监测根瘤菌在非豆科植物中定殖过程的方法与流程

本发明涉及生物
技术领域：
中，监测根瘤菌在非豆科植物中定殖过程的方法。
背景技术：
：根瘤菌不但可以在豆科植物的根部形成共生固氮的根瘤，而且还可以在自然条件下与重要的谷类作物的根形成内生的联合作用。尽管内生菌在植物中广泛存在，但是关于根瘤菌在植物根内的定殖方式还不清楚。内生根瘤菌进入非豆科植物的方式与根瘤菌进入绝大多数豆科植物根的方式和分布是不同的。根瘤菌侵入豆科植物的方式，大多数是以根毛形成侵入线的方式进入局部的根皮层细胞，进行分裂形成根瘤。只有少数豆科植物如花生、田菁，其根瘤菌是以侧根裂隙进入根的皮层细胞内形成根瘤。除了田菁茎瘤根瘤菌进入田菁根形成根瘤，同时发现在木质部有内生根瘤菌外，尚无发现其他根瘤菌进入豆科植物根后以内生菌形式存在。近年来随着分子生物学技术的发展，尤其是各种标记基因的相继发现，为研究根瘤菌的竞争结瘤能力评价提供了快速准确的手段。目前的标记基因有发光酶基因(Luciferasgene，luxAB)、β-葡萄糖苷酶基因(β-Glucuronidasegene，gusA)、绿色荧光蛋白基因(GreenFluorescentProteingene，gfp)和红色荧光蛋白基因(RedFluorescentProteingene，rfp)。其中gfp基因标记由于具有快速、方便、准确的优点。苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti1021)可以促进非豆科植物水稻和小麦的生长，然而其作为内生菌在水稻和小麦体内的迁移和定殖过程尚无法获知，与小麦相互作用的分子机制目前还不清楚。通过gfp标记苜蓿中华根瘤菌，监测其在小麦体内的定殖过程，将为深入研究苜蓿中华根瘤菌对非豆科植物的促生机理奠定基础。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是如何监测根瘤菌在植物中定殖过程。为解决上述技术问题，本发明首先提供了监测根瘤菌在植物中定殖过程的方法本发明所提供的监测根瘤菌在植物中定殖过程的方法，包括：将EGFP的编码基因导入根瘤菌中，得到重组根瘤菌；用所述重组根瘤菌接种植物，监测所述重组根瘤菌在所述植物中的定殖过程。上述方法中，EGFP的序列可为下述A1)、A2)或A3)：A1)氨基酸序列是序列2的蛋白质；A2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且编码EGFP的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1、标签的序列标签残基序列Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRRPoly-His2-10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述A2)中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。上述A2)中EGFP可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述A2)中EGFP的编码基因可通过将序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。上述方法中，所述将EGFP的编码基因导入根瘤菌中可为将包含所述EGFP的编码基因的表达载体导入所述根瘤菌中。上述方法中，所述表达载体中所述EGFP的编码基因可由lacZ基因启动子启动。在本发明的一个实施例中，所述表达载体为将质粒pMP2444的BamHI和XbaI识别序列间的DNA片段替换为序列1所示的egfp基因得到的表达序列2所示的EGFP的载体。上述方法中，所述EGFP的编码基因可为下述A11)-A13)中的任一种DNA分子：A11)编码序列为序列表中序列1的cDNA分子或基因组DNA；A12)在严格条件下与A11)限定的DNA分子杂交且编码EGFP的cDNA分子或基因组DNA；A13)与A11)或A12)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码EGFP的cDNA分子或基因组DNA。其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。其中，序列1编码序列2所示的EGFP蛋白质。本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码EGFP的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的EGFP的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码EGFP且具有EGFP功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。上述方法中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。上述方法中，所述植物可为下述a1)-a4)中的任一种：a1)单子叶植物或双子叶植物；a2)非豆科植物或豆科植物；a3)禾本科植物；a4)小麦或水稻。