一种基于高通量测序的双歧杆菌快速检测方法及应用与流程

本发明涉及一种基于高通量测序的双歧杆菌快速检测方法及应用，属于分子生物学技术领域。

背景技术：

双歧杆菌作为人和其它一些动物肠道内重要的益生菌，备受工业界和学术界专家学者的关注。双歧杆菌不仅能抑制肠道中致病菌的生长进而调节和改善肠道菌群，双歧杆菌还能改善乳糖不耐症、降低血清胆固醇、促进免疫和发挥抗氧化等重要益生作用。大量国内外微生态学研究表明，双歧杆菌还具有抑菌、防癌、营养等多种功效。因此，研究人体以及其它动物肠道内的双歧杆菌显得尤为重要。但是，迄今为止，国际国内尚无统一的可将双歧杆菌菌株准确鉴定至种水平的方法。

随着双歧杆菌菌株在益生菌制剂方面越来越广泛的应用，双歧杆菌菌种的鉴定越发显得重要，甚至需要鉴定至种的水平。细菌传统的鉴定方法主要是依据其形态学及生理生化等特性进行的，由于双歧杆菌形态的多变性以及专性厌氧和营养要求的复杂性，采用糖发酵等方法往往无法将性状相近的双歧杆菌菌种区分至种的水平。随着近年来分子生物学的发展，采用分子生物学方法对双歧杆菌进行属、种水平鉴定已有较大进展。目前的双歧杆菌分子生物学检测技术主要可包括三大类：(1)基于特异性核酸前体或探针的直接检测鉴定；(2)基于分子标记技术的检测鉴定；(3)基于pcr相关技术的检测鉴定。

以16srrna基因为基础的高通量测序技术具有简便和快速的特点，从而为肠道中双歧杆菌的检测提供了可能，然而，16srrna基因在区分不同种双歧杆菌方面还存在分辨率较低的局限性，因此该方法还不能满足双歧杆菌种及亚种水平的检测。这在一定程度上限制了双歧杆菌的研究，从而影响了双歧杆菌的工业应用。

技术实现要素：

为解决现有技术存在的上述缺陷，本发明选取groel基因，以该基因为基础设计引物，通过高通量测序技术在种及亚种水平进行双歧杆菌的检测和鉴定。该方法可用于快速、灵敏和特异地检测复杂样品中不同种及亚种双歧杆菌的组成。

本发明的一个目的是提供一种鉴定双歧杆菌种的方法，所述方法是以groel基因为标记物进行鉴定。

在本发明的一种实施方式中，所述方法以seqidno.1和seqidno.2所示序列为引物，对标记物基因groel的序列进行扩增，能够成功扩增获得目的条带的即为双歧杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述标记物基因片段的大小为400～600bp。

在本发明的一种实施方式中，所述扩增是对含有微生物基因组的对象进行扩增。

在本发明的一种实施方式中，所述对象包括基因组dna、菌悬液、或单菌落。

在本发明的一种实施方式中，所述扩增是以含待测混合物的基因组dna为模板进行扩增。

在本发明的一种实施方式中，所述扩增是以单菌落为模板进行扩增。

本发明的第二个目的是提供一种鉴定复杂样品中双歧杆菌亚种水平组成及含量的方法，其特征在于，所述方法包括：(1)构建双歧杆菌groel基因标准文库；(2)以seqidno.1和seqidno.2所示序列为引物，对复杂样品基因组中groel基因序列进行扩增；(3)将扩增结果回收、建库，并通过miseq测序；(4)将测序结果与双歧杆菌groel基因标准文库比对，鉴定、分析复杂样品中双歧杆菌亚种水平的组成特征。配合16srrnav3-v4区物种多样性分析方法，可以用于测定样品中双歧杆菌各个亚种的含量。

在本发明的一种实施方式中，所述双歧杆菌groel基因标准文库含有genbank数据库中可检索到的groel基因序列。

在本发明的一种实施方式中，所述方法包含以下步骤：

(1)提取待测样品的基因组dna；

(2)设计引物，正向引物如seqidno.1所示，反向引物如seqidno.2所示：

正向引物(seqidno.1)：5’-tccgattacgaycgygagaagct-3’

