本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种分子信标探针检测人类cyp2c9基因多态性的试剂盒、方法及其应用。
背景技术：
cyp2c9是细胞色素p450酶(cyp)第二亚家族中的重要成员，是人体重要的药物代谢酶；cyp2c9能羟化代谢许多不同性质的药物，据统计，目前约有16％的临床药物由cyp2c9负责代谢。cyp2c9参与抗凝血药、抗惊厥药、降糖药、非甾体类解热镇痛抗炎药、抗高血压药以及利尿药等多种药物的羟化代谢，其中华法林、甲苯磺丁脲和苯妥因均为治疗指数较窄的药物。cyp2c9活性变化可导致这些药物体内浓度出现较大变化，甚至导致严重药物不良反应的发生。cypc2c9*2(rs1799853，c430t，arg144cys)和cyp2c9*3(rs1057910，a1075c，ile359leu)均导致cyp2c9酶活性降低，cyp2c9*3纯合子个体酶活性仅为该位点野生型纯合子基因型个体(携带cyp2c9*1或arg144/ile359等位基因)的4～6％。中国人群中cypc2c9*2的频率为0％，cypc2c9*3的频率为3％。cyp2c9遗传多态性导致其酶活性变化，从而导致药物代谢种族和个体差异化现象。
华法林是临床上常用的抗凝药物，是深静脉血栓、心房纤颤、心脏瓣膜置换术和肺栓塞等疾病的一线用药，其临床疗效和不良反应存在很大的个体差异，血药浓度过高或敏感性增加可导致严重出血事件。华法林由s-和r-两种消旋体构成，其中s-华法林的抗凝活性约为r-华法林的5倍。85％以上的s-华法林在体内经cyp2c9代谢为无活性的代谢产物，cyp2c9*3纯合子和杂合子基因型个体s-华法林的口服清除率分别下降90％和66％，因此华法林的给药剂量需相应降低。美国fda已批准修改华法林产品说明书，推荐在使用华法林前进行cyp2c9基因检测。测定cyp2c9*3等位基因可用于指导中国人群确定华法林的起始用药剂量，并预测药物毒性，结合国际标准化比值(internationalnormalizedratio，inr)检测值，估计华法林的维持剂量，确保用药安全。
目前针对多态性位点分析的方法主要有荧光定量pcr(qpcr)、pcr-限制性片段长度多态性(pcr-restrictionlengthpolymorphism，pcr-rflp)、扩增阻滞突变系统-pcr(amplificationrefractorymutationsystempcr，arms-pcr)等，但是由于这些方法操作步骤多，费时费力，或者需要pcr后处理，易产生污染，因此不适用于人群大规模的快速检测。测序法是核酸测序的金标准，虽然准确，但是操作步骤繁琐且成本较高。本发明，接触非对称pcr、分子信标技术和溶解曲线分析技术，发明了一种快速、准确的基因分型方法和试剂盒。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种分子信标探针结合溶解曲线法检测人类cyp2c9基因多态性的试剂盒、方法及其应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种分子信标探针结合溶解曲线法检测人类cyp2c9基因多态性的引物，包括如下核酸序列：
(1)扩增cyp2c9基因rs1799853多态性位点的引物对，其核苷酸序列如seqidno.：1和seqidno.：2所示；扩增cyp2c9基因rs1057910多态性位点的引物对，其核苷酸序列如seqidno.：3和seqidno.：4所示；
(2)用于检测cyp2c9基因rs1799853多态性位点的探针，其核苷酸序列如seqidno.：5所示，其中探针的5末端标记fam，3末端标记dabsyl；用于检测cyp2c9基因rs1057910多态性位点的分子信标序列，其核苷酸序列如seqidno.：6所示，其中探针的5末端标记hex，3末端标记dabsyl。
上述引物对和荧光探针对在一次检测中共同使用。
上述分子信标探针结合溶解曲线法检测人类cyp2c9基因多态性的引物和探针在检测cyp2c9基因多态性中的应用在本发明的保护范围之内。
一种分子信标探针结合溶解曲线法用于检测人类cyp2c9基因多态性的试剂盒，该试剂盒包括上述引物和探针、2xpcr反应混合液，阳性标准品。
一种分子信标探针结合溶解曲线法用于检测人类cyp2c9基因多态性的方法，包括如下步骤：
(1)提取人外周血基因组dna；
