一种鉴定基因组编辑纯合突变体的方法与流程

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种简便、快速的筛选、鉴定利用基因组编辑技术创建的纯合突变体的方法。

背景技术：

生物科学的研究进展部分程度上受限制于生物技术的发展速度，每一次生物技术的创新与突破都可能为生物科学研究的发展带来重大的突破。其中近年发展起来的基因编辑技术就具有这样的特点，这些新兴的生物技术为解读海量的基因数据提供了强大的技术支撑，并在基因工程改造、现代农业基因育种、人类疾病治疗等多个领域得到应用。

基因编辑技术属于一种对基因组进行定点编辑的技术，通过将外源DNA导入到受体细胞染色体的特定位点，有目的地改造基因组、产生突变，使基因的功能发生改变，该技术已成为研究基因功能的重要手段之一。现有基因编辑技术包括锌指核酸酶技术（Zinc-finger nucleases，ZFNs）、转录激活因子效应物核酸酶技术（Trans-cription activator like effector nucleases，TALENs）、CRISPR/Cas（clustered regularly inter- spaced palindromic repeats and its associated proteins）系统等多种技术形式。但实际应用中，由于ZFNs和TALENs具有一定的局限性，因此，目前应用较为广泛的是CRISPR/Cas系统。

CRISPR/Cas系统广泛存在于细菌及古生菌中，由tracrRNA基因、CRISPR序列和Cas蛋白编码的基因家族组成，研究表明该系统主要起免疫防卫作用。CRISPR序列是由重复序列（Repeat）与间隔序列（Spacer）有序间隔排列而成，其中重复序列高度保守，间隔序列为免疫性获得的外源基因片段，特异识别外源DNA。Cas基因家族成员有高度的同源性，表达的蛋白具有核酸酶、解旋酶与聚合酶等作用，含有2个核酸酶结构域（氨基端的RuvC-like结构域和位于蛋白中间位置的HNH核酸酶结构域），HNH核酸酶结构域可以切割与crRNA互补配对的模板链，切割位点位于原型间隔序列毗邻基序（Protospacer adjacent motif，PAM）上游约3个碱基处，RuvC-like结构域能对另一条链进行切割，切割位点位于PAM上游3~8 个碱基。根据Cas基因核心元件序列的不同，可以将其分3种类型：Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型。Ⅰ型、Ⅱ型在细菌中普遍存在，Ⅲ型只在部分细菌中发现，Ⅰ型和Ⅲ型在古细菌中均有发现。化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）的Ⅱ型CRISPR-Cas系统最为简单，也是现在研究和应用最广泛的系统之一，即CRISPR-Cas9系统。该系统仅Cas9与tracrRNA：crRNA二聚体便可完成对目标基因的编辑，其它两个类型需要更多的Cas蛋白参与，才能完成其生物学功能。

CRISPR/Cas9系统在动物中的研究相比植物已非常成熟，利用该系统可进行全基因组水平的基因功能筛选。CRISPR/Cas9技术首个动物实验是在斑马鱼中进行的，目前，该系统已经在多个物种中进行应用，包括：小鼠胚胎干细胞、人类多功能干细胞、果蝇、食蟹猴、家蚕、小麦、棉花、烟草、西红柿和拟南芥等。利用CRISPR/Cas9系统对目标实验对象进行基因编辑后，后续即需对突变体进行筛选。然而现有技术中对CRISPR/Cas9系统创建的突变体进行筛选时，多依赖测序工作的进行，而基因测序工作既费时又费力，而且花费颇高，因此某种程度上提高了CRISPR/Cas9系统的应用成本，限制了其推广应用范围。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种简单和快速的筛选与鉴定CRISPR/Cas9系统创建的纯合突变体的方法，从而为在不同物种中筛选由CRISPR/Cas9系统创建的突变体提供方法学基础，同时也可以为筛选不同物种中的点突变体的研究奠定方法学基础。

