一种panD突变基因、基因工程及其在催化生产β‑丙氨酸中的应用的制作方法

本发明涉及生物
技术领域：
，具体涉及一种pand突变基因、基因工程及其在催化生产β-丙氨酸中的应用。
背景技术：
：β-丙氨酸，别名：3-氨基丙酸(3-aminopropanoicacid)，又称为β-氨基丙酸，β-丝析氨酸，β-初油氨基酸，作为一种重要的化学品，广泛应用于化妆品、水处理、建筑、饲料、食品、医药等多个领域。如：可以作为铅中毒解毒剂。β-丙氨酸又是一种潜在平台化合物，通过化学反应，可衍生出多种重要的化学品，如：d-泛酸钙、尼龙-3、丙烯腈等。目前全球d-泛酸钙年产量6000-7000t，年需求量达上万吨，产品供不应求。医药工业中β-丙氨酸主要作为初始原料合成泛酸钙、肌肽、帕米膦酸钠、巴柳氮、β-丙氨酸金属配合物。由于β-丙氨酸及其衍生物在美容、食品、医药、动植物饲料及化工等领域的广泛应用，市场需求量呈日渐上升趋势。l-天冬氨酸α-脱羧酶(acd)能催化脱去l-天冬氨酸的位羧基，产生β-丙氨酸和二氧化碳。上世纪七八十年代，nakano、williamson等研究团队先后发现大肠杆菌能利用细胞内pand合成β-丙氨酸，并对该酶的作用机理进行了研究。然而天然pand的活性比较低，且直接从自然界中获得产酶活力高的菌株比较困难。1999年，德国dusch等人首次将谷氨酸棒杆菌来源的pand基因分别克隆到大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌中表达。专利cn101210230a中将大肠杆菌中的l-天冬氨酸-α-丙氨酸脱羧酶基因克隆并进行异源表达，但是合成β-丙氨酸的能力只达到2.94g/l，离真正应用还有很大距离。尽管pand基因的重组表达在一定程度上提高了其在生物法制备β-丙氨酸中的能力，但天然序列和结构的pand的重组表达量和活力目前还不够高，这限制了pand在生物法制备β-丙氨酸中的应用。针对这个问题，国内外研究人员对pand基因进行了随机突变，以期研究pand序列与功能的关系，为提高pand的活力提供理论基础。pei等以枯草的重组菌株为研究对象，采用随机突变的方式，得到的突变菌株的最高酶活是野生菌的50％。就目前而言β-丙氨酸合成的研究热点及难点：提高天冬氨酸脱羧酶的活性和产量。技术实现要素：针对现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种pand突变基因。本发明还要解决的技术问题是提供一种具有较高天冬氨酸脱羧酶活性的基因工程菌。本发明最后要解决的技术问题是提供利用上述基因工程菌全细胞催化生产β-丙氨酸的应用。为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案如下：一种pand突变基因，其核苷酸序列如seqidno.1或seqidno.3所示。其中，所述的pand突变基因seqidno.1是pand基因的第34位碱基由a变成g；所述的pand突变基因seqidno.3是pand基因的第50位碱基由t变成c。所述的pand基因来源于c.glutamicum(atcc13032)中编码l-天冬氨酸-a-脱羧酶的pand基因，其核苷酸序列如seqidno.5所示。一种pand突变基因的编码蛋白，其氨基酸序列如seqidno.2或seqidno.4所示。一种重组质粒，包含了权利要求1所述的pand突变基因。一种基因工程菌，包含了所述的重组质粒。上述基因工程菌的构建方法，将pand突变基因克隆到pet-28a(+)表达载体上，得到重组质粒pet28a-pandc.g，将所得的重组质粒转化大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，获得重组大肠杆菌e.colibl21(de3)-pet28a-pandc.g。上述基因工程在催化生产β-丙氨酸中的应用也在本发明的保护范围之内。具体的应用方法是，将基因工程菌加入l-天冬氨酸的水溶液(用氢氧化钠预先调节水溶液的ph值至7.0)和ph缓冲液，然后加入金属离子，20-60℃(优选37℃)，反应2-15小时(优选12小时)，制备β-丙氨酸。所述基因工程菌e.colibl21(de3)-pet28a-pandc.g需要经过预培养，培养方法如下：i、从平板上分别挑取重组菌株e.colibl21(de3)-pet28a-pandc.g的单菌落接种到含有50mg/l卡那霉素抗性的5mllb摇管里，37℃培养6-8h后转接到含有50mg/l卡那霉素抗性100mllb培养基里，培养至od600＝0.3-0.5，加入0.5mmol的iptg，诱导10h，离心集菌，得到重组菌株e.colibl21(de3)-pet28a-pandc.g的细胞。