本发明属于植物细胞工程技术领域，具体地说它是一种发根农杆菌转化三七细胞的制备方法，并生产有效的次生代谢产物的方法。
背景技术：
三七（(Panaxnotoginseng(Burk)F．H．Chen）为五加科人参属，多年生草本双子叶植物，又有金不换、田七、参三七等之称，是我国特有的名贵药用植物。三七味苦微甘、性平，主要是以块根和根茎入药，主要的药用成分有三七总皂苷（PNS）、三七素、黄铜、挥发油、氨基酸、糖类及各种微量元素等。经药理研究发现，三七的功效有活血化瘀、消肿定痛、抗肿瘤、滋补强壮、降血糖、抗血栓等，主用于跌打损伤、咳血、吐血、便血等。三七是众多中成药的主要成分之一，例如云南白药、心痛宁片、复方三七胶囊等。因此，三七具有非常大的经济价值和社会效益。
近年来三七的药用价值不断为人们所知，因此其药用需求量不断增加，其野生资源连年开采过度、私采严重。由于森林砍伐、植被石漠化、土层流失等原因，三七的生态环境也受到严重破坏。再加上自然气候影响及三七本身自然繁殖力差等诸多因素，造成三七野生资源数量急剧下降。
由于三七药材主要靠采收野生资源，收获周期较长，受病虫害、气候等外部因素影响大，造成供应量不易控制等实际问题。虽然三七的GAP栽培种植面积也在不断扩大，但是在栽培过程中的土壤环境恶化及连作障碍危害也日益突出。目前, 三七连作区面积高达总种植面积的15% , 每年由此造成的损失在上千万元。连作障碍已成为影响道地产区文山州三七产业可持续发展的重要制约因素。因此，寻求新的替代品或新技术以满足市场需求和解决物种保护问题迫在眉睫。
综合考虑，采用生物技术方法是解决这一问题最为有效的途径。一方面可以缓解植物资源的匮乏，保护珍贵的野生植物资源，避免掠夺性开发；另一方面通过规模化的细胞培养技术可以定向调节细胞的次生代谢产物，使植物细胞定向合成有效的物质，以提高、调控中药材有效成分含量，提高它的药用价值和疗效，降低中药材生产的经济成本。尽管如此，通过细胞培养等手段实现商业化生产的植物种类有限，主要原因是遗传和药用成分生物合成的稳定性差以及单位时间内生物量小等，因此，筛选优质高产细胞株是解决上述瓶颈问题的关键技术环节。
毛状根是利用发根农杆菌侵染植物细胞后产生的特殊的不定根，具有遗传稳定、激素自养、生长速度快以及次级代谢强等优点。毛状根作为一种转基因器官，一种新的药用原料，日益受到国内外研究者的关注。试验表明，利用毛状根作为外植体而诱导的愈伤组织，也具有毛状根的生长速度快、遗传稳定等优点，与普通三七愈伤组织相比，固体培养条件下较短时间内能够获得较高的细胞产量，同时皂苷含量也较高。毛状根在悬浮培养体系下具有成团性的特点，随着培养时间的延长，内部的毛状根组织由于没有足够的氧供给和养分循环供应而逐渐衰老甚至褐化死亡，导致生长速度下降从而影响收获产量。因此，利用毛状根的愈伤组织建立悬浮细胞培养体系并优化培养条件，可以解决困扰毛状根放大培养过程中的成团性问题。
技术实现要素：
本发明的目的是公开一种发根农杆菌转化三七细胞的制备方法。
本发明采取的技术方案如下：
1. 选择实验室已有的生长良好的固体培养或液体培养的三七毛状根作为外植体诱导愈伤组织，具体操作如下：将毛状根剪切成小段，接种于添加有1.0 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L 6-BA 的MS固体培养基上，置于25±1℃的暗室培养3-4周左右即可诱导出愈伤组织；然后接入黄色颗粒状的胚性愈伤组织，在 25±1℃，12 h/d 光照条件下培养 40 d。
