专利名称：一种利用分子标记进行国兰杂交育种的方法
技术领域：
属于生物育种技术领域，确切地说是涉及一种利用分子标记进行国兰杂交育种的 方法。
背景技术：
兰属(Cymbidium)是兰科(Orchidaceae)植物中最早引入栽培的属之一。国兰狭 义地指兰属中的五种地生种春兰Spring Orchid (C. goeringii)、建兰AutumnOrchid (C. ensifolium)、寒兰 Winter Orchid(C. hanran)、墨兰 Dark Orchid(C. sinense)和 惠兰 Fragrant Orchid (C. faberi)，其香气馥郁、色泽淡雅，花姿秀美，叶态飘逸。我国具有非常丰富的国兰原生种和栽培品种，其种质资源相当丰富，蕴藏有极为 丰富的优良基因，但在新品种培育中尚未得到开发利用。目前，对于国兰的研究主要集中在 快速繁殖方面，利用茎尖、茎段、花梗、叶片、花瓣、根段等作为外植体进行组织培养的研究 有较多的文献资料，而杂交育种工作国内的报告很少，几乎没有开展。目前，国兰的品种培 育仍然主要依靠从野生植株中选择的传统观念和做法，兰花的人工新品种培育工作一直没 能得到应有的重视，人工培育的具有经济价值的新品种则少之又少，在花卉新品种的培育 中(包括农林园艺的其它作物)很少有像国兰这样仍从野生变异中选择品种的做法，国兰 新品种培育的道路应当是宽广的。杂交育种是培育兰花新品种最重要的方法，兰花在种内或种间，甚至与其他兰属 植物进行杂交都可能获得杂交后代。传统国兰在花色、瓣型、香味方面具有极大的优势，通 过杂交将这些优良基因转入到国兰的新品种中来，必定能培育出优秀的国兰新品种。从长 远来看，兰属内的广泛杂交育种必然会出现。
发明内容
本发明的目的是提供可以大大提高亲本选择效率，加快育种进程，促进国兰种质 资源创新的一种利用分子标记进行国兰杂交育种的方法。本发明采取的技术方案按以下步骤实施杂交育种(1)采用CTAB法提取国兰DNA基因组；(2)筛选国兰ISSR引物;(3)用筛选出的引物由PCR扩增国兰杂交亲本；
(4)待选杂交亲本亲缘关系聚类分析；(5)结合待选杂交亲本形态表现和亲缘关系选定杂交亲本，制定杂交策略；(6)培育亲本着花，采收父本花粉，与母本人工授粉；(7)培育授粉后的胚珠至发育的果荚成熟。实施本发明后的积极效果是为人工选育国兰的品种创造出崭新途径；而不必要再从野生植株中选择。本方法可以大大提高亲本选择效率，加快育种进程，促进国兰种质资源的创新。本发明的ISSR标 记技术具有多态性水平高，操作简单，重复性好和稳定性高等特点，能够检测出丰富的遗传 多样性。且可以在分子水平上，比较直观的选择遗传距离合适，表现型良好的杂交亲本，以 提高杂交的成功率。
具体实施例方式现对本发明作进一步说明按以下步骤实施杂交育种(1)采用CTAB法提取国兰DNA基因组；(2)筛选国兰ISSR引物;(3)用筛选出的引物由PCR扩增国兰杂交亲本；(4)待选杂交亲本亲缘关系聚类分析；(5)结合待选杂交亲本形态表现和亲缘关系选定杂交亲本，制定杂交策略；(6)培育亲本着花，采收父本花粉，与母本人工授粉；(7)培育授粉后的胚珠至发育的果荚成熟。1.所述的 CTAB (Cetyltrimrthyl ammonium-bromide，十六烷基三甲基溴化铵)法 提取国兰DNA基因组，其步骤是1)称取供试国兰幼嫩叶片50mg，在液氮中研磨三至四次，将粉末放入2ml离心管， 加入800 μ 1 2XCTAB提取缓冲液于其中，65°C水浴约1小时，每隔15分钟颠倒混勻数次， 以使其充分裂解；2)待样品冷却到室温加入氯仿异戊醇为24 1的溶液800μ 1，颠倒混勻， 12000rpm 离心 15min ；3)取上清液到新的2ml离心管中，加入等体积的氯仿异戊醇为24 1的溶液， 上下颠倒混勻，12000rpm离心15min ；4)第二次取上清液到新的2ml离心管中，加入等体积的异戊醇，颠倒混勻 后，_20°C静置，沉淀30min ； 12000rmp离心15min，去上清液；5) 500 μ 175%乙醇洗涤沉淀，12000rmp离心lOmin，洗涤两次；6)去上清液，室温晾干，无残留乙醇，加入约100 μ 1灭菌水溶解DNA ；7)0.8%琼脂糖电泳检测。