人双调蛋白克隆至人工改造的表达载体pGEX-4T-1及其原核可溶性表达的研究的制作方法

本发明涉及分子生物学与蛋白质组学领域，具体的是说人双调蛋白克隆至人工改造的表达载体pGEX-4T-1及其可溶性表达的研究。

背景技术：

人类AREG基因位于4号染色体q13~q21区域，AREG基因转录为包含6个外显子的mRNA，这种mRNA可编码一种由252个氨基酸组成的跨膜双调蛋白前体。这种双调蛋白前体在蛋白酶作用下可被水解释放出可溶的双调蛋白。双调蛋白在许多正常组织和器官中都有表达，包括泌尿生殖系统、循环系统、呼吸系统及内分泌系统等。双调蛋白参与人体内一系列生理过程，如女性生殖系统发育、精子发生、胚胎着床，肺、肾和前列腺的形态发生，神经元发育、骨组织发育和免疫功能的维持等。AREG也与一系列肿瘤的发生发展相关，在肝癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌等癌组织中，AREG表达量显著增高，而且它还参与到肿瘤细胞的增殖、转移及侵蚀过程。

泛素（SUMO）是一种广泛存在于真核生物细胞中的蛋白，由101个氨基酸组成。SUMO作为融合蛋白表达标签主要有两个特征，首先其作为一种融合标签，能够提高蛋白的产量且能够促进蛋白的可溶性表达；其次融合蛋白中的SUMO能被高度特异性的去泛素化酶识别并切除，不影响目的蛋白的生物活性及其后续生物学功能的研究。

原核表达载体pGEX-4T-1上自带的GST标签经切除后，并将SUMO基因连接到此载体上，构建新的原核表达载体pGEX-4T-1-SUMO。重新改造的载体较原载体有两大优势，一是能明显提高目标蛋白的表达量；二是能提高目标蛋白的可溶性表达。促溶标签SUMO解决了人AREG在原核表达系统内不易形成可溶性的蛋白的问题，这对人双调蛋白生物学功能研究奠定了基础。

技术实现要素：

本发明的目的是为了克服原核表达系统易形成包涵体沉淀的问题，而提供的一种利用促溶标签SUMO来增加目标蛋白的可溶性表达的方法，有效地提高了人双调蛋白的可溶性。

技术方案包括以下步骤：

（1）利用HeLa细胞cDNA文库为模板，通过PCR扩增得到人SUMO基因，然后将pGEX-4T-1和SUMO基因经MscI、BamHl双酶切，通过连接转化构建pGEX-4T-1-SUMO。

（2）人工合成人双调蛋白基因AREG，AREG和pGEX-4T-1-SUMO经BamHl和Xhol 双酶切后连接，构建重组质粒pGEX-4T-1-SUMO-AREG。

（3）用CaCl2法将重组质粒转化到原核表达宿主Rosetta(DE3)中，构建工程菌。

（4）构建好的工程菌用IPTG诱导表达，并从诱导温度和IPTG浓度两个方面对目标蛋白可溶性表达进行优化。

（5）用Ni-NTA亲和层析纯化SUMO-AREG，CoolCutter™ SUMO蛋白酶切除SUMO标签，进一步用Ni-NTA亲和层析纯化酶切产物。

所述步骤（1）中，以HeLa细胞cDNA文库为模板，PCR扩增得到人SUMO基因，设计引物时添加MscI和BamHl两个酶切位点。

所述步骤（1）中，PCR扩增SUMO基因所用到的引物，在合成过程中已添加6个组氨酸（6His），目的是便于后续融合蛋白的纯化，纯化方法是Ni-NTA亲和层析纯化。

所述步骤（4）中，分别从诱导温度和IPTG浓度两个方面对目标蛋白的可溶性表达进行优化，诱导温度分别采用了16℃、25℃、30℃、37℃，IPTG浓度分别采用了0.1mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM。收集不同诱导条件下的细菌，超声破碎后分别取上清和沉淀，SDS-PAGE电泳检测目标蛋白可溶性表达情况。