上述方法中，所述根瘤菌可为下述b1)或b2)：b1)中华根瘤菌属根瘤菌；b2)苜蓿中华根瘤菌(如苜蓿中华根瘤菌1021)。上述方法中，所述监测所述重组根瘤菌在所述植物中的定殖过程可通过荧光显微镜(如激光共聚焦显微镜)进行或通过分离所述植物组织中的所述重组根瘤菌进行。上述方法中，通过荧光显微镜监测所述重组根瘤菌在所述植物中的定殖过程时，可用488nm波长过滤器捕捉所述植物组织中所述重组根瘤菌发出的绿色荧光。上述方法中，分离所述植物组织中的所述重组根瘤菌可将待测植物组织破碎后在培养基上进行培养，得到所述待测植物组织中所述重组根瘤菌。为解决上述技术问题，本发明还提供了所述方法在培育固氮植物中的应用。上述应用中，所述植物可为下述a1)-a4)中的任一种：a1)单子叶植物或双子叶植物；a2)非豆科植物或豆科植物；a3)禾本科植物；a4)小麦或水稻。上述应用中，所述根瘤菌可为下述b1)或b2)：b1)中华根瘤菌属根瘤菌；b2)苜蓿中华根瘤菌(如苜蓿中华根瘤菌1021)。为解决上述技术问题，本发明还提供了下述X1-X4中的任一种应用：X1、EGFP在监测根瘤菌在植物中定殖过程中的应用；X2、与EGFP相关的生物材料在监测根瘤菌在植物中定殖过程中的应用；所述生物材料为下述B1)至B16)中的任一种：B1)编码EGFP的核酸分子；B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；B9)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；B10)含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；B11)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织；B12)含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；B13)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官；B14)含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；X3、EGFP在培育固氮植物中的应用；X4、所述生物材料在培育固氮植物中的应用。上述应用中，B1)所述核酸分子具体可为上述方法中所述EGFP的编码基因。上述应用中，B2)所述的含有编码EGFP的核酸分子的表达盒(EGFP基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达EGFP的DNA，该DNA不但可包括启动EGFP基因转录的启动子，还可包括终止EGFP基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用现有的表达载体构建含有EGFP基因表达盒的重组载体。上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pMP2444。B3)所述重组载体可含有序列1所示的用于编码EGFP的DNA序列；进一步B3)所述重组载体具体可为pMP-egfp。所述pMP-egfp为将质粒pMP2444的BamHI和XbaI识别序列间的DNA片段替换为序列1所示的egfp基因得到的表达序列2所示的EGFP的重组载体。上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。所述细菌具体可为根瘤菌。所述根瘤菌可为中华根瘤菌。所述中华根瘤菌可为苜蓿中华根瘤菌，如苜蓿中华根瘤菌1021。上述应用中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。上述应用中，所述植物可为下述a1)-a4)中的任一种：a1)单子叶植物或双子叶植物；a2)非豆科植物或豆科植物；a3)禾本科植物；a4)小麦或水稻。上述应用中，所述根瘤菌可为下述b1)或b2)：b1)中华根瘤菌属根瘤菌；b2)苜蓿中华根瘤菌(如苜蓿中华根瘤菌1021)。实验证明，利用含有EGFP编码基因的重组根瘤菌接种非豆科植物后，检测出来的植物体内的根瘤菌分别显著高于利用含有GFP编码基因的重组根瘤菌接种非豆科植物，表明，利用EGFP对根瘤菌进行标记，可以提高检测准确率，可以更准确的监测根瘤菌在水稻和小麦中的定殖过程。本发明所提供的监测苜蓿中华根瘤菌在非豆科植物体内定殖过程的方法，是采用egfp基因对苜蓿中华根瘤菌进行标记，并使用激光共聚焦显微镜观察标记的苜蓿中华根瘤菌在植物体内的定殖过程。本发明所提供的监测中华根瘤菌在非豆科植物中定殖过程的方法，采用了egfp基因的质粒pMP2444，这是一种广寄主质粒，组成型表达的lacZ启动子。egfp组成型稳定表达，无选择压力时也不会随传代而丢失。因此，能够稳定的在植物体内定殖，并持续生长。使用本方法来检测根瘤菌在植物体内的定殖过程，有利于深入研究根瘤菌对植物的促生机制、追踪根瘤菌作为内生菌与植物联合作用的生态学和细胞学定位，有利于阐明内生根瘤菌对植物的生物学意义，为确定根瘤菌作为具有广谱意义上的生物肥料应用奠定形态、生理和分子的基础。附图说明图1为激光共聚焦显微镜观察egfp基因标记的苜蓿中华根瘤菌1021在小麦体内的定殖情况。