2、所述的由PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)扩增国兰杂 交亲本是在PCR仪上进行PCR扩增反应，反应体系共20 μ 1，包括10\8吐作1~(含2011111101 mg2+) 2 μ 1、1· Ommol/LdNTPU. 2U Taq polymerase、1. 5 μ mol/LISSR 引物、模版 IOOng,用 ddH20补齐20 μ 1 ；所述的PCR扩增反应是由PCR扩增程序实现，所述的PCR扩增程序是 94°C预变性360s，然后94°C变性70s，52 °C退火复性50s，72°C延伸70s，40个循环；72°C 延伸420s，4°C终止反应；PCR产物在含有0. 5 μ g/mL EB的2. 0%琼脂糖凝胶中电泳lh，通 过凝胶成像系统获取电泳凝胶图像，进行拍照分析；引物807、811、812、825、827、835、840、 862、866、880用于上述反应体系，扩增出的条带清晰，多态性高。3、所述的待选杂交亲本亲缘关系聚类分析，是利用ISSR(Inter-Simple SequenceRepeat)分子标记结果，分析亲本之间的亲缘关系，采用人工读带，同一引物、同一位点按其扩增产物的有表示为(1)，无表示为(0)得到二元资料，形成0、1矩阵，利用NTSYS 统计软件的UPGMA法构建不同种之间的分子系统树，并计算种间的遗传相似系数；根据杂 交亲本的形态表现及育种目标，选定抗逆性强、观赏性高、适应性广且亲缘关系较近的品种 作为亲本。4、所述的培育所选择亲本着花，是在新生苗的终止叶出现后但尚未完全展开之 前，将氮磷钾(N P K)比例为7 9 16的花宝一号按照1 1000比例溶于水， 从兰花根部施浇，每周一次，并在兰花耐受范围之内，在白天保证足够的光照并增加昼夜温 差，促进花芽分化。花芽分化后，将氮磷钾(N P K)比例为25 5 20的花宝四号按照
1 1000比例溶于水之后，从兰花根部施浇，每周一次直至着花。5、所述的与母本人工授粉，起步骤是所选亲本开花后1-2天，在晴天上午进行， 轻轻拨掉药帽，再用干净镊子将雄花花粉块送入雌花合蕊柱分泌粘液的药腔内。实施案例实验材料供试材料为收集到的野生春兰、寒兰、建兰、墨兰和寒兰五种国兰，共 38个品种，并分别编号。1.国兰总DNA的提取采用CTAB法按照以下步骤提取国兰DNA基因组并进行电泳检测，称取38种供 试国兰幼嫩叶片各50mg，在液氮中研磨三至四次，将粉末放入2ml离心管，加入800 μ 1
2X CTAB提取缓冲液于其中，65°C水浴约1小时，其间混勻数次，以使其充分裂解；待样品冷 却到室温加入氯仿异戊醇为24 1的溶液800 μ 1，颠倒混勻，12000rpm离心15min ；取 上清液到新的2ml离心管中，加入等体积的氯仿异戊醇为24 1的溶液，上下颠倒混勻， 12000rpm离心15min ；第二次取上清液到新的2ml离心管中，加入等体积的异戊醇，颠倒混 勻后，_20°C静置、沉淀30min ； 12000rmp离心15min，去上清液；500 μ 175%乙醇洗涤沉淀， 12000rmp离心lOmin，洗涤两次；去上清液，室温晾干，无残留乙醇，加入约100 μ 1灭菌水溶 解 DNA。