本发明属于畜牧兽医技术领域，涉及一种快速检测家牛y染色体单倍型组构成的方法。
背景技术：
y染色体具有遵循父系遗传、单倍型完整等特点，对探究哺乳动物父系遗传多样性、群体遗传结构、迁徙路线、起源和进化等问题具有重要的科学价值。家牛(包括普通牛和瘤牛)y染色体单核苷酸多态位点(y-snps)的研究表明：家牛由3种y染色体单倍型组构成，包括y1和y2两种普通牛单倍型组和y3瘤牛单倍型组(
为了能够快速准确、经济可靠的确定这3种单倍型组在不同家牛品种内的分布状况，进而揭示其群体父系遗传结构和起源，bonfiglio等(2012)基于y染色体usp9y(y-linkedubiquitin-specificprotease9)基因内含子26上1个81bp的插入和1个限制性酶切位点发展出了一种只借助于pcr扩增和酶切电泳就可以鉴别这3种家牛单倍型组的方法。然而，该方法虽然提高了检测效率，但是需要借助酶切分析，操作相对繁琐，不够简便，检测耗时也较长。除上述研究之外，目前尚未见其他简单可行、快速准确、费用较低的鉴别这3种家牛单倍型组的方法报道。
技术实现要素：
为了克服上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种快速检测家牛y染色体单倍型组构成的方法，该方法能够快速简便、省时省力、经济可靠地确定家牛品种的y染色体单倍型组成，结果准确可靠，能够提高家牛品种的父系支系组成检测效率。
本发明是通过以下技术方案来实现：
本发明公开的一种快速检测家牛y染色体单倍型组构成的方法，包括以下步骤：
1)样品采集和基因组dna提取
采集待检测牛的血样或耳组织，提取待检测牛的基因组dna，备用；
2)引物合成和pcr扩增
以家牛y染色体zfy-10标记引物序列合成1对引物，以步骤1)提取的基因组dna为模板dna，进行pcr扩增，得到pcr扩增产物，其中：
上游引物序列如seqidno：1所示；
下游引物序列如seqidno：2所示；
3)测序、单倍型组定型分析
将步骤2)获得的待检测牛的pcr扩增产物进行正、反向测序，测序引物为扩增引物，得到待检测牛的zfy-10标记测序序列结果，进行序列比对分析，检测核苷酸变异位点，依据该标记的核苷酸变异位点确定单倍型组类型；
在测定的序列比对中：
若待检测牛所测序列中存在gt缺失，则直接判定该头牛属于普通牛y1单倍型组，此时snp位点为c核苷酸；
若待检测牛所测序列中不存在gt缺失，则看snp位点的c>t核苷酸类型，如果snp位点为c核苷酸，则判定该头牛为普通牛y2单倍型组，反之，如果snp位点为t核苷酸，则判定为y3瘤牛单倍型组。
优选地，本发明方法可以同时检测多头牛的y染色体单倍型组构成，只需要分别采集血样或耳组织提取基因组dna，然后进行引物合成和pcr扩增，测序、分析比对后进行单倍型组的构成判断和确认。
优选地，步骤1)中，采用基因组dna提取试剂盒提取待检测牛的基因组dna，稀释至终浓度为25～50ng/μl，备用。
优选地，步骤2)中，pcr扩增的反应体系共计25μl，包括：
优选地，步骤2)中，pcr扩增时反应程序为：98℃变性10s，52℃退火15s，72℃延伸10s，重复35个循环后冷却至4℃保存。
优选地，步骤2)中，扩增长度为286bp。
优选地，步骤3)中，将待检测牛的pcr扩增产物进行正、反向测序后，将测序结果用chromas2.6.4软件进行核实，得到每头公牛的zfy-10标记测序序列结果。
优选地，步骤3)中，采用bioedit7.2.5软件进行序列比对分析，检测核苷酸变异位点。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明公开了一种能够快速检测家牛y染色体单倍型组构成的分子生物学方法，通过对家牛y染色体zfy-10标记上1个c>t核苷酸转换和1个gt核苷酸插入/缺失位点的联合定型分析，可以快速、准确地检测家牛3种不同的单倍型组，即普通牛y1、y2和瘤牛y3单倍型组，进而确定其父系支系组成和起源。相比先前研究中使用多个y染色体标记上的多个y-snps的联合定型分析以及酶切分析，该方法只需通过zfy-10标记的pcr扩增和直接测序，依据其核苷酸变异就可快速准确、经济可靠、省时省力地确定家牛品种的y染色体单倍型组成，进而用于其父系支系组成和起源预测，这将大大的提高家牛品种的父系支系组成检测效率。
附图说明