其中，A-B为egfp基因标记的苜蓿中华根瘤菌1021定殖于小麦幼苗根毛表面及内部，有的根瘤菌通过根毛进入根内；C-D为egfp基因标记的苜蓿中华根瘤菌1021定殖于小麦幼苗侧根裂隙和根表面；E-F为egfp基因标记的苜蓿中华根瘤菌1021定殖于根部的群体数量逐渐增加；G为叶鞘的横切面，显示egfp基因标记的苜蓿中华根瘤菌1021可以定殖于小麦叶鞘内；H为叶片的横切面，显示egfp基因标记的苜蓿中华根瘤菌1021可以定殖于小麦叶片内，并且有的egfp基因标记的苜蓿中华根瘤菌1021定殖在叶肉细胞内部。白色箭头所示为egfp基因标记的苜蓿中华根瘤菌1021。图2为小麦内分离再培养的1021-pMP-egfp的荧光检测及菌落PCR检测结果。其中，A为荧光显微镜观察显示小麦内分离再培养的1021-pMP-egfp发出的绿色荧光；B为小麦内分离再培养的1021-pMP-egfp的nifA和egfp基因的菌落PCR结果，泳道1和2分别1021-pMP-egfp和从小麦苗内分离出的1021-pMP-egfp的nifA基因片段的扩增；3和4分别为1021-pMP-egfp和从小麦苗内分离出的1021-pMP-egfp的egfp基因片段的扩增；M为DNA分子量Marker。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的苜蓿中华根瘤菌1021(Chietal.,CityUniversityofNewYork提供，参考文献ProteomicanalysisofriceseedlingsinfectedbySinorhizobiummeliloti1021,Proteomics2010,10,1861–1874.)公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。实施例1、根瘤菌在小麦中的定殖过程检测一、利用egfp基因标记苜蓿中华根瘤菌1021检测根瘤菌在小麦体内的定殖1、重组根瘤菌的制备将质粒pMP2444(BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心)的BamHI和XbaI识别序列间的DNA片段替换为序列1所示的egfp基因(egfp基因编码的EGFP蛋白质的序列如序列表中序列2所示)，得到重组载体，将该重组载体命名为pMP-egfp。将pMP-egfp导入苜蓿中华根瘤菌1021中，得到重组根瘤菌，将该重组根瘤菌命名为egfp基因标记的苜蓿中华根瘤菌1021(简称为1021-pMP-egfp)。2、重组根瘤菌接种小麦将步骤1的1021-pMP-egfp在培养基1(培养基1为向LB液体培养基中加入四环素和链霉素得到的四环素浓度为10μg/mL、链霉素浓度为50μg/mL的培养基)中于28℃恒温摇床培养，转速为180-200转/分钟，摇菌至OD600＝0.8时，离心机4000转/分钟离心后收集菌体，用PBS洗涤菌体，然后用PBS重新悬浮菌体，得到1021-pMP-egfp菌液，1021-pMP-egfp菌液中菌体的浓度为OD600＝0.6。将1021-pMP-egfp菌液于微波炉高温煮沸3次，得到1021-pMP-egfp死菌菌液。将小麦种子先用体积百分比为75％的乙醇水溶液处理10分钟，无菌水洗三次，再用质量百分比浓度为0.1％HgCl2水溶液处理10分钟，无菌水洗三次。将消毒后的小麦种子置于内含无菌滤纸和少量无菌水的灭菌培养皿中，28℃培养箱中催芽两天。待种子出芽后，挑选萌发一致(即根长与芽长基本相同)的出芽种子移栽至灭菌小瓶(高9cm，直径6cm，装有170cm3蛭石和100mL的1/4木村B营养液，上盖透明封口膜，120℃高压灭菌20分钟)中，每瓶6粒出芽种子。于光照培养箱中培养3天(请给出该时间)，培养条件：白天28℃，14h，夜晚25℃，10h，得到小麦幼苗。用移液枪吸取1021-pMP-egfp菌液，注射至小麦幼苗根际，每瓶1mL，得到重组根瘤菌处理的小麦(1021-pMP-egfp处理的小麦)；用移液枪吸取1021-pMP-egfp死菌菌液，注射至小麦幼苗根际，每瓶1mL，得到对照小麦(1021-pMP-egfp死菌处理的小麦)；将处理当天记为接种第1天。然后将重组根瘤菌处理的小麦与对照小麦于光照培养箱中进行培养，培养条件：白天28℃，14h，夜晚25℃，10h。在光照培养箱内培养过程中，根据蒸发情况补充1/4木村B营养液，保持幼苗正常生长。其中，1/4木村B营养液为将木村B营养液母液稀释四倍得到的液体，木村B营养液母液由溶剂与溶质组成，溶剂为水，pH＝6.0，1L木村B营养液母液的的溶质及其质量如下：大量元素：微量元素：铁盐：3、重组根瘤菌在小麦中定殖情况的检测3.1使用激光共聚焦显微镜检测在接种第1天、接种第2天、接种第5天和接种第8天，分别取重组根瘤菌处理的小麦和对照小麦的根、叶鞘和叶片，用无菌水冲洗干净，对植物组织进行徒手切片，然后使用激光共聚焦显微镜(ZEISSLSM510META)观察重组根瘤菌在小麦内的定殖情况，分别用568nm和488nm波长过滤器捕捉植物组织自发的红色荧光和根瘤菌发出的绿色荧光。对图片进行扫描构建Z轴，大约在横切面以下20μm左右。通过ImageJ软件(http://imagej.nih.gov/ij/)对图片进行后续处理。对于每个材料和时间点，分别选择4株植物用于分析。