反向引物(seqidno.2)：5’-csgcytcggtsgtcaggaacag-3’

(3)采用步骤(2)中所述的正向引物和反向引物，以步骤(1)中所提取的基因组dna为模板进行pcr扩增，然后对pcr产物进行纯化；

(4)对步骤(3)中纯化后pcr产物进行定量，并等量混样，构建miseq测序标准文库，然后进行高通量测序；

(5)根据步骤(4)中测序的结果，得到待测复杂样品或者混菌样品的groel基因序列信息，以此为基础对待测样品中不同种双歧杆菌进行检测。

本发明的第三个目的是提供一种鉴定双歧杆菌种或亚种的试剂盒，所述试剂盒应用所述鉴定双歧杆菌种或亚种的方法实现菌株的鉴定。

本发明的第四个目的是提供一种筛选双歧杆菌的方法，将待筛选的样品制成菌悬液，稀释、涂布于固体培养基上，培养至形成单菌落，再以seqidno.1和seqidno.2所示序列为引物，对groel基因的序列进行扩增，扩增获得大小为400～600bp基因片段的菌株为双歧杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述固体培养基包括mrs培养基、bs培养基、或bbl培养基。

有益效果：本发明的方法可实现高通量鉴定，批量处理菌株信息，无需分离纯化即可全面鉴定复杂样品中的双歧杆菌组成，并且可以鉴定至亚种水平，分辨率高于16srrna。通过基于groel基因的特异性引物扩展，与传统的16srrna方法相比，将双歧杆菌属水平的鉴定周期至少缩短1天时间。本发明的方法能够100％鉴定双歧杆菌，对种和亚种的鉴定准确率达100％。

附图说明

图1是以groel基因为基础的双歧杆菌系统发育树的构建；分别利用ncbi和embl数据库下载双歧杆菌不同菌株groel基因序列，通过mega软件利用neighbor-joining距离算法构建系统发育树。

图2是以groel基因为基础设计引物的准确度；通过将不同种双歧杆菌以不同比例进行混合，然后以所设计引物为基础进行高通量测序，最后将测序得到的结果与预先混合的不同双歧杆菌的比例进行对比得到准确度。

图3是实施例中待测人粪便样品基因组dna的pcr扩增产物的电泳检测图；其中，m代表marker，c代表空白对照，h1～h7分别表示7个不同人的粪便样品。

图4是实施例中待测人粪便样品中双歧杆菌检测结果柱状图；

图5是实施例中待测大鼠粪便样品基因组dna的pcr扩增产物的电泳检测图；其中，m代表marker，c代表空白对照，h1～h7分别表示7个不同大鼠的粪便样品

图6是实施例中待测7个不同大鼠粪便样品中双歧杆菌检测结果柱状图。

图7是所选4株双歧杆菌和5株非双歧杆菌pcr扩增产物电泳图。其中，m代表marker，1-9分别为单形拟杆菌、大肠杆菌、粪肠球菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、动物双歧杆菌动物亚种、动物双歧杆菌乳亚种、短双歧杆菌和长双歧杆菌长亚种。

图8是以16srrna基因的v3-v4区为基础的双歧杆菌系统发育树。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的各实施方式进行详细阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施方式中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本申请各权利要求所要求保护的技术方案。

实施例1

按照下述步骤进行操作：

1、通过下载双歧杆菌不同物种的groel基因序列114条，通过mega软件构建系统发育树如图1所示，从图上我们能看出，该基因可以很好的将不同种双歧杆菌进行区分，因此该基因可用于不同种双歧杆菌鉴定和检测。

2、构建groel基因数据库，从ncbi(nationalcenterforbiotechnologyinformation)和embl(europeanmolecularbiologylaboratory)等数据库下载已知双歧杆菌的groel基因序列，利用所下载序列构建groel基因比对数据库。所构建groel基因序列数据库适用于目前已知的所有双歧杆菌。