本申请的主要技术思路为：针对突变位点，通过设计特异性引物，由聚合酶链式反应（mutation sites based specific primers PCR, MSBSP-PCR）筛选与鉴定CRISPR/Cas9系统创建的纯合突变体。本申请所采取的技术方案详细介绍说明如下。

一种鉴定基因组编辑纯合突变体的方法，该方法的技术流程如图1所示，该方法用于筛选与鉴定利用CRISPR/Cas9系统创建的纯合突变体，以烟草为例，具体包括如下步骤：

（1）构建CRISPR/Cas9系统载体，

根据目的基因序列信息（具体例如根据NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上已公开基因序列信息），选取合适的靶点位置（PAM），利用CRISPR/Cas9系统构建针对目的基因的特异性载体；具体构建步骤如下：

（1.1）设计靶位点

首先，将目的基因的CDS序列与全基因组序列对比，获得目的基因的外显子和内含子序列信息；

其次，设计靶位点时应把握如下原则：

原则A：设计靶位点时最好在第一个外显子上设计，若第一个外显子上没有合适的位点，可以依次向后寻找；

原则B：如果目的基因存在多个拷贝，则要在多个拷贝的保守区设计；

原则C：寻找靶位点时，先从外显子序列上找到PAM位点，然后将PAM前面或后面的20个碱基序列放入到NEB cutter V2.0中查找酶切位点（尽量选常用的酶），酶切的位置与PAM的最好距离是3、4或5个碱基；

所述PAM位点（NGG或CCN，N为任意碱基），在基因序列上的形式为：

5'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG-3'，或

5'-CCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'；

最后，登录到网站http://www.genome.arizona.edu/crispr/CRISPRsearch.html筛选确定靶位点，确定最终靶位点时Cas9切割点（离PAM/NGG 3bp）最好位于酶切位点中；

如果手动设计靶点，可到http://www.rgenome.net/cas-offinder/网站评估脱靶情况；

进一步地，可使用http://www.crisprscan.org/page=sequence网站预测靶点编辑效率；

依据上述原则，针对部分基因利用CRISPR/Cas9系统进行编辑时，选择靶点序列（SEQ ID NO.1~6所示）如下表1所示：

表1，基因信息及CRISPR/Cas9系统使用的靶点序列

注：表中靶点序列部分的最后三个碱基为对应基因的特异靶点序列。

（1.2）靶位点引物设计

依据步骤（1.1）中所设计靶位点，在靶位点上下游的200bp处设计所需检测引物，以用来检测转基因植物是否发生了敲除，或者用此引物扩增WT的基因组来验证所得到的基因序列与WT序列是否一致（需要注意的是靶位点处是否存在SNP）；

具体引物设计原则如下：

（1.2.1）假设单靶点结构如下：

靶点P1，5’-ATTGNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’，

靶点P2，3’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5’；

因此可设计引物P1和P2如下（引物P1、引物P2中的19个“N”碱基呈反向互补关系），

引物P1：5’- ATTGNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’，

引物P2：5’- AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’；

需要强调的是，合成制备引物时必须分别携带5’端的ATTG 和 AAAC这四个碱基；

（1.2.2）如果在基因序列中找到的靶位点序列是NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG，则20-nt靶位点序列设为Forward（正向），Reverse（反向）为其反向互补序列；

（1.2.3）如果在基因序列中找到的靶位点序列是CCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN,则20-nt靶位点序列设为Reverse（反向），Forward（正向）为其反向互补序列。

针对前述烟草中NtCRTISO、NtGGPPS1、NtMYB86、NtRIN4、NtPVY及拟南芥AtETC2基因的靶点序列，具体引物设计如下：

；

；

；

（1.3）制备dsDNA，

将步骤（1.2）中所设计制备引物退火合成一对互补DNA oligo以形成dsDNA；具体50μL退火体系设计如下：

F-prime，20μL；

R-Prime，20μL；

10×Annealing buffer，5μL；

H2O：5μL；

退火程序为：95℃、5min，90℃、1 min，80℃、1 min，70℃、1 min，60℃、1 min，50℃、1 min， 40℃、1 min，30℃、1 min，20℃、1 min，10℃、1 min。