2. ISSR引物筛选选择2种国兰DNA，对100种ISSR引物进行扩增筛选，反应体系共20 μ 1，包括 10XBuffer(#20mmol mg2+) 2 μ 1、1. Ommol/LdNTP、1. 2U Taq polymerase、L 5 μ mol/LISSR 引物、模版100ng，用ddH20补齐20 μ 1。PCR扩增程序是94°C预变性360s，然后94°C变性70s，52°C退火复性50s，72°C延 伸70s，40个循环；72°C延伸420s，4°C终止反应；PCR产物在含有0. 5 μ g/mL EB的2.0%琼 脂糖凝胶中电泳lh，通过凝胶成像系统获取电泳凝胶图像，进行拍照分析。引物 807、811、812、825、827、835、840、862、866、880 用于上述 ISSR-PCR 体系，扩增 出的条带清晰，多态性高。3. 38种国兰杂交亲本的PCR扩增用筛选出的10条ISSR引物对38种国兰进行扩增，PCR反应产物在含有0. 5 μ g/ mL EB的2. 0 %琼脂糖凝胶中电泳lh，电泳缓冲液为1 X TAE,用DGL2000DNA Marker做分子 量标记，通过FR-200A全自动紫外与可见分析装置获取电泳凝胶图像，进行拍照分析。4.国兰杂交亲本的亲缘关系聚类分析
对待选杂交亲本亲缘关系进行聚类分析，是利用ISSR分子标记结果，分析亲本之 间的亲缘关系，采用人工读带，同一引物、同一位点按其扩增产物的有表示为(1)，无表示为 (0)得到二元资料，形成0、1矩阵，利用NTSYS统计软件的UPGMA法构建不同种之间的分子 系统树，并计算种间的遗传相似系数。5.杂交策略的制定根据聚类结果，来自浙江的下山春兰(与来自福建的下山墨兰在遗传相似系数为 0. 67处聚在一起，说明两者亲缘关系较近，理论上推测两者杂交获得优势植株的潜力较大。 浙江下山春兰花萼片宽大，花朵呈荷瓣型，香气馥郁，福建的下山墨兰的花序上生长12朵 花，如果以它们作为亲本杂交，可以定向培育花大且花多的新品种。6.培育待选亲本着花在新生苗的终止叶出现后但尚未完全展开之前，将氮磷钾比例为7 9 16 的花宝一号按照1 1000比例溶于水，从兰花根部施浇，每周一次，并在兰花耐受范围之 内，在白天保证足够的光照并增加昼夜温差，促进花芽分化；花芽分化后，将氮磷钾比例为25 5 20的花宝四号按照1 1000比例溶
于水之后，从兰花根部施浇，每周一次直至着花。7.人工授粉，培育受精胚珠至果荚成熟所选亲本开花后1-2天，在晴天上午进行，轻轻拨掉药帽，再用干净镊子将雄花花 粉块送入雌花合蕊柱分泌粘液的药腔内。经过几个月的栽培管理，已经获得了杂交果实。采用ISSR分子标记进行国兰杂交 育种，可以避免杂交亲本选择的盲目性，提高了杂交的成功率，提高了获得优势植株的可能 性，同时可以避免盲目的杂交行为，从而大大减少了杂交亲本的选择的时间以及杂交后代 优势植株筛选过程中的人力物力。
权利要求
一种利用分子标记进行国兰杂交育种的方法，其特征是按以下步骤实施杂交育种(1)采用CTAB法提取国兰DNA基因组；(2)筛选国兰ISSR引物；(3)用筛选出的引物由PCR扩增国兰杂交亲本；(4)待选杂交亲本亲缘关系聚类分析；(5)结合待选杂交亲本形态表现和亲缘关系选定杂交亲本，制定杂交策略；(6)培育亲本着花，采收父本花粉，与母本人工授粉；(7)培育授粉后的胚珠至发育的果荚成熟。