结果表明：重组根瘤菌接种小麦幼苗后，向其根际范围迁移，接种第2天便有大量的根瘤菌定殖于小麦幼苗根毛和侧根裂隙处；多次重复发现根瘤菌可以通过根毛进入幼苗根内，根瘤菌首先定殖在根毛顶端，然后进入根毛内部(图1中A，白色箭头所示)，并在根毛内迁移，最终进入根皮层细胞间隙(图1中B，白色箭头所示)；除通过根毛进入根外，根瘤菌还可以通过侧根裂隙进入根内，接种第2天根瘤菌定殖于幼苗根表面，有的定殖于侧根裂隙处进入根内(图1中C和D，白色箭头所示)；接种第5天激光共聚焦显微镜逐层扫描幼苗根部组织，显示根表面及内部的根瘤菌群体数量明显增多，并且有大量根瘤菌以内生菌的方式存在于幼苗根内，主要分布在细胞间隙(图1中E和F)；根瘤菌作为内生菌，在小麦幼苗体内的迁移速度非常快，接种第5天和接种第8天便有egfp标记的根瘤菌定殖在叶鞘和叶片内(图1中G和H)，并且有的进入了叶肉细胞内部(图1中H，白色箭头所示)。而1021-pMP-egfp死菌菌液接种后得到的对照小麦体内一直无绿色荧光出现，表明，1021-pMP-egfp死菌不可进入小麦体内。3.2PCR检测在接种第1天、接种第2天、接种第5天和接种第8天，分别取重组根瘤菌处理的小麦和对照小麦的根(幼苗根部)和地上组织(幼苗地上部分)，用蒸馏水冲洗干净小麦组织材料，吸水纸擦干后称重，于消毒液中消毒1分钟，消毒后用无菌水洗4次，置于无抗生素LB平板上1小时，取下小麦组织材料。然后将无抗生素LB平板于28℃下培养2天，发现无菌落出现，说明表面消毒彻底。然后均按照如下方式进行处理消毒后的重组根瘤菌处理的小麦和对照小麦的根和地上组织：用已灭菌的研钵分别将重组根瘤菌处理的小麦和对照小麦的根和地上组织研磨至匀浆后，用甘油体积百分比为20％的甘油的PBS溶液对匀浆液梯度稀释后，涂于已加入抗生素(四环素10μg/mL，链霉素50μg/mL)的LB平板上，28℃培养至菌落出现。实验设置三个重复。挑取单菌落后转移至加PBS的载玻片上，盖上盖玻片，用计算机辅助的荧光显微镜观察并收集egfp基因标记的苜蓿中华根瘤菌1021发出的绿色荧光信号。挑取单菌落，用菌落PCR方法分别检测每个根瘤菌菌落的egfp和nifA基因。PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃后延伸10min。反应结束后用1％的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定。PCR反应引物为：egfp：PCR产物长度为800bpegfp-up：5’-CGATCCCGCGAAATTAATACGAC-3’egfp-down：5’-TGTTAGCAGCCGGATCCTTTG-3’Sm1021nifA：PCR产物长度为300bpSm1021nifA-up：5’-CGCTGATGCGGTAGTAAAGGT-3’Sm1021nifA-down：5’-AGCCTTCTCGAATCAGAG-3’为测定egfp基因标记的苜蓿中华根瘤菌1021对小麦幼苗的定殖及其在小麦体内的迁移情况，在接种根瘤菌第1、2、5和8天，对小麦幼苗体内可分离培养的根瘤菌群体数量进行测定，随接种苜蓿中华根瘤菌1021天数的增加，每株小麦幼苗根部和地上部分组织内根瘤菌群体数量均呈增长趋势。小麦接种根瘤菌第1天，有的根瘤菌可以侵入幼苗根内，其平均数量可达到1.2×104个/株，而地上部分组织内根瘤菌数量为零，表明此时根瘤菌尚未迁移到地上组织内；小麦接种根瘤菌第2天，根内的根瘤菌平均数量增至3.6×104个/株，并且有的根瘤菌迁移到地上部分组织内，地上部分根瘤菌平均数量为1.5×103个/株；小麦接种根瘤菌第5天，根部和地上部分组织内根瘤菌平均数量分别增至1.8×106个/株和9.6×104个/株；小麦接种根瘤菌第8天，根部和地上部分组织内根瘤菌平均数量分别增至9.2×106个/株和6×105个/株。实施例结果表明，可以用平板分离方法，从表面消毒的小麦组织中分离出egfp基因标记的苜蓿中华根瘤菌1021，并且可以在固体培养基上进行再培养。随机挑取分离后重培养的菌落，用荧光显微镜观察可以检测到绿色荧光(图2中A)。用菌落PCR方法对苜蓿中华根瘤菌1021的nifA和egfp基因进行扩增，可得到其相应条带(图2中B)。这些结果表明从小麦组织中分离得到的根瘤菌为处理小麦的egfp基因标记的根瘤菌。二、利用gfp基因标记苜蓿中华根瘤菌1021检测根瘤菌在小麦体内的定殖1、重组根瘤菌的制备将质粒pMP2444的BamHI和XbaI识别序列间的DNA片段替换为序列3所示的gfp基因，得到重组载体，将该重组载体命名为pMP-gfp。将pMP-gfp导入苜蓿中华根瘤菌1021中，得到重组根瘤菌，将该重组根瘤菌命名为gfp基因标记的苜蓿中华根瘤菌1021(简称为1021-pMP-gfp)。2、重组根瘤菌接种小麦按照步骤一中2的方法，将1021-pMP-egfp替换为上述1021-pMP-gfp，得到1021-pMP-gfp处理的小麦与1021-pMP-gfp死菌处理的小麦。