2. 将诱导出的愈伤组织与外植体分离，将分离出的愈伤组织接种于添加有1.0 mg/L 2,4-D +0.2 mg/L 6-BA + 0.3mg/L KT的MS固体培养基上进行继代培养（25±1℃暗培养），25d左右在此培养基上继代一次。新诱导出的愈伤组织色泽暗淡、柔软、水分较大且生长速度较慢，需要经过5次以上的继代培养，愈伤组织逐渐呈现出质地疏松、易分散、不分泌黏液、白色的颗粒状，大约经过10次左右的继代培养，此时的愈伤组织生长速度较快且非常稳定，同时适于做细胞悬浮培养的材料。在无菌操作台上，用镊子将预培养后的三七愈伤组织和叶片、茎段转移到制备好的发根农杆菌的菌液中侵染 30 min，130 r/min、28 ℃，使预培养的外植体与发根农杆菌之间能够充分的接触。侵染结束后，用无菌滤纸将取出的愈伤组织和叶片表面的菌液吸干，然后再转接到含有 0、20、40、60、80、100 mg/L 的乙酰丁香酮的 MS 固体培养基中，25±1 ℃，暗培养条件下进行共培养 2 d。
3. 在无菌操作台上，将在共培养过程中形成菌斑的三七愈伤组织和叶片、茎段用无菌水清洗 2-3 遍，然后再用无菌滤纸吸干三七的愈伤组织和叶片、茎段表面的多余水分后将其转接到含有 500 mg/L 头孢噻肟钠的 MS 固体培养基上进行除菌培养，每隔一周就要进行继代培养一次，并逐渐的降低除菌抗生素的浓度直至三七愈伤组织和叶片、茎段周围的菌斑完全消失。
4. 当诱导出来的毛状根长到 2-3 cm 左右时，将毛状根剪下，并转移到含有 200 mg/L卡那霉素的 MS 固体培养基上，25±1 ℃，12 h/d 光照条件下进行培养，培养过程中要筛选出具有卡那霉素抗性的生长速度较快、分支较多的即为三七毛状根。
悬浮细胞培养体系的建立：
本发明首先选择150ml三角瓶做摇瓶试验，每瓶装液量为50ml，均置于25±1℃、110±5r/min摇床上暗培养，培养周期为20d。
选择 MS、1/2MS、B5、1/2B5和N6 5种培养基做基本培养基试验，通过实验确定1/2MS液体培养基为最佳基本培养基。
在1/2MS为最佳基本培养基的基础上，选择2,4-D、6-BA、NAA、KT四种激素进行正交试验，实验结果表明，毛状根愈伤组织悬浮培养的最佳激素组合为1.0mg/L 2,4-D+0.2mg/L 6-BA+0.6mg/L NAA+0.2mg/L KT。
以1/2MS +1.0mg/L 2,4-D+0.2mg/L 6-BA+0.6mg/L NAA+0.2mg/L KT为培养基进行接种量试验，最终确定最佳接种量为4-6%（w/v，g（FW）/ml）。
综上所述，三七悬浮细胞培养的最优培养基为1/2MS +1.0mg/L 2,4-D+0.2mg/L 6-BA+0.8mg/L NAA+0.2mg/L KT，接种量为4-6%（w/v，g（FW）/ml）。三七毛状根悬浮细胞培养体系的建立包括4个步骤：毛状根的诱导与固体培养，毛状根的液体培养，毛状根的愈伤组织诱导与扩繁，悬浮细胞摇瓶培养和放大培养。悬浮培养的最初几代细胞颗粒通常较大，可以通过无菌条件下过筛等方法将大颗粒除去，经过5-8次左右的继代培养，悬浮培养体系逐渐趋于稳定。
三七粗总皂苷的检测方法:
将细胞培养收获物烘干至恒重后研磨成粉末并过筛用于皂苷含量的测定，选择齐墩果酸标准品为对照品，采用香草醛-高氯酸比色法测定三七总皂苷含量，具体方法参见李景斌等著“金铁锁毛状根诱导及培养体系的建立”《中国中药杂志》2011年，36(5)：547。
毛状根愈伤组织细胞的扩大培养：在获得毛状根愈伤组织后，可以通过固体培养或是液体培养的方法进行不断的扩大培养，以获得大量的细胞产品。其中固体培养可以通过不断的扩大培养得到最终的细胞产品，完成大量细胞的生产；也可以在固体培养得到一定量的细胞后，转入生物反应器完成大量细胞的生产。
具体实施方式
实施例1：
(1)在无菌的条件下，将培养出的颗粒状三七愈伤组织划出伤口放置在不含任何激素的MS 固体培养基中。同样的，将三七的再生植株的叶片和茎段剪下并留下伤口，放入不含任何激素的 MS 固体培养基中。然后在 25±3℃，暗培养条件中，预培养 2 d。预培养后的愈伤组织和三七的叶片和茎段都将用于菌液侵染，获得三七愈伤组织。