ii、发酵培养：培养基配方：蛋白胨：10g/l，酵母粉：5g/l，氯化钠：5g/l，溶剂为水，将步骤i得到的细胞进行发酵培养，培养温度：35-38℃(优选37℃)，培养时间：10-15h(优选12h)。其中，参与催化生产β-丙氨酸反应的基因工程菌，其od600值为1-50，优选为5。其中，l-天冬氨酸在初始反应体系中的浓度为5-200g/l，优选100g/l。其中，所述的金属离子为co2+，fe2+，mn2+，ca2+中的一种或几种；优选fe2+。所述金属离子在初始反应体系中的浓度为5-100mm，优选50mm。其中，所述的ph缓冲液是mops缓冲液，初始母液的摩尔浓度为10-500mm，优选200mm。ph缓冲液的量没有特别要求，在加入l-天冬氨酸的水溶液之后，通过添加ph缓冲液的量控制菌株的od值以及l-天冬氨酸的初始反应浓度。本发明所述pand突变基因是以包含了pand基因基因工程菌为亲株a进行易错pcr反应，随机突变改变l-天冬氨酸-α-脱羧酶(pand)基因的密码子碱基，筛选出pand酶活和β-ala产量与亲株a相比明显提高的突变株。易错pcr随机突变改变pand基因的密码子碱基的位置，最终筛选获得突变株56，134号抽提质粒，并送上海生工生物工程技术服务有限公司测序确定突变的pand基因序列，分别发现突变株56第34位碱基a变成g(seqidno.1)，相应的氨基酸由异亮氨酸变成缬氨酸(seqidno.2)；突变株134第50位碱基t变成c(seqidno.3)，相应的氨基酸由缬氨酸变成丙氨酸(seqidno.4)。有益效果：本发明相比于现有技术，具有如下优势：本发明比较了不同来源的pand基因对β-ala产量的影响，确定以c.glutamicum(atcc13032)中编码l-天冬氨酸-α-脱羧酶的pand基因生产β-ala产量最高；应用易错pcr技术对pand基因进行随机突变改造，获得活力最高的重组大肠杆菌56号和134号所产β-ala的产量达42.81g/l，19.46g/l，而亲株a所产β-ala的产量为8.84g/l左右，分别提高了4.8倍和2.2倍。应用易错pcr技术对pand基因进行随机突变改造，获得了的突变菌株β-丙氨酸产量明显提高的重组大肠杆菌，育种目标明确、效率高。附图说明图1为不同基因来源对生产β-丙氨酸的影响。图2突变菌株与重组菌株的酶活对比。图3是复筛后几个突变菌株生产β-丙氨酸的对比。图4是重组菌全细胞催化l-天冬氨酸转化为β-丙氨酸的产量对比图。具体实施方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例1：本实施例比较了不同来源pand基因对生产β-丙氨酸的影响。三种不同基因来源菌株的构建：提取escherichiacolimg1655，c.glutamicum(atcc13032)，与bacillussubtilis(实验室所藏)的基因组dna并以之为模板，通过pcr扩增l-天冬氨酸-α-脱羧酶基因pand，pcr产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定、回收、纯化后，得到酶切位点为ncoi和xhoi的片段pand，将该片段与经过相同限制性内切酶处理过的重组质粒pet-28a相连，使用t4dna连接酶25℃连接30min。将上述连接液转入大肠杆菌transl-t1的感受态细胞(全式金生物技术有限公司)里，涂布在带有50mg/l卡那抗性的lb平板，37℃过夜培养。挑取平板上生长的单菌落，转接到含有50mg/l氯霉素抗性的lb培养基里，然后提取质粒，再经限制性内切酶ncoi和hindiii进行酶切验证，最后得到了重组质粒pet28a-pande.c，pet-28a-pandc.g及pet28a-pandb.s。将重组质粒pet28a-pande.c，pet-28a-pandc.g及pet28a-pandb.s分别转入重组菌e.colibl-21(de3)的感受态细胞中，并将其涂布在带有50mg/l卡那抗性的lb平板上，得到过表达了pand的三种重组菌株e.colibl21(de3)-pet28a-pande.c，e.colibl21(de3)-pet28a-pandc.g及e.colibl21(de3)-pet28a-pandb.s，从平板上挑取三种重组菌株的单菌落到含有50mg/l卡那霉素抗性的5mllb摇管里，培养6-8h后转接到含有50mg/l卡那霉素抗性的100mllb里，至od600＝0.6，加入0.5mmol的iptg，30℃摇床里培养，10h后，6000g离心5min，得到过表达了pand的三种细胞。