镍柱纯化蛋白原理是：组氨酸标签是原核表达载体上6个组氨酸的区段,这个标签在PH8.0时不带电,且无免疫原性,对蛋白质的分泌,折叠,功能基本上无影响。组氨酸是具有杂环的氨基酸，每个组氨基酸含有一个咪唑基团，这个化学结构带有很多额外电子，对于带正电的化学物质有静电引力，亲和层析是利用这个原理来进行吸附的，亲和配体上的镍离子带正电对组氨酸有亲和作用。高浓度的咪唑可以竞争性地与镍柱结合，从而使组氨酸与镍柱脱附，达到分离纯化目的蛋白的作用。

所述步骤（5）中，SUMO蛋白标签的切除，CoolCutter™ SUMO蛋白酶由重组的人源及小鼠源SUMO融合蛋白混合制得，可更高效剪切内源蛋白及重组融合蛋白的SUMO标签。它能识别完整的SUMO三级结构而非短小的氨基酸序列，因而不会错切融合的蛋白。

经实验证实，人工改造的表达载体能明显提高目标蛋白的表达量，明显降低了生产成本。

本发明先将融合标签SUMO连接到改造过的表达载体pGEX-4T-1，再将目标蛋白ARGE基因克隆至重组载体上；通过对目标蛋白的表达条件进行一系列优化，最终得到一组最优条件：诱导温度为16℃，IPTG浓度为0.6mM，诱导时间为12h。经SDS-PAGE电泳检测结果显示可溶性重组蛋白约占重组蛋白总表达量的80%，明显提高了目标蛋白的可溶性表达，对后续目标蛋白进一步纯化及其生物学结构和功能的研究提供了一个好的基础。

附图说明

图1为以HeLa细胞cDNA文库为模板，通过PCR扩增出的SUMO基因编码区片段，1%琼脂糖凝胶电泳图。

图2为构建的重组表达质粒pGEX-4T-1-SUMO示意图。

图3为构建的重组质粒pGEX-4T-1-SUMO-AREG示意图。

图4为含重组质粒pGEX-4T-1-SUMO-AREG的大肠杆菌Rosetta(DE3)经不同IPTG浓度诱导后的SDS-PAGE电泳图。

注：泳道1、2、3、4、5、6、7、8、9、10分别代表蛋白质Marker，未诱导，0.1mM IPTG，0.5mM IPTG,，0.8mM IPTG。

图5 为含重组质粒pGEX-4T-1-SUMO-AREG的大肠杆菌Rosetta(DE3)经不同温度诱导后，超声破碎后上清和沉淀的SDS-PAGE电泳图。

注：泳道1、2、3、4、5、6、7、8、9、10分别代表蛋白质Marker，未诱导，16℃上清，16℃沉淀，25℃上清，25℃沉淀，30℃上清，30℃沉淀，37℃上清，37℃沉淀。

图6 为含重组质粒pGEX-4T-1-SUMO-AREG的大肠杆菌Rosetta(DE3)经不同IPTG浓度诱导后，超声破碎后上清和沉淀的SDS-PAGE电泳图。

注：泳道1、2、3、4、5、6、7、8、9、10分别代表蛋白质Marker，未诱导，0.1mM上清，0.1mM沉淀，0.4mM上清，0.4mM沉淀，0.6mM上清，0.6mM沉淀，0.8mM上清，0.8mM沉淀。

图7 融合蛋白SUMO-AREG的纯化示意图。

注：泳道1、2、3、4、5、6、7、8分别代表蛋白质Marker，穿透液，20mM咪唑，40mM咪唑，600mM咪唑，100mM咪唑，300mM咪唑，500mM咪唑。

图8 为融合标签SUMO标签切除后目标蛋白AREG的纯化示意图。

注：泳道1、2、3分别代表蛋白质Marker，穿透液，AREG蛋白。

具体实施方式

以下实施例对本发明做进一步的阐述，但是不作为本发明内容的限制。

实施例1 重组质粒pGEX-4T-1-SUMO-AREG的构建。

1.SUMO1基因的获取

根据Genbank已经收录的基因（NCBI收录号：U67122.1）应用Primer Premier5.0软件设计一对引物，并在上游引物和下游引物5'端添加MscI和BamHl限制性酶切位点。由于表达载体pGEX-4T-1上不带有6His标签，所以需要在SUMO基因5'添加6His碱基序列，设计引物如下：

上游引物（P1）：5' TGGCCA AATCATCATCATCATCATCAA 3'

下游引物（P2）：5'GGATCC AACTGTTGAATGACCCCC 3'

