记录》并粘贴条形码，该采集记录需由医生与相关操作人员共同填写并进行签字确认。(二)源齿的运送方法采集的源齿通过冷链物流运输，运输温度保持在2-4℃(在2-4℃条件下放置不超过72小时对成功提取源齿中干细胞无显著影响)。运输前检查采集管是否密封完好，有无漏液，并在北京口腔干细胞库物流人员取走源齿时填写《gsp采集执行记录》，记录时间及运输方式。在运输过程中，依据温度测量仪记录每时每刻的温度变化，对从采集到入库的整个流程进行监控和记录。三、牙髓干细胞的分离培养及提取成功率采用培养间充质干细胞的常规技术对源齿中牙髓干细胞进行分离培养，并在20天左右确认牙髓干细胞是否成功分离并培养扩增，统计提取成功率。牙髓干细胞的具体制备、培养和鉴定方法参照文献“shed:stemcellsfromhumanexfoliateddeciduousteeth.miuraet.al,pnas2003vol.100:5807–5812”中的步骤。结果用spss13.0软件进行统计分析，计数资料用n％表示，用x2检验，以p<0.05为差异具有统计学意义。结果表明：本发明的恒牙牙髓干细胞的提取成功率为96％。当前第1页12