使用100mmolpbs分别重悬e.colibl21(de3)-pet28a-pande.c，e.colibl21(de3)-pet28a-pandc.g及e.colibl21(de3)-pet28a-pandb.s重组菌，在反应体系中，分别加入重组菌细胞，使体系中，三种重组菌的细胞od600均为5，l-天冬酸：10g/l(用氢氧化钠调ph至7.0)，加入mops(ph6.0)，50mmfe2+，37℃，200rpm，4h后取样，液相检测l-天冬氨酸及β-丙氨酸的积累情况，其中检测方法为色谱柱：zorbaxsbc18柱(5μm，4.6mm×250mm)，柱温：30℃，(a)0.02mol/l的ph6.2naac-hac缓冲液和乙腈(b)，流速：1ml/min，检测器：紫外。衍生化试剂为2、4-二硝基氟苯.反应至4h，基因来源为谷棒的酶活较高，β-丙氨酸的产量为2.8g/l，基因来源为大肠杆菌，枯草的，β-丙氨酸的产量为0.3g/l。具体情况如图1所示。重组菌株e.colibl21(de3)-pet28a-pandc.gβ-丙氨酸的产量是其他两株菌株的9.3倍，进而选取pet-28a-pandc.g为突变对象。实施例2：金属离子对催化反应的影响。挑取重组菌株e.colibl21(de3)-pet28a-pandc.g的单菌落到含有50mg/l卡那霉素抗性的5mllb摇管里，培养6-8h后转接到含有50mg/l卡那霉素抗性的100mllb里，至od600＝0.6，加入0.5mmol的iptg，30℃摇床里培养，10h后，6000g离心5min。向重组菌种中加入l-天冬酸：10g/l(用氢氧化钠调ph至7.0)，加入缓冲液mops(ph6.0)，50mmfe2+，37℃，200rpm，12h后取样，液相检测l-天冬氨酸及β-丙氨酸的积累情况，如图2所示。实施例3：pand基因突变体库的构建。(1)将实施例1得到的大肠杆菌bl21(de3)/pet28a(+)-pandc.g接种于lb液体培养基中，30℃摇床里培养，10h后，6000g离心5min，收集菌体细胞，用质粒抽提试剂盒(购自上海生工生物工程技术服务有限公司)抽提质粒pet28a(+)-pand；lb液体培养基组成为：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠5g/l，卡那霉素50mg/l。(2)易错pcr反应的建立：(a)设计含有限制性酶切位点的正向引物(c.g-pand-ncoi-f，catgccatgggcatgctgcgcaccatcctc，下划线为ncoi酶切位点)和反向引物(c.g-pand-xhoi-r：ccgctcgagctaaatgcttctcgacgtcaaaagcc，下划线为xhoi酶切位点)；(b)配制50μl的pcr反应混合液，体系为：10×taqbuffer：5ul，mn2+(50mmol/l)：3.5ul，mg2+(25mmol/l)：14ul，dna模板：10ul，10×dntp：5ul，上游引物c.g-pand-ncoi-f：2μ，下游引物c.g-pand-xhoi-r：2ul，taq酶：0.5ul，ddh2o：8ul；(c)将pcr反应混合液置于pcr仪上进行易错pcr扩增pand基因，扩增程序为：扩增程序为：94℃变性3min，然后是20个循环，每个循环包括94℃变性60s，57℃退火60s，72℃延伸60s，循环结束后，72℃无需延伸，然后保存在4℃下。扩增结束后，用浓度为1.5％琼脂糖凝胶电泳确证pcr产物大小；(3)pand基因突变体库的构建：(a)用琼脂糖回收试剂盒(天根生化科技有限公司)回收pcr扩增产物；(b)配制50μl的酶切反应混合液，用限制性内切酶xhoi和ncoi对步骤(a)的易错pcr产物和pet28a载体分别进行双酶切，易错pcr产物体系为：片段dna模板：42ul，内切酶xhoi：1.5ul，内切酶ncoi：1.5；10×qcutbuffer：5ul，pet28a载体体系为：pet28a载体：42ul，内切酶xhoi：1.5ul，内切酶ncoi：1.5；10×q.cutbuffer：5ul。分别将其于37℃水浴中酶切45min；(c)将酶切产物在浓度为1.5％琼脂糖凝胶上电泳，验证酶切效果，并将目的dna片段用纯dna回收试剂盒回收，将pet28a载体切胶，用dna凝胶回收试剂盒(天根生化科技有限公司)回收；(e)配置10μl的连接反应混合液，体系为：t4ligationbuffer，1μl步骤(d)获得的双酶切后pet28b(+)，6.8μl步骤(c)获得的双酶切易错pcr产物，0.5ult4dnaligase；于25℃水浴中反应30min。按《分子克隆实验指南》将连接产物转化至25μl大肠杆菌bl21(de3)感受态中。最后将其涂布至lb固体培养基平板(蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠5g/l，卡那霉素50mg/ml)，在37℃下正向放置30min以吸收过多的液体，然后倒置培养过夜；(f)将转化平板上长出的所有转化子单菌落挑至含50mg/ml卡那霉素的lb固体培养基平板上并划线，于37℃恒温培养箱倒置培养过夜。