(2) 在无菌操作台上，用镊子将预培养后的三七愈伤组织和叶片、茎段转移到制备好的发根农杆菌的菌液中侵染 30 min，130 r/min、28 ℃，使预培养的外植体与发根农杆菌之间能够充分的接触。侵染结束后，用无菌滤纸将取出的愈伤组织和叶片表面的菌液吸干，然后再转接到含有 0、20、40、60、80、100 mg/L 的乙酰丁香酮的 MS 固体培养基中，25±1 ℃，暗培养条件下进行共培养 2 d。
(3)挑取1菌环单菌落接种于50mL液体YEB培养基中，25℃±3振荡培养12h，OD值为0.3～1.2.取1ml菌液置于100mlYEB液体培养基中振荡培养，培养6h。OD值为0.3～0.9.3500 rpm下离心5～15min收集菌体。
(4)将(3)收集的菌体置于MS液体培养基中并混匀。
(5)用(4)混匀后得到的菌液浸染三七愈伤组织10～30min，取出后用无菌纸吸取多余的菌液，将浸染的三七愈伤组织接入到含有100umol/L乙酰丁香酮、0.9%琼脂的MS固体培养基中培养1～3d。
(6) 将(5)共培养后的愈伤组织接入含有500mg/L 头孢噻肟钠的 MS 固体培养基上进行除菌培养，每隔一周就要进行继代培养一次，并逐渐的降低除菌抗生素的浓度直至三七愈伤组织和叶片、茎段周围的菌斑完全消失。
(7) 用无激素1/2MS液体培养基作为扩增培养基，将抑菌处理后1g的诱导出来的发状根放入30mL的扩增培养基中，黑暗悬浮振荡培养，振荡摇床转速为110～120r·min-1。
(8) 当诱导出来的毛状根长到 2-3 cm 左右时，将毛状根剪下，并转移到含有 200 mg/L卡那霉素的 MS 固体培养基上，25±1 ℃，12 h/d 光照条件下进行培养，培养过程中要筛选出具有卡那霉素抗性的生长速度较快、分支较多的即为三七毛状根。
实施例2：
(1)在无菌的条件下，将培养出的颗粒状三七愈伤组织划出伤口放置在不含任何激素的MS 固体培养基中。同样的，将三七的再生植株的叶片和茎段剪下并留下伤口，放入不含任何激素的 MS 固体培养基中。然后在 25±1℃，暗培养条件中，预培养 2d。预培养后的愈伤组织和三七的叶片和茎段都将用于菌液侵染，获得三七愈伤组织。
(2) 在无菌操作台上，用镊子将预培养后的三七愈伤组织和叶片、茎段转移到制备好的发根农杆菌的菌液中侵染 30 min，130 r/min、28 ℃，使预培养的外植体与发根农杆菌之间能够充分的接触。侵染结束后，用无菌滤纸将取出的愈伤组织和叶片表面的菌液吸干，然后再转接到含有 0、20、40、60、80、100 mg/L 的乙酰丁香酮的 MS 固体培养基中，25±1 ℃，暗培养条件下进行共培养 2 d。
(3)挑取1菌环单菌落接种于50mL液体YEB培养基中，25℃±3振荡培养12h，OD值为0.3～1.2.取1ml菌液置于100mlYEB液体培养基中振荡培养，培养6h。OD值为0.3～0.9.3500 rpm下离心5～15min收集菌体。
(4)将(3)收集的菌体置于MS液体培养基中并混匀。
(5)用(4)混匀后得到的菌液浸染三七愈伤组织10～30min，取出后用无菌纸吸取多余的菌液，将浸染的三七愈伤组织接入到含有100umol/L乙酰丁香酮、0.9%琼脂的MS固体培养基中培养1～3d。
(6)将(5)共培养后的愈伤组织接入含有500mg/L 头孢噻肟钠的 MS 固体培养基上进行除菌培养，每隔一周就要进行继代培养一次，并逐渐的降低除菌抗生素的浓度直至三七愈伤组织和叶片、茎段周围的菌斑完全消失。
(7)用无激素1/2MS液体培养基作为扩增培养基，将抑菌处理后1g的诱导出来的发状根放入30mL的扩增培养基中，黑暗悬浮振荡培养，振荡摇床转速为110～120r·min-1。
(8) 当诱导出来的毛状根长到 2-3 cm 左右时，将毛状根剪下，并转移到含有 200 mg/L卡那霉素的 MS 固体培养基上，24±1 ℃，10 h/d 光照条件下进行培养，培养过程中要筛选出具有卡那霉素抗性的生长速度较快、分支较多的即为三七毛状根。
实施例4：