3、采用高通量测序的方法，对待测复杂样品的微生物基因组dna信息采集；微生物基因组提取参照试剂盒中说明书。

4、采用高通量的方法，对步骤3的基因组进行pcr扩增。对groel基因保守序列和特异序列进行充分分析后，选取特定序列设计引物，并在这些引物对中挑选适合illuminamiseq测序平台读长的引物对，最终确定seqidno.1所示的正向引物和seqidno.2所示的反向引物为最终测序引物。将所设计引物通过在数据库ncbi中primer-blast功能针对数据库中所有细菌基因序列用电脑模拟pcr方法证实上述引物是适用于所有已知种属双歧杆菌的特异性引物，因此本发明所设计的引物确保了后续扩增的效率及鉴定的准确性。扩增的反应体系组成为：基因组dna模板2ul、extaqmix25ul、20um的正向引物和反向引物分别lul，加ddh2o至50ul。该pcr扩增的反应程序为：95℃预变性5min，然后以95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸50s为一个循环，进行30个循环，最后72℃延伸10min。收集pcr产物，采用胶回收试剂盒对pcr产物进行纯化。

5、采用美国thermofisher科技公司varioskanlux多功能微孔板读数仪进行定量，并等量混样，用illuminatruseqdnaltsamplepreparationkit试剂盒进行标准文库构建，并在illuminamiseq测序平台进行上机测序。将测序结果与自行构建数据库进行比对，对待测样品中双歧杆菌的种及其比例进行检测。

6、为了验证引物seqidno.1和seqidno.2在分析双歧杆菌中的准确性，我们将青春双歧杆菌、动物双歧杆菌乳亚种、动物双歧杆菌动物亚种、两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、齿双歧杆菌、长双歧杆菌长亚种、长双歧杆菌长亚种、假长双歧杆菌和假小链双歧杆菌共10种双歧杆菌按照0.24％到95.07％等不同比例进行混合，然后按照上述方法步骤进行模拟样品测序，将依据高通量测序方法得到的双歧杆菌不同物种的含量与模拟样品中预先混的双歧杆菌含量比较得到如图2的结果，从图2我们可以看出，利用引物seqidno.1和seqidno.2测序到到的双歧杆菌物种的含量与预先混入的双歧杆菌物种含量具有很好的一致性，因此，该高通量测序方法在检测双歧杆菌物种上具有较高的准确性。

本发明的实施方式所提供的基于高通量测序检测不同种双歧杆菌的方法适用于对复杂样品的groel基因序列信息与所构建数据库中已知物种的groel基因序列比对，从而得出复杂样品中不同种或亚种的双歧杆菌。

实施例2人粪便样品中不同种双歧杆菌的检测

1、取人粪便样品，对粪便样品中微生物进行基因组dna提取，提取时采用美国mpbiomedicals公司的dna提取试剂盒进行。具体操作步骤以该试剂盒操作说明书为准。

2、设计并合成双歧杆菌特异性引物序列

正向引物(seqidno.1)：5’-tccgattacgaycgygagaagct-3’

反向引物(seqidno.2)：5’-csgcytcggtsgtcaggaacag-3’

3、采用上述正向引物和反向引物，以所提取的基因组dna为模板，进行pcr扩增，pcr扩增反应体系的组成为：基因组dna模板2ul、extaqmix25ul(takara)、20um的正向引物和反向引物各lul，加ddh2o至50ul。

该pcr扩增的反应条件为：95℃预变性5min，然后以95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸50s为一个循环，进行30个循环，最后72℃延伸10min。

pcr扩增产物的电泳图如附图3所示，pcr扩增产物采用qiaquick胶回收试剂盒对pcr产物进行纯化，从图3我们能看出7个人粪便样品(h1-h7)都扩增出目的条带。

4、采用美国thermofisher科技公司varioskanlux多功能微孔板读数仪进行定量，并等量混样，用illuminatruseqdnaltsamplepreparationkit试剂盒进行标准文库构建，并在illuminamiseq测序平台进行上机测序。

5、对测序所得groel基因序列信息与所构建数据库(实施例1中构建)进行比对，检测结果如附图4所示，图4展示了7个人粪便样品中双歧杆菌的组成结构。长双歧杆菌长亚种和婴儿亚种是人体肠道内的优势双歧杆菌。上述数据说明，所述方法可以快速、准确的检测人体粪便内的双歧杆菌组成。