将长出的所有转化子用引物对其进行普通菌落pcr。实施例4高产pand的基因工程菌的获得将实施例3构建的突变体库中的转化子和亲株a分别接入96孔板中的1mllb液体培养基(蛋白胨：10g/l，酵母粉：5g/l，氯化钠：5g/l)中，加入0.5mmol的iptg，于30℃、200rpm转速下摇床培养10h。培养结束后，8000r/min、4℃离心10min，收集细胞。加入500μll-asp使其终浓度为100g/l，50mmfe2+，500ul水，混匀后，于37℃，200rpm摇床转化12h。加入1％的酚酞试剂进行初筛，再利用层析法复筛以及高效液相检测，筛选出pand酶活和β-ala产量与亲株a相比明显提高的突变株56，134号，如图3所示。其中，56号的产量为12.3g/1，134号的产量为11.7g/l。图中的control代表未突变的菌株的产量为6.7g/l。实施例5：高产突变株pand基因序列的分析。将实施例4复筛得到的突变株56，134号所含质粒按实施例1所述抽提方法获得，并送上海生工生物工程技术服务有限公司测序确定突变的pand基因序列，并用dnaman软件进行序列比对；突变株56pand基因的核苷酸序列为seqidno.1所示，编码蛋白氨基酸序列为seqidno.2所示；突变株134pand基因的核苷酸序列为seqidno.3所示，编码蛋白氨基酸序列为seqidno.4所示。突变株pand突变位点分析：突变株56第34位碱基a变成g(seqidno.1)，相应的氨基酸由异亮氨酸变成缬氨酸(seqidno.2)；突变株134第50位碱基t变成c(seqidno.3)，相应的氨基酸由缬氨酸变成丙氨酸(seqidno.4)。实施例6：将基因工程菌56号和134号先分别进行如下预培养：i、从平板上分别挑取重组菌株e.colibl21(de3)-pet28a-pandc.g的单菌落接种到含有50mg/l卡那霉素抗性的5mllb摇管里，37℃培养6-8h后转接到含有50mg/l卡那霉素抗性100mllb培养基里，培养至od600＝0.3-0.5，加入0.5mmol的iptg，诱导10h后离心集菌，得到重组菌株e.colibl21(de3)-pet28a-pandc.g的细胞。ii、发酵培养：培养基配方：蛋白胨：10g/l，酵母粉：5g/l，氯化钠：5g/l，溶剂为水，将步骤i得到的细胞进行发酵培养，培养温度：37℃，培养时间：12h。将预培养后的基因工程菌56号和134号分别加入l-天冬氨酸的水溶液(用氢氧化钠预先调节水溶液的ph值至7.0)和200mmmops缓冲液，然后加入金属离子fe2+，控制l-天冬氨酸在初始反应体系中的浓度为100g/l，fe2+在初始反应体系中的浓度为50mm，菌株的od600值为20，37℃，反应12小时，制备β-丙氨酸。如图4所示，56，134号突变菌株的β-丙氨酸的产量分别达42.81g/l和19.46g/l左右，比亲株在同样反应条件下分别提高了近4.8倍和2.2倍。实施例7：突变菌株的动力学特征的研究将56，134及重组菌株e.colibl21(de3)-pet28a-pandc.g的细胞进行破碎，利用akta蛋白纯化系统进行纯化，然后将纯化后的酶液分别加入到分别加入l-天冬氨酸的水溶液(用氢氧化钠预先调节水溶液的ph值至7.0)和200mmpbs缓冲液，控制l-天冬氨酸的浓度分别为10g/l，20g/l，40g/l，60g/l，80g/l，56号，134号及重组菌株e.colibl21(de3)-pet28a-pandc.g蛋白浓度分别为2.29mg/ml，4.52mg/ml，0.405mg/ml，37℃，反应3小时，取样，进行液相检测，计算其km，kcat值，如表5所示。表5kmkcatvmax(nkcat*mg-1*protein)kcat/km(s-1*mm-1)对照57.490.0020.1263.5*10-556号11.480.00140.0881.22*10-4134号1.030.000970.0619.4*10-4序列表<110>南京工业大学<120>一种pand突变基因、基因工程及其在催化生产β-丙氨酸中的应用<160>5<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>417<212>dna<213>pand突变基因(突变株56号)<220><221>cds<222>(1)..