（1.4）酶切pHSE401载体，并与步骤（1.3）所制备dsDNA进行连接，

利用BsaI酶对pHSE401载体进行酶切，50μL酶切体系设计如下：

质粒，5μL；

10×buffer，5μL；

BsaI，2μL；

H2O，38μL；

37℃酶切1h；

酶切后对酶切产物进行电泳检测分析，可得1200bp 和 11520bp两个条带，回收大片段（11520bp）的酶切产物备用；

利用T4 DNA连接酶将所回收的大片段酶切产物与步骤（1.3）所制备dsDNA进行连接，连接时20μL连接体系设计如下：

所回收载体酶切产物，3μL；

退火所形成dsDNA产物，10μL；

T4 DNA buffer，2μL；

T4 DNA 连接酶，1μL；

H2O，4μL；

22℃连接1h；

（1.5）将步骤（1.4）中连接产物转化，并筛选、鉴定和分析确认是否构建正确，

将步骤（1.3）中连接产物转化大肠杆菌，筛选阳性克隆（pHSE401载体抗性为kan）并进行菌落PCR检测，

菌落PCR检测时，所用引物设计为:

F: TGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGC， (U6-26p)

R: 直接用退火合成sgRNA的反向序列；（具体为克隆不同基因片段的反向引物）

对菌落PCR检测验证正确的阳性克隆菌株培养扩增后进一步进行测序分析，分析U6-26p、靶位点及gRNA是否正确；

需要说明的是，测序时所用引物为：

U6-26p-F: 5’-TGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGC-3’。

（2）将步骤（1）中所构建的CRISPR/Cas9载体转化植物体，

仍以烟草为例，具体转化步骤如下：

（2.1）培育烟草幼苗

将烟草种子（例如烟草K326）用次氯酸钠（15% NaClO）消毒15分钟，然后用无菌水冲洗5~6次，冲洗干净后自然晾干，接种至MS培养基中，培养箱内培养7d左右至发芽。

（2.2）采用叶盘法进行转化，

首先制备转染用菌液，将转化有重组载体的农杆菌在抗性（卡那霉素和利福霉素抗性）培养基中28℃摇菌培养至OD600=0.6~0.8左右，4℃、5000rpm离心10分钟后收集菌体，用液体MS0（pH=5.8）重悬备用，调整OD600=0.6左右；

所述MS0，为不加糖和琼脂的MS培养基，pH约5.8；。

其次，将步骤（2.1）中幼苗叶片消毒后，分切成0.5~1cm²左右大小的正方形（刀片要锋利，切片时要将叶边缘和叶脉去掉，切片时要迅速，防止撕扯，挤压，尽量避免叶片损伤），然后置于含有上述所制备转染菌液的培养皿中侵染1.5分钟左右（此处侵染时间为较优时间），迅速捞出后用无菌滤纸吸干菌液；

将叶片均匀的平铺在不含抗生素的MS分化培养基中（叶表面向上），26℃暗培养 2天；

暗培养后转入潮霉素抗性的分化培养基中进行选择培养；7-15天为一周期，换新鲜培养基直至叶片分化出小苗；

在小苗（再生苗）长到1~2CM时切下，转入伸长培养基中培养；

长到一定高度时转入生根培养基中让其生根；

待转基因烟草长到3-4片叶，根系发育好后，炼苗1天，再种到含蛭石的育苗盘中，种时将根部培养基洗干净，防止根部腐烂，将育苗盘盖上薄膜，约一周后在膜上扎孔，让其透气，观察生长情况，如有萎蔫就停止透气，若生长良好，可先揭开一半薄膜，隔几天再全部揭开，这一过程不需要在培养间；