实施例3人粪便样品中不同种双歧杆菌含量测定

1、按照实施例2中步骤1-4所述方法，唯一区别是引物为16srrnav3-v4区通用引物，扩增人体粪便中所有微生物的v3-v4区，将测序得到的v3-v4区数据库得到双歧杆菌属占总细菌含量的百分比。具体结果如表1所示。

表1人粪便样品中双歧杆菌属占总细菌百分含量

2、将实施例2中步骤5得到的每个双歧杆菌的百分比乘以步骤1中的粪便样品中双歧杆菌属的含量，得到每个双歧杆菌种在人体粪便中的百分含量比。具体结果如表2所示。

表2人粪便样品中不同种双歧杆菌占总细菌百分含量(％)

实施例4以大鼠粪便样品中不同种双歧杆菌的检测进行验证

取大鼠粪便样品，按照实施例2中相同的方法步骤进行检测和鉴定，区别在于，步骤1提取大鼠粪便的基因组dna。检测结果如图5和6所示，图5显示7只大鼠粪便样品经过pcr扩增都得到目的条带，图6展示了7只大鼠粪便样品中双歧杆菌的组成结构。动物双歧杆菌是大鼠肠道内的优势双歧杆菌。上述数据说明，所述方法可以快速、准确的检测大鼠粪便内的双歧杆菌组成。

实施例5大鼠便样品中不同种双歧杆菌含量测定

1、按照实施例2中步骤1-4所述方法，唯一区别是引物为16srrnav3-v4区通用引物，扩增大鼠粪便中所有微生物的v3-v4区，将测序得到的v3-v4区数据库得到双歧杆菌属占中细菌含量的百分比。具体结果如表3所示。

表3大鼠粪便样品中双歧杆菌属占总细菌百分含量

2、将实施例2中步骤5得到的每个双歧杆菌的百分比乘以步骤1中的粪便样品中双歧杆菌属的含量，得到每个双歧杆菌种在大鼠粪便中的百分含量比。具体结果如表4所示。

表4大鼠粪便样品中不同种双歧杆菌占总细菌百分含量(％)

实施例6

选取单形拟杆菌、大肠杆菌、粪肠球菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、动物双歧杆菌动物亚种、动物双歧杆菌乳亚种、短双歧杆菌和长双歧杆菌长亚种，分别提取基因组，用seqidno.1～2进行pcr扩增，扩增条件同实施例2。pcr结果如图7所示，单形拟杆菌、大肠杆菌、粪肠球菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌无法扩增出目的条带，动物双歧杆菌动物亚种、动物双歧杆菌乳亚种、短双歧杆菌和长双歧杆菌长亚种均扩增出大小约500bp的目的条带。按实施例2相同的步骤将pcr产物胶回收、测序，与实施例1构建的基因文库进行比对，结果显示，图7中编号为6～9的泳道分别对应动物双歧杆菌动物亚种、动物双歧杆菌乳亚种、短双歧杆菌和长双歧杆菌长亚种。经验证，该比对结果与初始选定的菌株种属分类的信息一致。本发明的方法能够有效地将双歧杆菌属的菌株与其它属的菌株区分，测序后的比对结果能够100％鉴定双歧杆菌的亚种。

对照例1

采用16srrna作为标记物，构建角双歧杆菌、青春双歧杆菌、动物双歧杆菌乳亚种、动物双歧杆菌动物亚种、两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、齿双歧杆菌、长双歧杆菌长亚种、长双歧杆菌婴儿亚种、假长双歧杆菌和假小链双歧杆菌等已知的双歧杆菌系统发育树(分别利用ncbi和embl数据库下载双歧杆菌不同菌株16srrna基因序列，通过mega软件利用neighbor-joining距离算法构建系统发育树)。如图8所示，从图8可以看出，16srrna基因的v3-v4区鉴定分类结果不够准确，无法区分某些种和亚种。动物双歧杆菌乳亚种、动物双歧杆菌动物亚种无法有效区分，长双歧杆菌长亚种和长双歧杆菌婴儿亚种无法区分，假小链双歧杆菌和kashiwanohense双歧杆菌无法分开。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

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