2.根据权利要求1所述的一种利用分子标记进行国兰杂交育种的方法，其特征是所 述的CTAB法提取国兰DNA基因组，其步骤是1)称取供试国兰幼嫩叶片50mg，在液氮中研磨三至四次，将粉末放入2ml离心管，加入 800 μ 1 2 X CTAB提取缓冲液于其中，65°C水浴约1小时，每隔15分种颠倒混勻数次；2)待样品冷却到室温加入氯仿异戊醇为24 1的溶液800μ 1，颠倒混勻，12000rpm 离心15min ；3)取上清液到新的2ml离心管中，加入等体积的氯仿异戊醇为24 1的溶液，上下 颠倒混勻，12000rpm离心15min ；4)第二次取上清液到新的2ml离心管中，加入等体积的异戊醇，颠倒混勻后，-20°C静 置，沉淀30min ； 12000rmp离心15min，去上清液；5)500 μ 175%乙醇洗涤沉淀，12000rmp离心lOmin，洗涤两次；6)去上清液，室温晾干，无残留乙醇，加入约100μ 1灭菌水溶解DNA ；7)0.8%琼脂糖电泳检测。
3.根据权利要求1所述的一种利用分子标记进行国兰杂交育种的方法，其特征是 所述的由PCR扩增国兰杂交亲本是在PCR仪上进行PCR扩增反应，反应体系共20 μ 1，包括 IOXBuffer 2 μ 1、1. Ommol/L dNTP、1.2U Taq polymerase、1· 5 μ mol/LISSR 引物、模 版lOOng，用ddH20补齐20 μ 1 ；所述的PCR扩增反应是由PCR扩增程序实现，所述的PCR扩 增程序是94°C预变性360s，然后94°C变性70s，52°C退火复性50s，72°C延伸70s，40个循 环；72°C延伸420s，4°C终止反应；PCR产物在含有0. 5 μ g/mL EB的2. 0%琼脂糖凝胶中电 泳lh，通过凝胶成像系统获取电泳凝胶图像，进行拍照分析；引物807、811、812、825、827、 835、840、862、866、880用于上述ISSR-PCR体系，扩增出的条带清晰，多态性高。
4.根据权利要求1所述的一种利用分子标记进行国兰杂交育种的方法，其特征是 所述的待选杂交亲本亲缘关系聚类分析，是利用ISSR分子标记结果，分析亲本之间的亲缘关系，采用人工读带，同一引物、同一位点按其扩增产物的有表示为(1)，无表示为(0) 得到二元资料，形成0、1矩阵，利用NTSYS统计软件的UPGMA法构建不同种之间的分子系统 树，并计算种间的遗传相似系数；根据杂交亲本的形态表现及育种目标，选定抗逆性强、观 赏性高、适应性广且亲缘关系较近的品种作为亲本。
5.根据权利要求1所述的一种利用分子标记进行国兰杂交育种的方法，其特征是 所述的培育亲本着花，是在新生苗的终止叶出现后但尚未完全展开之前，将氮磷钾比例为7 9 16的花肥按照1 1000比例溶于水，从兰花根部施浇，每周一次，并在兰花耐受范围之内，在白天保证足够的光照并增加昼夜温差，促进花芽分化；花芽分化后，将氮磷钾比例为25 5 20的花肥按照1 1000比例溶于水之后， 从兰花根部施浇，每周一次直至着花。
6.根据权利要求1所述的一种利用分子标记进行国兰杂交育种的方法，其特征是 所述的与母本人工授粉，其步骤是所选亲本开花后1-2天，在晴天上午进行，轻轻拨 掉药帽，再用干净镊子将雄花花粉块送入雌花合蕊柱分泌粘液的药腔内。
全文摘要
一种利用分子标记进行国兰杂交育种的方法，属于生物育种技术领域。其特点是按以下步骤实施杂交育种采用CTAB法提取国兰DNA基因组，筛选引物，选定杂交亲本，培育所选择亲本着花，取亲本花药粉，进行人工授粉，培育授粉后的亲本至发育的果荚成熟。其积极效果是为人工选育国兰的品种创造出崭新途径；而不必要再从野生植株中选择。本方法可以大大提高亲本选择效率，加快育种进程，促进国兰种质资源的创新。本发明的ISSR标记技术具有多态性水平高，操作简单，重复性好和稳定性高等特点，能够检测出丰富的遗传多样性，且可以在分子水平上，比较直观的选择遗传距离合适，表现型良好的杂交亲本，以提高杂交的成功率。
文档编号C12Q1/68GK101897293SQ20101024462
公开日2010年12月1日 申请日期2010年8月3日 优先权日2010年8月3日
发明者严华, 张冬梅, 高和平 申请人:上海市园林科学研究所;上海平良绿化工程有限公司