上述培养过程中，具体培养基配方可参考设计如下：

MS培养基：MS 4.4g/L+蔗糖（30g/L）+2.5g/L琼脂，pH=5.8~5.9；

分化培养基:MS+蔗糖（30g/L）+2.5g/L琼脂+6-BA 1mg/L+NAA 0.1mg/L+头孢250 mg/L+潮霉素5 mg/L，pH=5.8~5.9；

伸长培养基：MS+蔗糖（30g/L）+2.5g/L琼脂+6-BA 0.1mg/L +头孢250 mg/L+潮霉素5 mg/L，pH=5.8~5.9；

生根培养基：MS+蔗糖（30g/L）+2.5g/L琼脂+头孢250 mg/L+潮霉素5 mg/L，pH=5.8~5.9。

（3）利用MSBSP-PCR筛选纯合突变体；

对步骤（2）中所获得的转基因植株进行筛选，利用MSBSP-PCR筛选获得纯合突变体；

筛选时，首先设计PCR用引物，具体而言，根据目的基因选择的靶点分别设计靶点的上、下游引物和靶点特异性引物；靶点的上下游引物分别距离靶点约300 bp，而靶点引物的3’端紧邻NGG（N为任意碱基），或者在碱基N附近1-2 bp；

其次，MSBSP-PCR反应时，包括两轮PCR反应，

第一轮PCR，对潜在的纯合突变体烟草植株提取DNA，以此为模板，以靶点的上、下游引物进行PCR反应，即为第一轮PCR；

第二轮PCR，以第一轮PCR反应的产物为模板，以靶点引物和靶点的下游引物配对，进行第二轮PCR反应；

需要说明的是，第二轮PCR反应需要选择合适的引物退火温度，具体选择时可参考图2所示进行选择，进而对不同突变位点，采用不同引物组合，进行PCR反应（一般选取靶点引物和下游引物，对突变模板进行PCR反应扩增）；一般在60~65℃范围内的退火温度进行第二轮PCR反应较为合适；

最后，对第二轮PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，同时以野生型烟草作为对照，如果第二轮PCR产物较野生型少，或者第二轮PCR没有产物的烟草即为潜在的纯合突变体；在此初步判定基础上，可进一步进行测序分析确认是否为纯合突变体。

在以上的实验过程中，第一轮PCR的引物为针对特异基因靶点，位于靶点上下游约300bp处设计的正反向引物，而靶点引物为紧邻PAM的5’端设计的反向引物。对于不同的基因，其退火温度与PCR循环数不一致，第一轮PCR反应的退火温度为55℃，循环数约为30；而第二轮PCR的退火温度和PCR循环数，不同的目的基因，温度和PCR循环数略有差异，确定退火温度和PCR的循环数的原则是：所选择的反应条件下，野生型模板和突变体模板的产物量有差异。

本申请所提供的鉴定CRISPR/Cas9系统创制突变体的方法，主要技术考虑有以下几个方面：一、CRISPR/Cas9系统编辑的位点大部分在PAM的上游8个碱基以内；二、PCR反应中，靠近引物3’端的点突变的存在将降低产物的产量，特别是在合适的退火温度下，点突变的模板甚至不能由PCR反应获得产物。基于这些技术考量和设计，根据特异的靶点引物和选择合适的退火温度，以CRISPR/Cas9系统创制的突变体中，相比较于野生型的DNA，PCR反应获得少量的产物或者不能得到产物。另一方面，本申请采用的是两轮PCR，第一轮PCR的产物作为第二轮PCR的模板，可以避免基因组DNA复杂性对产物的影响，提高了PCR方法鉴定CRISPR/Cas9系统创制突变体的效率。