利用HeLa细胞cDNA文库为模板，进行PCR扩增，反应体系如下：

加入各组分后混合均匀，PCR反应按以下反应条件进行：94℃预热2min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸30s，30个循环后72℃再延伸10min，4℃保存。取3µl PCR产物1%琼脂糖凝胶电泳检测（如图1）。

2.表达载体pGEX-4T-1-SUMO的构建

用碱裂解法提取质粒pGEX-4T-1，然后将载体和SUMO扩增产物同时做MscI和BamHl双酶切，低熔点琼脂糖胶回收载体片段。将目的片段和载体片段16℃过夜连接，连接后转化E.coli DH5α，用PCR菌落法筛选重组子，成功构建表达载体pGEX-4T-1-SUMO（如图2）。

3.重组质粒pGEX-4T-1-SUMO-AREG的构建

根据Genbank已经收录的基因（NCBI收录号：BT019866.1）,人工合成人双调蛋白基因AREG,然后将AREG基因片段和pGEX-4T-1-SUMO经BamHl和Xhol 双酶切后连接，构建重组质粒pGEX-4T-1-SUMO-AREG（如图3）。

用CaCl2法将重组质粒转化到原核表达宿主Rosetta(DE3)中，构建工程菌。重组质粒pGEX-4T-1-SUMO-AREG转化Rosetta(DE3)细胞步骤如下：

1）取100µl Rosetta(DE3)感受态细胞于EP管中，在冰浴中加入10µl水溶性质粒pGEX-4T-1-SUMO-AREG，充分混匀后在冰上放置30min。

2）在42℃水浴中热击90s，迅速置于冰上2min。

3）向EP管中加入800µl LB液体培养基（不含氨苄），37℃ 180r振荡45min。

4）取上述菌液30µl和70µl分别涂布于含氨苄和氯霉素的LB固体平板，正面放置0.5h，37℃倒置过夜培养。

实施例2 重组质粒pGEX-4T-1-SUMO-AREG的诱导表达及其可溶性条件的优化

1.重组质粒pGEX-4T-1-SUMO-AREG的诱导表达

挑取Rosetta（pGEX-4T-1-SUMO-AREG）单菌落接种于10ml含相应抗生素的LB液体培养基，37℃ 180r/min过夜培养。

分别取1ml过夜培养的菌液接种于两个100ml LB液体培养基中，37℃180r振荡培养2.5h，加入IPTG（终浓度分别为0.1、0.5、0.8mmol/L）诱导表达3h。将菌体放入离心管中4000r离心5min，收集菌体后用蒸馏水洗涤两次，20ml PBS缓冲液重悬菌体，取20µl加入5µl 5倍蛋白上样缓冲液沸水中煮10min，12000r离心10min后SDS-PAGE电泳检测（如图4）。

2.表达条件的优化

影响原核表达的主要因素有温度、IPTG浓度、诱导表达时间，所以实验从这三个方面优化表达条件。分别从诱导温度和IPTG浓度两个方面对目标蛋白的可溶性表达进行优化，诱导温度分别采用了16℃、25℃、30℃、37℃，IPTG浓度分别采用了0.1mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM。收集不同诱导条件下的细菌，超声破碎后分别取上清和沉淀，SDS-PAGE电泳检测目标蛋白可溶性表达情况（如图5和图6）。

实施例3 融合蛋白SUMO-AREG的纯化及其SUMO标签的切除

1.融合蛋白SUMO-AREG的纯化

通过对目标蛋白的表达条件进行一系列优化，最终得到一组最优条件：诱导温度为16℃，IPTG浓度为0.6mM，诱导时间为12h。采用融合蛋白表达最优条件，大量表达重组蛋白。

诱导表达后的菌体用PBS重悬后，冰浴中超声波破碎，12000r离心10min取上清，用滤器过滤，将上清放于预先处理过的Ni-NTA柱中，冰浴中振荡1h，收集穿透液。分别用20mM、40mM、60mM、100mM、300mM和500mM 咪唑洗脱缓冲液洗Ni-NTA柱，并收集洗脱液。SDS-PAGE电泳检测蛋白纯化效果（如图7）。

2.SUMO标签的切除

将纯化后的重组蛋白SUMO-AREG置于适当容器中，用CoolCutter™ SUMO蛋白酶切除SUMO标签，进一步用Ni-NTA亲和层析纯化酶切产物。SDS-PAGE电泳检测蛋白纯化效果（如图8）。