一种鉴定基因组编辑纯合突变体的方法与流程

技术特征：

1.一种鉴定基因组编辑纯合突变体的方法，其特征在于，该方法用于筛选与鉴定利用CRISPR/Cas9系统创建的纯合突变体，具体包括如下步骤：

（1）构建CRISPR/Cas9系统载体，根据目的基因序列信息，选取合适的靶点位置PAM，利用CRISPR/Cas9系统构建针对目的基因的特异性载体；

（2）将步骤（1）中所构建的CRISPR/Cas9载体转化植物体，筛选获得转基因植株；

（3）利用MSBSP-PCR筛选纯合突变体；

筛选时，首先设计PCR用引物，具体而言，根据目的基因选择的靶点分别设计靶点的上、下游引物和靶点特异性引物；

MSBSP-PCR反应时，包括两轮PCR反应，

第一轮PCR，对潜在的纯合突变体烟草植株提取DNA，以此为模板，以靶点的上、下游引物进行PCR反应，此为第一轮PCR；

第二轮PCR，以第一轮PCR反应的产物为模板，以靶点引物和靶点的下游引物配对，进行第二轮PCR反应；

最后，对第二轮PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，同时以野生型作为对照，如果第二轮PCR产物较野生型少，或者第二轮PCR没有产物即为纯合突变体。

2.如权利要求1所述鉴定基因组编辑纯合突变体的方法，其特征在于，步骤（1）中，选择烟草中部分目的基因利用CRISPR/Cas9系统进行编辑，具体基因及靶点序列如SEQ ID NO.1~6所示，具体如下：

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3.如权利要求2所述鉴定基因组编辑纯合突变体的方法，其特征在于，针对靶点序列，具体引物设计如下：

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4.如权利要求3所述鉴定基因组编辑纯合突变体的方法，其特征在于，步骤（1）中，具体载体构建方法为：首先制备dsDNA，然后利用BsaI酶对pHSE401载体进行酶切，并与dsDNA进行连接，转化、筛选、鉴定获得构建正确的重组载体。

5.如权利要求4所述鉴定基因组编辑纯合突变体的方法，其特征在于，步骤（2）中，转化烟草时，采用叶盘法进行转化。