总体而言，本申请的技术思路较为新颖，能够较为便捷和快速的筛选获得纯合突变体，对于相关育种工作、品种筛选工作具有较好的实用意义，表现出较好的推广应用价值。

附图说明

图1为本申请所提供的MSBSP-PCR筛选CRISPR/Cas9系统创制突变体的流程模式图；其中CRISPR/Cas9 binary vector-contained Agrobacterium infiltration为农杆菌介导的CRISPR/Cas9双元载体的转化；T0/T1 seedlings为T0/T1代植株；mutant cultivation为培养突变体；DNA extraction and first round of PCR为DNA提取和第一轮PCR反应；Second round of PCR or TA cloning为第二轮PCR反应或者TA克隆；sgRNA-primer-F/R为靶点的上、下游引物；Target-primer为靶点引物；Screen for homozygous mutant为筛选纯合突变体；

图2为分析不同突变位点的模板与特异引物组合及合适退火温度；其中Melting temperatures为退火温度；Templates为模板；Primers为引物；WT、D1A、D12、D123、D2T、D3G、D34、D456、D5A、D56、D6T、D7C、D78和D8G分别为合成的不同位点突变位点的模板，D表示缺失；T、T1、T2、T3和T4分别表示靶点特异性引物，其中T为3’端紧邻靶点的引物；T1和T2分别为3’端向PAM上游移动1和2个碱基；T3和T4分别为3’端向下游移动1和2个碱基；R为反向引物；

图3为MSBSP-PCR筛选CRTISO突变体；其中A是构建TA克隆，以菌液为模板进行MSBSP-PCR；图B是以烟草DNA为模板，进行MSBSP-PCR筛选突变体；

图4为MSBSP-PCR筛选PVY突变体；其中上图表示琼脂糖凝胶电泳检测第一轮PCR的产物；中图表示琼脂糖凝胶电泳检测限制性内切酶PvuⅡ消化第一轮PCR的产物；下图表示琼脂糖凝胶电泳检测第二轮PCR的产物；PVY1为第一轮PCR的产物；PVY2为内切酶酶切消化PVY1后的产物；PVY3为第二轮PCR的产物；

图5为MSBSP-PCR筛选CRISPR/Cas9系统创建的MYB86（A）、GGPPS1（B）和RIN4（C）突变体；MYB86-F和MYB86-R分别为MYB86靶点的上、下游引物；MYB86-T为MYB86的靶点引物；GGPPS1-F和GGPPS1-R分别为GGPPS1靶点的上、下游引物；GGPPS1-T为GGPPS1的靶点引物；RIN4-F和RIN4-R分别为RIN4靶点的上、下游引物；RIN4-T为RIN4的靶点引物；

图6为MSBSP-PCR筛选CRISPR/Cas9系统创建的AtETC2突变体；其中AtETC2-F和AtETC2-R分别为AtETC2靶点的上、下游引物；AtETC2-T为AtETC2的靶点引物。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中所涉及部分生物材料、实验试剂及实验设备情况简要介绍说明如下。

生物材料：

转化过程中所用大肠杆菌DH5α菌株，一种常用的商品化菌株；

烟草材料：K326无菌苗，常用烟草材料；

CRISPR/Cas9系统质粒、拟南芥etc2突变体，中国农业大学陈其军教授友情提供；

TA克隆载体，全式金公司（中国，北京）产品；

实验试剂:

部分培养基具体配方为：

YEP培养基：10 g/L蛋白胨，10 g/L酵母提取物，5 g/L氯化钠；

MS培养基（固体培养基含0.8%（w/v）琼脂粉）：4.4 g/L的MS盐（Murashige & Skoog Basal Medium with Vitamins, Phyto Technology Laboratories）；另外，1/2MS是将MS盐的含量减少一半，其他成分含量相同；

实验设备：

PCR仪，Biometra GmbH，EasyCycler 96，德国。

实施例1

本实施例以烟草中CRTISO基因（NtCRTISO）为目的基因，选择靶位点碱基序列为：5’-GGTGGACTTCTTGCTAGGTATGG-3’；

参考“发明内容”部分所述及现有常规生物操作技术，利用CRISPR/Cas9系统构建重组载体并转化烟草植株，获得愈伤组织，进一步培育筛选获得T0代植株。对T0代植株中突变体是否存在纯合突变体采取了两种方法进行鉴定。简要介绍如下。