3、重组根瘤菌在小麦中定殖情况的检测按照步骤一中步骤3中3.2的PCR检测方法，检测不同时间小麦体内根瘤菌的量，结果显示：小麦接种1021-pMP-gfp第1天，根部菌的平均数量为0.3×102个/株，地上部分组织内根瘤菌数量为0个/株；小麦接种1021-pMP-gfp第2天，根部菌的平均数量为1.3×102个/株，地上部分组织内根瘤菌数量为0.5×102个/株；小麦接种1021-pMP-gfp第5天，根部菌的平均数量为0.5×103个/株，地上部分组织内根瘤菌数量为1.6×102个/株；小麦接种1021-pMP-gfp第8天，根部菌的平均数量为1.02×103个/株，地上部分组织内根瘤菌数量为6×102个/株。小麦接种1021-pMP-egfp第1天、第2天、第5天和第8天，利用本发明中的方法检测出的根部根瘤菌的数量是利用gfp基因检测出的根部根瘤菌的数量的400、277、3600和9020倍；利用本发明中的方法检测出的地上部分根瘤菌的数量是利用gfp基因检测出的地上部分根瘤菌的数量的0、30、600和10000倍。实施例2、利用egfp基因标记苜蓿中华根瘤菌1021检测根瘤菌在水稻体内的定殖一、利用egfp基因标记苜蓿中华根瘤菌1021检测根瘤菌在水稻体内的定殖1、重组根瘤菌的制备同实施例1步骤一步骤1。2、重组根瘤菌接种水稻按照实施例1步骤一步骤2的方法，将小麦种子替换为去壳后的水稻种子，其他步骤均不变，得到1021-pMP-egfp处理的水稻和1021-pMP-egfp死菌处理的水稻。3、重组根瘤菌在水稻中定殖情况的检测按照实施例1中步骤一步骤3中3.2的PCR检测方法，检测不同时间水稻体内根瘤菌的量，结果显示：水稻接种1021-pMP-egfp第1天，根部菌的平均数量为1.3×104个/株，地上部分组织内根瘤菌数量为0个/株；水稻接种1021-pMP-egfp第2天，根部菌的平均数量为1.8×104个/株，地上部分组织内根瘤菌数量为1.25×103个/株；水稻接种1021-pMP-egfp第5天，根部菌的平均数量为1.63×106个/株，地上部分组织内根瘤菌数量为9.25×104个/株；水稻接种1021-pMP-egfp第8天，根部菌的平均数量为9.42×106个/株，地上部分组织内根瘤菌数量为7×105个/株。二、利用gfp基因标记苜蓿中华根瘤菌1021检测根瘤菌在水稻体内的定殖1、重组根瘤菌的制备同实施例1步骤二步骤1。2、重组根瘤菌接种水稻按照实施例1中步骤一步骤2的方法，将1021-pMP-egfp替换为上述1021-pMP-gfp，并将小麦种子替换为去壳后的水稻种子，得到1021-pMP-gfp处理的水稻与1021-pMP-gfp死菌处理的水稻。3、重组根瘤菌在水稻中定殖情况的检测按照实施例1中步骤一步骤3中3.2的PCR检测方法，检测不同时间水稻体内根瘤菌的量，结果显示：水稻接种1021-pMP-gfp第1天，根部菌的平均数量为5×102个/株，地上部分组织内根瘤菌数量为0个/株；水稻接种1021-pMP-gfp第2天，根部菌的平均数量为2×103个/株，地上部分组织内根瘤菌数量为2.5×102个/株；水稻接种1021-pMP-gfp第5天，根部菌的平均数量为1×104个/株，地上部分组织内根瘤菌数量为4×103个/株；水稻接种1021-pMP-gfp第8天，根部菌的平均数量为1.2×104个/株，地上部分组织内根瘤菌数量为6×103个/株。水稻接种1021-pMP-egfp第1天、第2天、第5天和第8天，利用本发明中的方法检测出的根部根瘤菌的数量是利用现有技术方法检测出的根部根瘤菌的数量的260、90、163和78.5倍；利用本发明中的方法检测出的地上部分根瘤菌的数量是利用现有技术方法检测出的地上部分根瘤菌的数量的0、5、23和117倍。实验证明，利用含有EGFP编码基因的重组根瘤菌接种小麦和水稻后，检测出来的植物体内的根瘤菌分别显著高于利用含有GFP编码基因的重组根瘤菌接种小麦和水稻，表明，利用EGFP对根瘤菌进行标记，可以提高检测准确率，可以更准确的监测根瘤菌在水稻和小麦中的定殖过程。<110>中国科学院植物研究所<120>监测根瘤菌在非豆科植物中定殖过程的方法<160>3<170>PatentInversion3.5<210>1<211>793<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>1gtatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctgg60acggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacct120acggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggccca180ccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatga240agcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatct300tcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccc360tggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggc420acaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaaga480acggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcg540ccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaacc600actacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatgg660tcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagg720agggcccgcggttcgaaggtaagcctatccctaaccctctcctcggtctcgattctacgc780gtaccggttagta793<210>2<211>262<212>PRT<213>人工序列<220><223><400>2MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeu151015ValGluLeuAspGlyAspValAsnGlyHisLysPheSerValSerGly202530GluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIle354045CysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThr505560LeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLys65707580GlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGlu859095ArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGlu100105110ValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGly115120125IleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyr130135140AsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleMetAlaAspLysGlnLysAsn145150155160GlyIleLysValAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySer165170175ValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGly180185190ProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeu195200205SerLysAspProAsnGluLysArgAspHisMetValLeuLeuGluPhe210215220ValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLysGlu225230235240GlyProArgPheGluGlyLysProIleProAsnProLeuLeuGlyLeu245250255AspSerThrArgThrGly260<210>3<211>721<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>3aataatgtcgaagggcgaggagctgttcaccggcgtcgtcccgatcctggtcgagctgga60cggtgacgtcaacggccacaagttctccgtctccggcgagggtgagggcgacgccaccta120cggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggtaagctgccggtcccgtggccgac180cctggtcaccaccctgacctacggcgtccagtgcttctcccgctacccggaccacatgaa240gcgccacgacttcttcaagtccgccatgccggagggttacgtccaggagcgcaccatctc300cttcaaggacgacggtaactacaagacgcgtgccgaggtcaagttcgagggcgacaccct360ggtcaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggtaacatcctgggcca420caagctggagtacaactacaactcccacaacgtctacatcaccgcggacaagcagaagaa480cggcatcaaggccaacttcaagacccgccacaacatcgaggacggtggcgtccagctagc540cgaccactaccagcagaacaccccgatcggcgacggcccggtcctgctgccggacaacca600ctacctgtccacccagtccgccctgtccaaggacccgaacgagaagcgcgaccacatggt660cctgctggagttcgtcaccgccgccggcatcacccacggcatggacgagctgtacaagta720g721当前第1页1 2 3