(2)分别以提取的人外周血基因组dna和阳性标准品为模板、权利要求1和2中的引物、探针、pcr反应混合液，进行实时荧光定量pcr反应；
(3)根据检测到的荧光信号值对rs1799853、rs1057910位点进行溶解曲线基因型判定，其中rs1799853位点选择fam通道，rs1057910位点选择hex通道。
进一步地，所述步骤(2)中，实时荧光定量pcr反应的扩增体系为：总体积20μl，2xpcr反应混合液10ul，seqidno.：10.02um，seqidno.：2，0.2um，seqidno.：30.02um，seqidno.：40.2um，seqidno.：50.2um，seqidno.：60.2um，模板dna50ng。
更进一步地，所述步骤(2)中，实时荧光定量pcr反应中的扩增程序为：95℃，2min；95℃，5s，60℃，45s，收集荧光，50个循环；溶解曲线分析程序为：95℃1min；45℃2分钟，50-90℃，连续收集荧光。
本发明提供了一种分子信标探针检测人类cyp2c9基因多态性的引物和试剂盒，采用分子信标探针法实现了对cyp2c9基因多态性位点进行快速、简单的检测。本发明在一个pcr反应中快速检测cyp2c9基因rs1799853、rs1057910位点多态性，操作简单，结果准确，易于判读。与测序法相比，该方法不需要对pcr产物进行一系列复杂的后续处理，pcr扩增和检测同步进行，整个检测过程无需开盖操作，降低了pcr产物造成污染的风险，大大缩短了检测时间，降低了检测成本。。
附图说明
图1为不同基因型对应检测结果示意图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：
步骤1：dna提取
取200μl外周血，按照全血基因组dna提取试剂盒说明书进行dna提取(购自杭州新捷生物科技有限公司)，提取dna用于后续实验或者存放于-20℃。
步骤2：pcr扩增和检测
(1)扩增cyp2c9基因rs1799853多态性位点的引物对，其核苷酸序列如seqidno.：1和seqidno.：2所示；扩增cyp2c9基因rs1057910多态性位点的引物对，其核苷酸序列如seqidno.：3和seqidno.：4所示；
(2)用于检测cyp2c9基因rs1799853多态性位点的分子探针，其核苷酸序列如seqidno.：5所示，其中探针的5末端标记fam，3末端标记dabsyl；用于检测cyp2c9基因rs1057910多态性位点的分子信标序列，其核苷酸序列如seqidno.：6所示，其中探针的5末端标记hex，3末端标记dabsyl。
在0.2ml中，配制如下反应体系：总体积20μl，2xpcr反应混合液10ul，seqidno.：10.02um，seqidno.：2，0.2um，seqidno.：30.02um，seqidno.：40.2um，seqidno.：50.2um，seqidno.：60.2um，模板dna50ng。，加水补足至总体积20μl，同时设立阳性标准品和阴性对照。实时荧光定量pcr反应中的扩增程序为：95℃，2min；95℃，5s，60℃，45s，收集荧光，50个循环；溶解曲线分析程序为：95℃1min；45℃2分钟，45-90℃，连续收集荧光。
步骤3：结果分析
反应结束后，应用仪器自带软件进行数据分析。运行溶解曲线基因型分析程序，分别选择fam通道和hex通道进行基因型判读。
步骤4：结果统计
10例标本的基因型结果统计如下：
以上所述，是本发明较佳的实施例，并非本发明任何形式上或实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的技术人员，在不脱离本发明的范围前提下，还可以对之做一些修改和改进，这些改进和补充也应该视为本发明的保护范围。
序列表
<110>黑龙江迪安医学检验所有限公司
<120>一种分子信标探针检测人类cyp2c9基因多态性的试剂盒、方法及其应用
<160>10
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<213>人工序列(artificialsequence)
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<212>dna
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<212>dna
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