首先设计鉴定扩增用引物序列如下（T引物为靶点引物）：

。

第一种鉴定方法：对待鉴定烟草提取基因组DNA，以此为模板，利用上述F引物、R引物进行PCR扩增，回收扩增产物与TA载体进行连接，并转化大肠杆菌；然后选择不同菌落作为第二轮PCR扩增用模板，以靶点引物和下游引物（即：T引物和R引物）进行PCR反应，对扩增结果进行电泳检测。结果如图3A所示。从图中可以看出，菌落B3、B6和B7为潜在的突变体模板，而其它菌落为模板时PCR扩增有产物，表明这些T0代植株为杂合体突变体植株。这与进一步的测序结果相一致。换言之，如果需要最终准确确定纯合突变体，必需对该杂合体的后代进行进一步的鉴定。

第二种鉴定方法（即本申请的鉴定思路）：对待鉴定烟草提取基因组DNA，以此为模板，利用上述F引物、R引物进行第一轮PCR扩增，以此第一轮PCR扩增产物作为第二轮PCR扩增用模板，以靶点引物和下游引物进行PCR反应，对扩增结果进行电泳检测。结果如图3B所示。从图中可以看出，L4为纯合的烟草突变体植株。这一结果表明：采用MSBSP-PCR能够简单、快速的获得CRISPR/Cas9系统编辑的纯合突变体，特别是对于一些在T0代即能得到纯合体的物种，该方法简单易行、稳定可靠。

实施例2

本实施例以烟草中PVY基因（NtPVY）为目的基因，选择靶位点碱基序列为：5’-TGATACCAGCTGGCTATACACGG-3’；

如实施例1所述，参考“发明内容”部分所述及现有常规生物操作技术，利用CRISPR/Cas9系统构建重组载体并转化烟草植株，获得愈伤组织，进一步培育筛选获得T0代植株。本实施例中对T0代植株中突变体是否存在纯合突变体进行了鉴定。简要介绍如下。

首先设计鉴定扩增用引物序列（T引物为靶点引物）如下：

。

鉴定方法（即本申请的鉴定思路）如下：对待鉴定烟草提取基因组DNA，以此为模板，利用上述F引物、R引物进行第一轮PCR扩增，以此第一轮PCR扩增产物作为第二轮PCR扩增用模板，以靶点引物（T引物）和R引物进行PCR反应，对扩增结果进行电泳检测。结果如图4所示。

图4所示为其中6株转基因烟草的实验结果，上图为基因的正、反向引物扩增的产物PVY1；中图为对第一轮PCR产物PVY1经内切酶Pvu Ⅱ消化后，琼脂糖电泳的结果。PVY2为野生型PVY1被内切酶酶后的产物，L1-3经内切酶Pvu Ⅱ消化后，电泳检测到3条带，该结果表明，L1-3为CRISPR/Cas9编辑的杂合体，而以L4-6的DNA为模板扩增的产物PVY1不能被内切酶Pvu Ⅱ识别和消化，表明其模板发生突变，为纯合突变体。该结果进一步经MSBSP-PCR的第二轮PCR验证，完全一致；即：如图4下图所示，以第一轮PCR的产物PVY1为模板，L4-6以靶点引物和反向引物进行PCR反应，经琼脂糖凝胶电泳，未检测到产物PVY3。

综合分析可以看出，MSBSP-PCR鉴定纯合突变体的结果与核酸内切酶消化鉴定的结果完全一致，L4为纯合的烟草突变体植株。这一结果表明：采用MSBSP-PCR能够简单、快速的获得CRISPR/Cas9系统编辑的纯合突变体，充分证明了MSBSP-PCR在鉴定CRISPR/Cas9系统创建的纯合突变体的可行性，特别是对于一些在T0代即能得到纯合体的物种，该方法简单易行、稳定可靠。