（1）. 选择实验室已有的生长良好的固体培养或液体培养的三七毛状根作为外植体诱导愈伤组织，具体操作如下：将毛状根剪切成小段，接种于添加有1.0 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L 6-BA 的MS固体培养基上，置于25±1℃的暗室培养3-4周左右即可诱导出愈伤组织；然后接入黄色颗粒状的胚性愈伤组织，在 25±1℃，12 h/d 光照条件下培养 40 d；
（2）. 将诱导出的愈伤组织与外植体分离，将分离出的愈伤组织接种于添加有1.0 mg/L 2,4-D +0.2 mg/L 6-BA + 0.3mg/L KT的MS固体培养基上进行继代培养，在25±1℃暗培养；25d左右在此培养基上继代一次，新诱导出的愈伤组织色泽暗淡、柔软、水分较大且生长速度较慢，需要经过5次以上的继代培养，愈伤组织逐渐呈现出质地疏松、易分散、不分泌黏液、白色的颗粒状，大约经过10次左右的继代培养，此时的愈伤组织生长速度较快且非常稳定，同时适于做细胞悬浮培养的材料。在无菌操作台上，用镊子将预培养后的三七愈伤组织和叶片、茎段转移到制备好的发根农杆菌的菌液中侵染 30 min，130 r/min、28 ℃，使预培养的外植体与发根农杆菌之间能够充分的接触。侵染结束后，用无菌滤纸将取出的愈伤组织和叶片表面的菌液吸干，然后再转接到含有 0、20、40、60、80、100 mg/L 的乙酰丁香酮的 MS 固体培养基中，25±1 ℃，暗培养条件下进行共培养 2 d；
（3）. 在无菌操作台上，将在共培养过程中形成菌斑的三七愈伤组织和叶片、茎段用无菌水清洗 2-3 遍，然后再用无菌滤纸吸干三七的愈伤组织和叶片、茎段表面的多余水分后将其转接到含有 500 mg/L 头孢噻肟钠的 MS 固体培养基上进行除菌培养，每隔一周就要进行继代培养一次，并逐渐的降低除菌抗生素的浓度直至三七愈伤组织和叶片、茎段周围的菌斑完全消失；
（4）. 当诱导出来的毛状根长到 2-3 cm 左右时，将毛状根剪下，并转移到含有 200 mg/L卡那霉素的 MS 固体培养基上，25±1 ℃，12 h/d 光照条件下进行培养，培养过程中要筛选出具有卡那霉素抗性的生长速度较快、分支较多的即为三七毛状根。悬浮细胞培养体系的建立：
本发明首先选择150ml三角瓶做摇瓶试验，每瓶装液量为50ml，均置于25±1℃、110±5r/min摇床上暗培养，培养周期为20d。
选择 MS、1/2MS、B5、1/2B5和N6 5种培养基做基本培养基试验，通过实验确定1/2MS液体培养基为最佳基本培养基。
在1/2MS为最佳基本培养基的基础上，选择2,4-D、6-BA、NAA、KT四种激素进行正交试验，实验结果表明，毛状根愈伤组织悬浮培养的最佳激素组合为1.0mg/L 2,4-D+0.2mg/L 6-BA+0.6mg/L NAA+0.2mg/L KT。
以1/2MS +1.0mg/L 2,4-D+0.2mg/L 6-BA+0.6mg/L NAA+0.2mg/L KT为培养基进行接种量试验，最终确定最佳接种量为4-6%（w/v，g（FW）/ml）。
综上所述，三七悬浮细胞培养的最优培养基为1/2MS +1.0mg/L 2,4-D+0.2mg/L 6-BA+0.8mg/L NAA+0.2mg/L KT，接种量为4-6%（w/v，g（FW）/ml）。三七毛状根悬浮细胞培养体系的建立包括4个步骤：毛状根的诱导与固体培养，毛状根的液体培养，毛状根的愈伤组织诱导与扩繁，悬浮细胞摇瓶培养和放大培养。悬浮培养的最初几代细胞颗粒通常较大，可以通过无菌条件下过筛等方法将大颗粒除去，经过5-8次左右的继代培养，悬浮培养体系逐渐趋于稳定。
对于本领域的普通技术人员而言，具体实施例只是对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种非实质性的改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。