本发明涉及一种提高枯草芽孢杆菌蛋白表达量的DNA，属于枯草芽孢杆菌蛋白高效表达和基因工程领域。
背景技术：
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，作为基因工程优良的宿主菌株存在以下优点：安全性高，其产品被FDA认证为“generally regarded as safe”(GRAS)安全级别；发酵周期短，生产成本低；在表达和分泌活性蛋白方面明显优于大肠杆菌。实践证明，它能够表达多种可溶的且具有生物活性的蛋白质。
但是枯草芽孢杆菌在代谢工程改造中仍存在目的基因表达量不平衡，质粒不稳定等问题。迄今大多数研究都集中在优化启动子，优化RBS序列，优化发酵条件等方面，但是在代谢工程改造中需要多种方式提高目的基因表达量，因此，构建新型的提高目的蛋白表达量的方法显得尤为重要。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种提高枯草芽孢杆菌蛋白表达量方法，是将具有高表达量的蛋白的N端序列连接在表达量低的蛋白的N端，再对连接后的表达量低的蛋白进行表达。
在本发明的一种实施方式中，所述具有高表达量的蛋白的N端序列如SEQ ID NO.1～6所示。
在本发明的一种实施方式中，所述蛋白包括但不限于酶。
在本发明的一种实施方式中，所述蛋白来源于枯草芽孢杆菌。
在本发明的一种实施方式中，以pP43NMK为表达载体，将具有高表达量的蛋白的N端序列连接在表达量低的蛋白的N端，表达在枯草芽孢杆菌中。
在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌为Bacillus subtilis 168。
在本发明的一种实施方式中，所述pP43NMK已公开于Zhang XZ,Cui ZL,Hong Q,Li SP.High-level expression and secretion of methyl parathion hydrolase in Bacillus subtilis WB800.Applied and environmental microbiology.2005；71(7):4101-3中。
本发明的第二个目的是提供一种能够提高枯草芽孢杆菌蛋白表达量的DNA，与蛋白的N端连接后可提高目的蛋白表达量。
在本发明的一种实施方式中，所述DNA含有SEQ ID NO.1～6任一所示的序列。
本发明的第三个目的是提供一种蛋白表达量提高的重组枯草芽孢杆菌，表达含有权利要求7所述DNA的基因，或含有携带权利要求7所述DNA的载体。
本发明还提供一种应用所述方法提高绿色荧光蛋白(GFP)表达量的方法，是将冷休克蛋白CspD的N端编码前15个氨基酸的核苷酸序列添加到目的蛋白GFP核苷酸序列前端；所述CspD的N端编码前15个氨基酸的核苷酸序列克隆并添加至的绿色荧光蛋白(GFP)的N端，构建到重组表达质粒p43NMK中，再转化到枯草芽孢杆菌中获得重组枯草芽孢杆菌。
在本发明的一种实施方式中，所述方法将所述重组枯草芽孢杆菌以10％的接种量接种至发酵培养基，于35～37℃发酵26～24小时。
在本发明的一种实施方式中，所述方法是将37℃、200rpm下培养10h的重组枯草芽孢杆菌接种至发酵培养基，于37℃、200rpm条件下发酵20小时。
本发明还提供上述任一方法在生产含有蛋白的产品中的应用。
有益效果：以荧光强度表征蛋白表达量，按照本发明的方法，以所添加N端序列为冷休克蛋白CspD的N端编码前15个氨基酸的核苷酸序列为例，发酵时间为10h小时左右，能够使平均荧光强度从约18156提高至72904；发酵时间为20小时左右，能够使荧光强度从约36708提高至83150。分别提高至对照的4.02倍、2.27倍，其余序列对于蛋白表达量均有1～3.78倍的提高。
具体实施方式
重组枯草芽孢杆菌种子培养及发酵：
培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10。
培养条件：将37℃、200rpm下培养10h的种子以10％的接种量转入发酵培养基，于37℃、200rpm条件下培养20h。
绿色荧光蛋白表达量的测定方法：在96孔板中每孔加入200μL稀释后的发酵液，使用Cytation3细胞成像微孔板检测仪(美国伯腾仪器有限公司)，激发波长：488nm，发射波长：523nm，增益：60。
SEQ ID NO.1为枯草芽孢杆菌冷休克蛋白CspD N端编码前15个氨基酸的核苷酸序列；
SEQ ID NO.2为枯草芽孢杆菌鞭毛蛋白(Hag基因)N端编码前15个氨基酸的核苷酸序列；
SEQ ID NO.3为枯草芽孢杆菌延伸因子(TufA基因)N端，编码前15个氨基酸的核苷酸序列；
SEQ ID NO.4为枯草芽孢杆菌冷休克蛋白CspB N端，编码前15个氨基酸的核苷酸序列；
SEQ ID NO.5为枯草芽孢杆菌延伸因子(TufA基因)N端，编码前7个氨基酸的核苷酸序列；
SEQ ID NO.6为枯草芽孢杆菌YukE蛋白(PdhD基因)N端，编码前15个氨基酸的核苷酸序列；
SEQ ID NO.7为编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因序列。
实施例1重组质粒的构建
重组质粒的组成是在Pp43NMK质粒的P43启动子之后按顺序依次插入编码N端的序列绿色荧光蛋白(GFP)基因。为了将编码N端的序列引入P43启动子之后，设计引物
rh_CspD-0.75k_p43NMK-GFP_F：
5’-TGGTTCAACAACGAAAAAGGATTCATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCA-3’，
rh_CspD-0.75k_p43NMK-GFP_R：
5’-TACGCCAAGCTTTCATCACTATTTGTATAGTTCATCCATGCCATGTGTAATCCCAGCAG-3’,以含有绿色荧光蛋白(GFP，GenBank：AF324408.1)基因的大肠杆菌为模板，通过菌落PCR，得到绿色荧光蛋白片段；设计引物
fx_CspD-6.7k_p43NMK-GFP_F：
5’-AGTGATGAAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTT-3’，
fx_CspD-6.7k_p43NMK-GFP_R：
5’-CCTTTTTCGTTGTTGAACCATTTTACTTTACCGTTTTGCATGTGTACATTCCTCTCTTACCTATAATGGTACCGCTATCACTT-3’,
以质粒pP43NMK为模板，通过PCR反向扩增得到质粒片段；最后通过Gibson Assembly Clonging Kit(New England Biolabs)构建重组质粒，测序验证，确认重组pP43NMK-TufAN-GFP质粒构建成功。
实施例2重组pP43NMK-CspDN-GFP质粒枯草芽孢杆菌的构建