图1为柴达木黄牛和大别山牛单倍型组序列比对分析结果图。
图中：“▲”示核苷酸转换位点；“□”示核苷酸插入/缺失位点；“y1”和“y2”分别代表柴达木黄牛2种普通牛单倍型组序列；“y3”代表大别山牛y3瘤牛单倍型组序列。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
一、实验方法
本发明公开的快速检测家牛y染色体单倍型组构成的方法，包括如下步骤：
1)样品采集和基因组dna提取
采集待检测牛的血样或耳组织，冷冻保存带回实验室，用基因组dna提取试剂盒提取基因组dna，稀释终浓度至25-50ng/μl保存备用。
所用基因组dna提取试剂盒采用艾德莱生物公司提供的全血组织细胞基因组dna快速提取试剂盒，货号为dn10。
2)引物合成和pcr扩增
针对家牛y染色体zfy-10标记引物序列合成1对引物，其中，
上游引物(pf)：5′-ccaaaatggttgagctttatga-3′；
下游引物(pr)：5′-ggagcataagtgatccaatgaa-3′；
以步骤1)提取的基因组dna为模板dna，进行pcr扩增，预期扩增长度为286bp。
pcr反应体系(25ul)为：2×primestarmaxpremix(上海宝生物公司)10.5μl，上、下游引物(10pmol/l)各0.5μl，模板dna1μl，超纯水12.5μl。
pcr反应程序为：98℃变性10sec，52℃退火15sec，72℃延伸10sec，35个循环，后冷却至4℃保存。pcr产物经1.5％琼脂糖凝胶(含goldview核酸染料)电泳后，凝胶成像系统拍照检测。
3)测序、单倍型组定型分析
将步骤2)获得的待检测牛的pcr扩增产物采用dna测序仪进行正、反向测序，测序引物为扩增引物，测序结果用chromas2.6.4软件进行核实和校正，得到每头公牛的zfy-10标记测序序列结果。
用bioedit7.2.5软件(hall1999)进行序列比对分析，检测核苷酸变异位点，依据该标记的核苷酸变异确定不同个体的单倍型组类型。
在测定的序列比对中：
若所测序列中存在gt缺失则可直接判定该序列对应的检测牛为普通牛y1单倍型组，此时snp位点为c核苷酸。若不存在gt缺失，则看snp位点的c>t核苷酸类型，如果snp位点为c核苷酸则判定检测牛为y2普通牛单倍型组，反之，如果snp位点为t核苷酸则判定为y3瘤牛单倍型组。
此处所测序列，是指以步骤1)中待检测牛的dna为模板，pcr扩增后的pcr产物进行直接测序的测序结果。
二、实验效果验证
为了验证本发明方法的可行性和可靠性，通过对106头柴达木黄牛和30头大别山牛(瘤牛)zfy-10标记的pcr扩增产物进行纯化测序，然后进行序列比对分析，结果参见图1。结果表明：106头柴达木黄牛在该标记中存在gt插入/缺失位点多态性，而在先前ginja等(ginjaetal.2009)报道的该标记家牛snp(c>t)位点，未检测到柴达木黄牛品种内snp变异。然而，在柴达木黄牛和大别山牛(瘤牛)序列比对分析中，发现在该snp位点柴达木黄牛为c核苷酸，而大别山牛为t核苷酸，存在c>t核苷酸转换，说明该snp位点为普通牛和瘤牛间的核苷酸变异。充分说明本发明方法的准确性和可靠性很高。
依据该标记核苷酸变异进行定型分析，结果表明：106头柴达木黄牛可确定为y1和y2两种普通牛单倍型组，其中23头牛为普通牛y1单倍型组个体，83头为普通牛y2单倍型组个体，提示柴达木黄牛由2种普通牛单倍型组构成，以y2单倍型组为主，y1单倍型组为辅，其对应2种普通牛父系支系，为普通牛父系起源。而30头大别山牛均为y3瘤牛单倍型组，属瘤牛支系，为瘤牛起源。通过以上实验，说明该方法简单可行，准确率高，结果可靠。
综上所述，本发明只需通过对zfy-10标记的pcr扩增和直接测序，依据其核苷酸变异就可准确可靠、快速简便、省时省力省钱地确定家牛品种的y染色体单倍型组成，进而用于其父系支系组成和起源预测，这将大大的提高家牛品种的父系支系组成检测效率，揭示群体遗传结构组成。
序列表
<110>青海省畜牧兽医科学院
<120>一种快速检测家牛y染色体单倍型组构成的方法
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>22
<212>人工合成
<400>1
<210>2
<211>22
<212>人工合成
<400>2