实施例3

本实施例以烟草中MYB86基因（NtMYB86）、GGPPS1（NtGGPPS1）和RIN4（NtRIN4）基因为目的基因，在不同的烟草中同时对单个基因进行编辑，具体靶位点碱基序列选择为：

对于NtMYB86，靶位点碱基序列选择为：5’- CTCTCAGCAGCAACAGTAATGG-3’；

对于NtGGPPS1，靶位点碱基序列选择为：5’- CACGACGATTTACCTTGTATGG-3’；

对于NtRIN4，靶位点碱基序列选择为：5’- GTTCGGGAGGAAAGACAATTGG-3’。

如实施例1所述，参考“发明内容”部分所述及现有常规生物操作技术，利用CRISPR/Cas9系统构建重组载体并转化烟草植株，获得愈伤组织，进一步培育筛选获得T0代植株。本实施例中对T0代植株中突变体是否存在纯合突变体做了鉴定。简要介绍如下。

首先设计鉴定扩增用引物序列如下：

。

鉴定方法（即本申请的鉴定思路）如下：对待鉴定烟草提取基因组DNA，以此为模板，分别利用上述F引物、R引物进行第一轮PCR扩增，再以此第一轮PCR扩增产物作为第二轮PCR扩增用模板，以靶点引物和R引物进行PCR反应，对扩增结果进行电泳检测，分别对每个基因鉴定、分析。结果如图5所示。

从图5A中可以看出，在第二轮PCR结果中，L1-4均没有扩增出产物，表明L1-4均为纯合突变体；在图5B中，第二轮PCR仅L2和L3没有扩增出产物，表明L2和L3为纯合突变体；在图5C，第二轮PCR仅L3、L8和L15没有扩增出产物，表明L3、L8和L15为纯合突变体。

实施例4

本实施例以拟南芥中ETC2基因（AtETC2）为目的基因，具体靶位点碱基序列选择为：5’- AGAAGTGAGTAGCATCGAATGGG-3’；

如实施例1所述，参考“发明内容”部分所述及现有常规生物操作技术，利用CRISPR/Cas9系统构建重组载体并转化拟南芥植株，获得愈伤组织，进一步培育筛选获得T0代植株。本实施例中对T0代植株中突变体是否存在纯合突变体做了鉴定。简要介绍如下。

首先设计鉴定扩增用引物序列如下：

。

鉴定方法（即本申请的鉴定思路）如下：对鉴定转基因拟南芥提取基因组DNA，分别以不同引物组合进行MSBSP-PCR验证其是否为纯合突变体。对PCR扩增结果进行电泳检测，结果如图6所示。

从图6中可以看出，L1和L2均为etc2纯合突变体。该结果表明，MSBSP-PCR能用于鉴定CRISPR/Cas9载体构建的拟南芥突变体。

需要说明的是，为确保上述筛选纯合突变体结果准确可靠，上述实施例中，在MSBSP-PCR鉴定结果基础上，后续均进行了进一步的测序验证，以检验本申请鉴定结果的可靠性，而测序结果也进一步验证了相关鉴定结果的稳定、可靠性。

需要补充说明的是，MSBSP-PCR比较适用于鉴定突变位点在PAM附件的突变体，对于少部分突变位点离PAM超过10 bp，需要先测序确定突变的位置，才能继续使用MSBSP-PCR进行鉴定。

还需解释、强调说明的是，上述实施例中，MSBSP-PCR仅以烟草和拟南芥中鉴定为例，理论而言，由CRISPR/Cas9系统创制的突变体，在上述思路基础上，均能使用该方法。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国烟草总公司郑州烟草研究院

河南大学

<120> 一种鉴定基因组编辑纯合突变体的方法

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<170> PatentIn version 3.5

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<212> DNA

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<211> 22

<212> DNA

<213> Nicotiana tabacum

<400> 3

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<211> 22

<212> DNA

<213> Nicotiana tabacum

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<212> DNA

<213> Nicotiana tabacum

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<211> 23

<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana

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