将构建好的pP43NMK-CspDN-GFP质粒转化枯草芽孢杆菌168野生型菌株。采用yz_zong-p43NMK_F：5’-TTCTTGCTGAGTCTGGCTTTCG-3’及yz_zong-p43NMK_R：5’-CGGCTCGTATGTTGTGTGGAAT-3’引物挑选转化子进行菌落PCR，出现1.8kb条带，验证重组枯草芽孢杆菌构建成功。
实施例3添加N端序列对绿色荧光蛋白在工程菌中表达的影响
将37℃、200rpm下培养10h的种子以10％的接种量转入发酵培养基，于37℃、200rpm条件下培养20h。相同条件下，若仅以pP43NMK表达，不添加高表达量的N端序列，最终发酵液中测得荧光强度10小时约为18160，20小时约为36700；而添加高表达N端序列之后，测得荧光强度10小时约为52480，20小时约为74200，分别提高至对照的2.9倍、2倍。实现了绿色荧光蛋白GFP在重组枯草芽孢杆菌胞外的高表达。
实施例4
按照实施例1～3相同的策略，分别将SEQ ID NO.2～6的核苷酸序列添加到目的蛋白GFP核酸序列前端，验证对蛋白表达效果的影响。结果如表1所示。
表1添加6种不同N端序列对蛋白表达提高情况
对照例1构建无此特定N端序列对照组
在Pp43NMK质粒的P43启动子之后直接插入绿色荧光蛋白(GFP)基因。设计引物
rh_ctr-0.75k_p43NMK-GFP_F：
5’-ACACATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCA-3’，
rh_ctr-0.75k_p43NMK-GFP_R：
5’-TACGCCAAGCTTTCATCACTATTTGTATAGTTCATCCATGCCATGTGTAATCCCAGCAG-3’,
以含有绿色荧光蛋白(GFP，GenBank：AF324408.1)基因的大肠杆菌为模板，通过菌落PCR，得到绿色荧光蛋白片段；设计引物
fx_ctr-6.7k_p43NMK-GFP_F：
5’-AGTGATGAAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTT-3’，
fx_ctr-6.7k_p43NMK-GFP_R：
5’-CTTCTCCTTTACTCATGTGTACATTCCTCTCTTACCTATAATGGTACCGCTATCACTT-3’,
以质粒pP43NMK为模板，通过PCR反向扩增得到质粒片段；最后通过Gibson Assembly Clonging Kit(New England Biolabs)构建重组质粒，测序验证，确认重组pP43NMK-CspDN-GFP质粒构建成功后，转化枯草芽孢杆菌168野生型。菌落PCR验证质粒转化成功。
将37℃、200rpm下培养10h的种子以10％的接种量转入发酵培养基，于37℃、200rpm条件下培养20h。最终20h发酵液中测得荧光强度是36700，仅为实施例3表达量的一半。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种提高枯草芽孢杆菌蛋白表达量的DNA
<160> 17
<170> PatentIn version 3.3
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<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
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atgcaaaacg gtaaagtaaa atggttcaac aacgaaaaag gattc 45
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgagaatta accacaatat tgcagcgctt aacacactga accgt 45
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<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
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atggctaaag aaaaattcga c 21
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<213> 人工序列
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atggtagtag gagatttccc tattgaaaca gatactcttg taatt 45
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<212> DNA
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gatgttaatg ggcacaaatt ttctgtcagt ggagagggtg aaggtgatgc aacatacgga 120
aaacttaccc ttaaatttat ttgcactact ggaaaactac ctgttccatg gccaacactt 180
gtcactactt tctcttatgg tgttcaatgc ttttcaagat acccagatca tatgaaacgg 240
catgactttt tcaagagtgc catgcccgaa ggttatgtac aggaaagaac tatatttttc 300
aaagatgacg ggaactacaa gacacgtgct gaagtcaagt ttgaaggtga tacccttgtt 360
aatagaatcg agttaaaagg tattgatttt aaagaagatg gaaacattct tggacacaaa 420
ttggaataca actataactc acacaatgta tacatcatgg cagacaaaca aaagaatgga 480
atcaaagtta acttcaaaat tagacacaac attgaagatg gaagcgttca actagcagac 540
cattatcaac aaaatactcc aattggcgat ggccctgtcc ttttaccaga caaccattac 600
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cca 63
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<213> 人工序列
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ctataatggt accgctatca ctt 83
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<213> 人工序列
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