(417)<400>1atgggcatgctgcgcaccatcctcggaagtaaggttcaccgagccact48metglymetleuargthrileleuglyserlysvalhisargalathr151015gtcactcaagctgatctagattatgttggctctgtaaccatcgacgcc96valthrglnalaaspleuasptyrvalglyservalthrileaspala202530gacctggttcacgccgccggattgatcgaaggcgaaaaagttgccatc144aspleuvalhisalaalaglyleuilegluglyglulysvalalaile354045gtagacatcaccaacggcgctcgtctggaaacttatgtcattgtgggc192valaspilethrasnglyalaargleugluthrtyrvalilevalgly505560gacgccggaacgggcaatatttgcatcaatggtgccgctgcacacctt240aspalaglythrglyasnilecysileasnglyalaalaalahisleu65707580attaatcctggcgatcttgtgatcatcatgagctaccttcaggcaact288ileasnproglyaspleuvalileilemetsertyrleuglnalathr859095gatgcggaagccaaggcgtatgagccaaagattgtgcacgtggacgcc336aspalaglualalysalatyrgluprolysilevalhisvalaspala100105110gacaaccgcatcgttgcgctcggcaacgatcttgcggaagcactacct384aspasnargilevalalaleuglyasnaspleualaglualaleupro115120125ggatccgggcttttgacgtcgagaagcatttag417glyserglyleuleuthrserargserile130135<210>2<211>138<212>prt<213>pand突变基因(突变株56号)<400>2metglymetleuargthrileleuglyserlysvalhisargalathr151015valthrglnalaaspleuasptyrvalglyservalthrileaspala202530aspleuvalhisalaalaglyleuilegluglyglulysvalalaile354045valaspilethrasnglyalaargleugluthrtyrvalilevalgly505560aspalaglythrglyasnilecysileasnglyalaalaalahisleu65707580ileasnproglyaspleuvalileilemetsertyrleuglnalathr859095aspalaglualalysalatyrgluprolysilevalhisvalaspala100105110aspasnargilevalalaleuglyasnaspleualaglualaleupro115120125glyserglyleuleuthrserargserile130135<210>3<211>417<212>dna<213>pand突变基因(突变株134号)<220><221>cds<222>(1)..(417)<400>3atgggcatgctgcgcaccatcctcggaagtaagattcaccgagccact48metglymetleuargthrileleuglyserlysilehisargalathr151015gccactcaagcagatctagattatgttggctctgtaaccatcgacgcc96alathrglnalaaspleuasptyrvalglyservalthrileaspala202530gacctggttcacgccgccggattgatcgaaggcgaaaaagttgccatc144aspleuvalhisalaalaglyleuilegluglyglulysvalalaile354045gtagacatcaccaacggcgctcgtctggaaacttatgtcattgtgggc192valaspilethrasnglyalaargleugluthrtyrvalilevalgly505560gacgccggaacgggcaatatttgcatcaatggtgccgctgcacacctt240aspalaglythrglyasnilecysileasnglyalaalaalahisleu65707580attaatccaggcgatcttgtgatcatcatgagttaccttcaggcaact288ileasnproglyaspleuvalileilemetsertyrleuglnalathr859095gatgcggaagccaaggcgtatgagccaaagattgtgcacgtggacgcc336aspalaglua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